陳澤龍　余懷新　陳淑娟　劉君英　劉文娟　鄧建新　閻德文

[摘要] 目的 研究虎杖苷（polydatin，PD）抑制高糖引起心肌細(xì)胞局部鈣信號(hào)紊亂的機(jī)制，探討其對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)作用。 方法 分離1～3 d SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、高糖組、虎杖苷組和高糖+虎杖苷組。培養(yǎng)48 h后采用激光共聚焦顯微成像技術(shù)檢測(cè)局部鈣釋放單位鈣火花發(fā)放頻率及其形態(tài)；利用Western blot方法檢測(cè)受磷蛋白PLB和肌漿網(wǎng)SERCA 2a蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 高糖組心肌細(xì)胞鈣自發(fā)鈣火花發(fā)放水平顯著增加（P<0.01），且略微增加鈣火花時(shí)程。在虎杖苷組中，高糖引起的高頻鈣火花發(fā)放顯著抑制（P<0.01）。與對(duì)照組相比，高糖增加心肌細(xì)胞內(nèi)靜息期細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，給予PD治療則抑制高糖引起鈣超載。PD抑制高糖引起的心肌細(xì)胞ROS水平增加。高糖下調(diào)PLB和SERCA 2a蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 PD通過降低細(xì)胞自發(fā)鈣火花的頻率，抑制肌漿網(wǎng)鈣漏流、增加鈣穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)PLB/SERCA 2a蛋白比例，從而有效糾正高糖所致心肌細(xì)胞局部鈣調(diào)控紊亂。因此，PD可能在糖尿病心肌病患者中發(fā)揮著重要的心肌保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 虎杖苷；高糖；心肌細(xì)胞；鈣漏流；鈣火花

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）30-0020-04

虎杖苷是從傳統(tǒng)中藥虎杖（Polygonum Cuspidatun Sieb.et Zucc）中提取的單體，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)為白黎蘆醇與葡萄糖的結(jié)合產(chǎn)物，故又稱白黎蘆醇苷（piceid），屬羥基二苯乙烯類化合物。研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷具有多種生物活性，尤其對(duì)心腦血管系統(tǒng)具有獨(dú)特的改善效果。

隨著糖尿病發(fā)病的日益流行，獨(dú)立于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化之外的糖尿病心肌病，其發(fā)病比例顯著增高。其中無(wú)癥狀性左室舒張功能不全是2型糖尿病心肌病的早期病變，隨著疾病進(jìn)展，左室收縮期功能受損，最終導(dǎo)致心衰發(fā)生。研究表明糖尿病患者70%以上死于心血管疾病，是非糖尿病人群心血管系統(tǒng)疾病病死率2～3倍。故深入研究糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制，為早期保護(hù)心臟功能，提高糖尿病患者生活質(zhì)量，尤為重要[1，2]。糖尿病患者多伴隨有高血糖，長(zhǎng)期的高血糖帶來(lái)的危害是持續(xù)、多面性的。然而高血糖對(duì)心肌細(xì)胞局部鈣信號(hào)的調(diào)控仍不清楚。因此，本研究探明高糖對(duì)心肌細(xì)胞的局部鈣信號(hào)的調(diào)控，并探討虎杖苷糾正高糖引起心肌細(xì)胞鈣紊亂的作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

1～3 d SD大鼠乳鼠20只，從廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002?；⒄溶沼缮钲诤Ｍ跎镉邢薰咎峁?；抗SERCA蛋白抗體（Ab1）、PLB抗體購(gòu)于美國(guó)Alomone公司；蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)于Bio-Rad公司；ECL檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司；膠原酶Ⅱ購(gòu)于Worthington公司；5-溴脫氧尿嘧啶和胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；新生牛血清（NBCS）為Gibco；Fluo-4 AM和H2DCFDA購(gòu)于Invitrogen公司，其余無(wú)特別說明為國(guó)產(chǎn)分析純。主要的實(shí)驗(yàn)儀器為：Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 采用胰蛋白酶消化的方法分離乳鼠心肌細(xì)胞[3]。取 1～3 d 齡SD大鼠，在無(wú)菌條件下開胸，采用眼科鑷快速取下心臟并置于冰冷的PBS緩沖液中清洗3次。取心尖部組織剪為1 mm3碎塊，再用PBS液清洗，以清除血細(xì)胞。加入0.08%濃度胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，棄上清，剩余組織塊中加入混合消化酶（0.08%胰蛋白酶加 0.04%～0.06%Ⅱ型膠原酶等量加入的混合液）置37℃水浴消化5～10 min多次，將各次消化制成的細(xì)胞懸液合并后，通過150目孔徑的不銹鋼網(wǎng)濾過。將細(xì)胞懸液接種于60 mm培養(yǎng)板中，采取差速法貼壁心肌細(xì)胞：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，分離純化心肌細(xì)胞。將純化的細(xì)胞按0.8×105/m2～1.0×105/m2的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中。

1.2.2 分組 細(xì)胞被隨機(jī)分成四組：對(duì)照組（Control）、高糖組（High glucose，HG）、虎杖苷組（polydatin，PD）和高糖+虎杖苷組（HG+PD）。對(duì)照組給予甘露醇25 mM，高糖組給予25 mM葡萄糖，虎杖苷組給予30 μM PD +25 mM甘露醇，高糖+虎杖苷組給予30 μMPD+25 mM D-Glu，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行鈣信號(hào)檢測(cè)和Western blot檢測(cè)。

1.2.3 熒光染料的加載 在室溫下避光下把鈣熒光指示劑Fluo-4 AM（5 μmol/L）與細(xì)胞共同孵育8 min。染色后將細(xì)胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的載物臺(tái)上，并灌以臺(tái)氏液。

1.2.4 鈣火花的采集 采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡線掃描方式，在400倍鏡下，選取合適的細(xì)胞、保持相同采樣速率為3.84 ms/線，連續(xù)采集1000條線。在采集過程中放大倍數(shù)和采樣速度應(yīng)盡量保持一致，以方便后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，收集波長(zhǎng)為505 nm以上的發(fā)射光。

1.2.5 ROS的檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用2，7-dichlorodihydro fluorescein diacetate（H2DCFDA）熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。在室溫下將細(xì)胞和熒光探針（10 μM）共同孵育10 min。采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡面掃描的方式，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，收集波長(zhǎng)為505 nm以上的發(fā)射光。為了保持結(jié)果的可比性，熒光探針的加載條件和熒光的采集條件需要完全一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

鈣火花圖像和ROS信號(hào)的處理及分析采用IDL 6.3（Research Systems，Inc.，Boulder，CO）軟件進(jìn)行分析[4]。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，統(tǒng)計(jì)方法為單向方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)組間比較采用Welch檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷抑制高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞鈣漏流

結(jié)果顯示（圖1B），高糖引起的心肌細(xì)胞自發(fā)鈣火花發(fā)放頻率顯著增加，由對(duì)照組的（1.69±0.07）增加到高糖組的（4.26±0.27），（t=-1.309，P<0.01）；PD組稍微增加鈣火花的發(fā)放頻率（1.89±0.08），（vs 對(duì)照組：P<0.05）；通過給予PD治療后可以抑制由高糖引起的鈣火花發(fā)放頻率，由HG組的（4.26±0.27）降為（2.48±0.15），（P<0.01）。對(duì)鈣火花的形態(tài)特性進(jìn)一步分析見圖1C～F，高糖組鈣火花的幅度（F/F0）減小（vs 對(duì)照組：2.19±0.03 vs 2.32±0.05，P<0.05），持續(xù)時(shí)程（full-duration of half maximum，F(xiàn)DHM）延長(zhǎng)（vs 對(duì)照組：40.06±0.94 vs 32.41±1.57，t=2.152，P<0.05），而不改變鈣火花的寬度（full-width of half maximum，F(xiàn)WHM）。

2.2 PD抑制高糖引起的心肌細(xì)胞鈣超載

在細(xì)胞的染色條件和所有的采集參數(shù)保持一致，采用激光共聚焦線掃描的方式，對(duì)四組心肌細(xì)胞靜息期細(xì)胞內(nèi)鈣水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：高糖引起心肌細(xì)胞的靜息鈣水平顯著性升高，從對(duì)照組的（50.12±2.24）（n=100）升高到（70.53±3.54）（n=125），（t=-3.727，P<0.01）。給予PD治療后，高糖引起的心肌細(xì)胞鈣超載得到有效恢復(fù)（61.28±3.31）（n=200）[vs高糖組的（70.53±3.54）（n=125），P<0.05]（圖2）。

2.3 PD恢復(fù)高糖引起的心肌細(xì)胞ROS增加

與對(duì)照組的熒光值（56.13±3.24）相比，高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h后，高糖組心肌細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平顯著增高（98.13±6.32，t=4.923，P<0.01）。當(dāng)給予PD治療后，HG+PD組的心肌細(xì)胞ROS顯著降低（vs 高糖組：64.28±5.31，t=3.336，P<0.01），單純的PD組則不影響心肌細(xì)胞的ROS水平。

2.4高糖抑制受磷蛋白PLB和SERCA 2a蛋白的表達(dá)

如圖4B、C顯示，與對(duì)照組相比，高糖使得PLB蛋白表達(dá)有所降低（0.77±0.05 vs 0.98±0.04，t=-1.995，P<0.05，n=5）；同時(shí)對(duì)SERCA 2a蛋白水平也有下調(diào)作用（0.58±0.05 vs 1.03±0.03，t=-3.988，P<0.01，n=5）；但是高糖對(duì)SERCA 2a蛋白的抑制作用更為明顯，PLB/SERCA 2A蛋白的比值有所升高（1.31±0.11 vs 0.96±0.04，t=3.023，P<0.01，n=5）（圖4D）。給予PD治療后，PLB蛋白和SERCA 2a蛋白的表達(dá)有所恢復(fù)。

3 討論

鈣離子作為細(xì)胞第二信使，在心肌細(xì)胞的興奮收縮偶聯(lián)（E-C coupling）中起著不可或缺的作用。心肌細(xì)胞對(duì)鈣離子復(fù)雜而又精細(xì)的調(diào)控，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)平衡，從而保證細(xì)胞正常的舒縮功能。一旦鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡被打亂，心臟功能甚至結(jié)構(gòu)都可能發(fā)生異常。糖尿病是胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足，并以高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征。研究表明，高糖血癥會(huì)導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）和活性氧化產(chǎn)物（ROS）的增加[5]、激活 RAS系統(tǒng)，致脂質(zhì)、蛋白、核酸損傷，相應(yīng)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多，另外，高糖可致抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)酶活性如SOD、過氧化氫酶的活性下降[6，7]。長(zhǎng)期高糖血癥導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝異常通路激活、氧化應(yīng)激壓力增加和線粒體功能異常，引起心肌細(xì)胞鈣超載，即靜息期胞漿鈣離子濃度升高，可能是導(dǎo)致心肌功能障礙的重要原因[8-11]。

虎杖苷，是從傳統(tǒng)中藥虎杖中提取的單體，具有抗血栓、抗氧化、降血糖、抗休克、調(diào)節(jié)蛋白激酶等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[12]。在本課題組之前的系列研究中發(fā)現(xiàn)，PD具有很好的心血管保護(hù)作用，可以減緩肥大、防治燒傷后心功能的損傷的功效[13，14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，PD通過改變鈣火花發(fā)放頻率和鈣火花形態(tài)學(xué)，顯著抑制高糖引起的心肌細(xì)胞鈣超載，進(jìn)而減少肌漿網(wǎng)鈣漏流的發(fā)生，增加鈣穩(wěn)定性，進(jìn)一步豐富了PD在心血管保護(hù)中的作用機(jī)制。

引起心肌細(xì)胞鈣超載的原因不是單一因素，肌漿網(wǎng)中的鈣泵 SERCA 2a 活性和功能影響著鈣回收的效果。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，心衰時(shí)SERCA 2a 活性明顯下降，同時(shí)伴有Ca2+攝取減少，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+聚集，影響心臟的舒張功能[15]。受磷蛋白對(duì)SERCA 2a起著調(diào)控的作用，PLB 在非磷酸化狀態(tài)下抑制SERCA 2a的活性，從而抑制SERCA 2a攝取Ca2+，PLB磷酸化可逆轉(zhuǎn)這一抑制作用[16]。當(dāng)PLB/SERCA 2a比值升高時(shí)，SERCA 2a和Ca2+的親和力下降，心肌細(xì)胞舒縮功能受損。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，高糖刺激使得SERCA 2a和PLB表達(dá)均下降，但SERCA 2a降低更為顯著，PLB/SERCA 2a比值升高，從而引起鈣泵的功能受損，引起心肌細(xì)胞的鈣超載。

近年來(lái)大量研究表明，氧化應(yīng)激是糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，抗氧化可以抑制糖尿病心肌病的進(jìn)展，改善心功能。本研究中發(fā)現(xiàn)，PD通過抑制高糖引起的心肌細(xì)胞ROS增加，恢復(fù)SERCA 2a和PLB表達(dá)水平，提示糖尿病心肌病時(shí)鈣調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常可能與氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)有關(guān)。

綜上所述，糖尿病心功能障礙的一個(gè)重要機(jī)制是SR鈣漏流增加及鈣調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常?；⒄溶湛梢詼p少高糖引起的肌漿網(wǎng)鈣漏流，緩解心肌細(xì)胞鈣超載，增加心肌細(xì)胞鈣離子的穩(wěn)定性；同時(shí)抑制氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，增加心功能，從而起到心肌保護(hù)作用。對(duì)于糖尿病心肌病患者，虎杖苷減少心肌漿網(wǎng)鈣漏流有可能是早期治療糖尿病心肌病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。本研究提示虎杖苷可以抑制糖尿病心肌病的進(jìn)展，改善心功能，為糖尿病心功能障礙的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。

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（收稿日期：2016-08-16）