李紅勝　寧瑤　衡翔　李勝兵　陳松勁　葉俏

[摘要] 目的 研究miRNA-181a檢測在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者臨床診治中的價(jià)值。 方法 采用反轉(zhuǎn)錄PCR法（RT-PCR）檢測36例2015年1～6月來我院門診和住院就診的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者及30例同期來我院健康體檢的對照者的血漿miRNA-181a相對表達(dá)量，同時(shí)測定SLE患者的血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）與免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和補(bǔ)體C3、C4及系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)（SLEDAI）等，分析miRNA-181a與這些臨床指標(biāo)的關(guān)系。 結(jié)果 SLE組miRNA-181a相對表達(dá)水平顯著高于健康對照組，SLE活動期組高于SLE穩(wěn)定期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SLE患者血漿miRNA-181a相對表達(dá)水平與血沉、C反應(yīng)蛋白、SLEDAI評分等呈正相關(guān)（r=0.48、0.56、0.62，P均<0.05）。 結(jié)論 血漿miRNA-181a濃度在SLE患者體內(nèi)明顯升高，且與SLE患者目前常用的一些臨床評估指標(biāo)高度相關(guān)，miRNA-181a有可能成為一個新的SLE疾病活動度評估及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] miRNA-181a；血漿；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；臨床指標(biāo)；反轉(zhuǎn)錄PCR

[中圖分類號] R593.241 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）32-0037-04

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫介導(dǎo)的以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)、常累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病。SLE病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，機(jī)體的免疫異常被認(rèn)為是發(fā)病的關(guān)鍵原因。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類廣泛存在于真核生物中、長度約21～25個核苷酸的非編碼小分子RNA。它可通過與靶基因mRNA序列的特異性相互作用降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，還可在特定條件下上調(diào)靶基因的蛋白表達(dá)和mRNA水平。研究表明，在自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中，microRNA發(fā)揮著不可忽視的作用[1]。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測36例SLE患者和30例健康人群血漿的miRNA-181a相對表達(dá)量，并同時(shí)檢測SLE患者血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和補(bǔ)體C3、C4及系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)（SLEDAI）等，分析miRNA-181a水平與這些臨床指標(biāo)的關(guān)系，探討miRNA-181a在SLE疾病中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1～6月來我院門診和住院就診的SLE患者36例，SLE診斷均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的SLE診斷指南，排除患有其他全身性疾病的患者。其中男7例，女29例，年齡23～61歲，平均（37±9）歲。系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)（SLEDAI）≥6（活動期）21例，SLEDAI<6（穩(wěn)定期）15例；另外選取來我院健康體檢正常的30例人群作為對照人群（正常對照組），排除有高血壓、心臟病、糖尿病、自身免疫性疾病及其他疾病者，不得具備SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任何一條。其中男5例，女25例，年齡21～57歲，平均年齡（36±7）歲，兩組間年齡、性別等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。患者進(jìn)入研究后即對患者進(jìn)行全面的檢查并根據(jù)檢查情況計(jì)算其SLEDAI評分[2]。血沉的檢測采用魏氏法，C反應(yīng)蛋白與免疫球蛋白IgG、、IgA、IgM和補(bǔ)體C3、C4的檢測均在Beckman coulter Immage 800上進(jìn)行。本研究得到了嘉興市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有受試對象均知情同意。

1.2 儀器與試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Roche Cobas Z 480購自美國Roche公司，Eppendorf D30紫外分光光度計(jì)購自Eppendorf公司，PCR引物由上海生工合成，Trizol RNA提取試劑、BIOGHC Elitefast SYBR Kit及BIOG Super Reverse Transcriptase均購自Invitrogell公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本處理 取SLE患者靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，800 g離心10 min后吸取上清血漿至1.5 mL EP管中，再次800 g離心10 min，取上清血漿-80℃冷凍保存，統(tǒng)一檢測。正常對照組標(biāo)本處理同前。

1.3.2 總RNA的提取與純化 用 Trizol RNA提取試劑盒提取和純化總RNA，按試劑說明書操作。應(yīng)用Eppendor D30紫外分光光度儀檢測總RNA 濃度和質(zhì)量，檢測合格者置-80℃冰箱凍存待用。

1.3.3 miRNA-181a的逆轉(zhuǎn)錄 應(yīng)用BIOG Super Reverse Transcriptase對提取的總RNA中miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按說明書將總RNA 5 μL加入反應(yīng)體系，miRNA-181a逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃ 5 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min；轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA進(jìn)行real-time PCR或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 Real-time PCR 在Cobas Z 480 PCR儀器上進(jìn)行qRT-PCR。以小分子RNA U6作為內(nèi)參，所用引物序列見表1。反應(yīng)體系：cDNA 模板2 μL，2×BIOGHC Elitefast SYBR Master mix 10 μL，Primer Set 0.8 μL，加 RNase free ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min一個循環(huán)，95℃ 10 sec，60℃ 30 sec共40個循環(huán)，溶解曲線一個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各標(biāo)本平均Ct值。miRNA-181a的相對含量以2-ΔΔCt表示[3]，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt（目的基因 Ct-內(nèi)參基因 Ct）-對照組ΔCt（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，miRNA-181a的表達(dá)量與SLE臨床指標(biāo)的相關(guān)性采用pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE組和正常對照組血漿中miRNA-181a相對表達(dá)量比較

Real-Time PCR檢測結(jié)果顯示，SLE組miRNA-181a的相對表達(dá)量（0.68±0.19）顯著高于對照組（0.41±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.26，P=0.02<0.05）。

2.2 SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達(dá)量與一些常用臨床指標(biāo)的相關(guān)性

SLE活動期患者外周血漿中的miRNA-181a相對表達(dá)量顯著高于穩(wěn)定期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.13，P<0.01）（圖1）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：SLE患者miRNA-181a相對表達(dá)水平與SLEDAI積分呈正相關(guān)（r=0.62，P=0.043）（圖2），與患者的ESR、CRP也呈正相關(guān)（r=0.48、0.56、P均<0.05）（圖3，圖4），與患者的年齡、性別、補(bǔ)體C3、C4水平無相關(guān)性（P均>0.05）。

3 討論

miRNA-181作為micro-RNAs的一個家族系列，主要有miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d[4]。在人類中，miRNA-181主要在3個獨(dú)立的染色體上編碼，miRNA-181a-1/b-1位于1號染色體上，miRNA-181a-2/b-2位于9號染色體上，miRNA-181c/d位于19號染色體上[5]。miRNA-181家族成員的主要作用機(jī)制是通過與靶標(biāo)mRNA的3-UTR堿基互補(bǔ)結(jié)合，抑制其下一步的翻譯功能，或者降低其互補(bǔ)mRNA的穩(wěn)定性，達(dá)到調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而參與各種生理或病理過程作用。miRNA家族成員在基因的功能上并不完全相同[6]，miRNA-181a作為miRNA-181家族中重要一員，在細(xì)胞的發(fā)展和分化過程中起著尤為重要的作用，它能夠抑制多種細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且在不同組織細(xì)胞中具有表達(dá)差異[7，8]，研究發(fā)現(xiàn)其在癌癥和自身免疫性疾病中常常出現(xiàn)異常高表達(dá)或低表達(dá)[9]。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為一種慢性的多器官的自身免疫性疾病[10]，有多種臨床表現(xiàn)型，病程活動期與穩(wěn)定期呈遷延反復(fù)交替出現(xiàn)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。在其發(fā)展過程中有多種炎癥因子參與其中，如TNF-α、IL-1、IL-6和IFN等，這些炎癥因子通過MAPK通路發(fā)揮作用[11]。在該病的發(fā)生和發(fā)展過程中，miRNA-181家庭均發(fā)揮著重要作用[12，13]。

關(guān)于miRNA-181a表達(dá)水平與SLE疾病的相關(guān)性目前有一些相互矛盾的研究結(jié)果[9，13-15]，我們利用RT-PCR方法檢測了SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P<0.05），且SLE活動期患者血漿中miRNA-181a相對表達(dá)水平顯著高于SLE穩(wěn)定期患者（P<0.05），這與Carlsen AL[13]、Motawi TK[14]等的研究結(jié)果相同。MiRNA-181a表達(dá)水平與SLE疾病的相關(guān)性可能與miRNA-181a參與調(diào)控體內(nèi)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-181a能夠調(diào)節(jié)IL-8、IL-1α、IL-1β和IL-6等的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[16，17]。其對 IL-8和 IL-1α的表達(dá)調(diào)控均呈現(xiàn)出反向調(diào)節(jié)的關(guān)系，而對 IL-1β和IL-6 的調(diào)控則是正向調(diào)控。其可能通過TLR-4通路對這些炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[17]。

本研究還分析了SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達(dá)水平與一些常見臨床病理特征之間的關(guān)系，SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達(dá)水平高低與患者年齡、性別、補(bǔ)體C3、C4濃度均無明顯相關(guān)（P>0.05），miRNA-181a水平與SLEDAI積分、ESR、CRP呈正相關(guān)（P<0.05），提示miRNA-181a可能與SLE疾病的臨床活動度及預(yù)后有關(guān)，但這需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)進(jìn)行長期隨訪研究。有研究提示SLE發(fā)病年齡對臨床疾病的呈現(xiàn)方式、器官受累的模式以及血清學(xué)檢查結(jié)果都會有不同影響[18-20]，這可能會導(dǎo)致miRNA-181a相對表達(dá)量與臨床指標(biāo)關(guān)系在成人SLE患者與兒童SLE患者之間有所不同。本試驗(yàn)沒有對兒童SLE患者進(jìn)行相關(guān)研究。目前對miRNA-181a作用靶標(biāo)的鑒別驗(yàn)證以及其如何導(dǎo)致靶標(biāo)mRNAs沉默的機(jī)制還需進(jìn)一步的探索研究。

綜上所述，在SLE患者血漿中miRNA-181a的濃度增高，且與疾病的活動度相關(guān)，隨著對miRNA-181a研究的不斷深入，miRNA-181a有可能成為SLE早期診斷、臨床活動度評價(jià)及預(yù)后判斷的新的分子標(biāo)志物。

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（收稿日期：2016-08-24）