周廣運(yùn)　王桂姬　任皓威　蘆乾　楊艷　郭立?！?/p>

摘要以親緣關(guān)系較近的豬、牛和羊3個(gè)物種的肌肉組織為研究對(duì)象，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS），篩選并確認(rèn)了豬物種肉特異性肽生物標(biāo)志物。3種純?nèi)鈽悠方?jīng)蛋白質(zhì)提取、胰蛋白酶消化和UPLCTripleTOFMS分離鑒定，得到的總離子流圖譜（TIC）與Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，篩選出3個(gè)物種肉的3種高豐度同源蛋白和8種潛在的肽生物標(biāo)志物； 潛在的肽生物標(biāo)志物經(jīng)QTRAPMS質(zhì)譜的多反應(yīng)模式（MRM）分析，最終確認(rèn)了豬物種肉的5種肽生物標(biāo)志物，其中3種肽生物標(biāo)志物未見文獻(xiàn)報(bào)道。

關(guān)鍵詞豬肉； 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 多反應(yīng)監(jiān)控； 肽生物標(biāo)志物

1引 言

肉品摻假已成為全世界普遍存在的問題，用低價(jià)的肉代替高價(jià)的肉是肉品摻假的主要方式，牛肉和羊肉作為價(jià)格高的肉類，常用豬肉摻假。這不僅侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益，而且還沖擊了宗教信仰[1]，造成嚴(yán)重的社會(huì)問題。目前，基于核酸與蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法已廣泛應(yīng)用于肉制品的摻假鑒定，包括PCR技術(shù)[2～4]和免疫學(xué)方法（如ELISA等）[5]。與PCR技術(shù)相比較，基于蛋白質(zhì)的肉品摻假鑒定方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)在高度加工條件下相對(duì)穩(wěn)定[6]，肉品經(jīng)加工處理后，仍能觀察到部分蛋白質(zhì)的氨基酸序列[7]，而DNA在高度加工或者頻繁處理的肉類樣品中，很容易導(dǎo)致降解[8]。其次，蛋白質(zhì)具有更高的組織特異性，而DNA在同一個(gè)體不同組織之間沒有差別[9]。然而，以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的ELISA方法也存在著自身的劣勢(shì)，每個(gè)ELISA反應(yīng)只能檢測(cè)單一的物種，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多個(gè)物種的同時(shí)檢測(cè)。

采用質(zhì)譜方法鑒定和分析不同物種的蛋白質(zhì)來檢測(cè)肉品摻假，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠，近年來已成為肉品摻假鑒定的主要方法。Taylor等[10]最先將質(zhì)譜方法應(yīng)用于肉制品的摻假鑒定。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOFMS）結(jié)合電泳或者高效液相色譜技術(shù)可用于研究肉品摻假鑒定[11，12]，但存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。高通量和高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)分析的技術(shù)[13～15]，是目前檢測(cè)肉品摻假的研究熱點(diǎn)。在中國(guó)東北地區(qū)，牛羊肉火鍋和燒烤較為常見，由于豬肉價(jià)格相對(duì)較低且容易獲得，常用豬肉來?yè)郊倥Ｑ蛉?。三元雜交豬是中國(guó)東北地區(qū)最主要的豬肉品種，關(guān)于它的肌肉蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少； 另外，由于豬的種屬和生長(zhǎng)環(huán)境的不同，可能會(huì)導(dǎo)致不同地區(qū)或不同品種的豬肉，在蛋白質(zhì)表達(dá)方面存在差異。本研究首先使用高分辨率、高掃描速度的飛行時(shí)間質(zhì)譜（Triple TOFMS）對(duì)3種純?nèi)鈽悠分械娜鞍缀投嚯倪M(jìn)行了分離鑒定，通過檢索Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出豬物種肉的潛在肽生物標(biāo)志物； 采用三重四極桿質(zhì)譜，在多反應(yīng)監(jiān)控（MRM）模式下進(jìn)一步分析潛在的肽生物標(biāo)志物，最終確認(rèn)了豬物種肉的5種特異性肽生物標(biāo)志物，其中3種肽生物標(biāo)志物未見文獻(xiàn)報(bào)道。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）； TripleTOF 5600飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、ExionLC AD超高效液相色譜儀、QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）； TGL16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司） 。

3[3（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、尿素、色譜純的甲酸、甲醇和乙腈（美國(guó)Sigma公司）； 測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（美國(guó)Promega公司）。其它試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣品的采集本研究中的牛肉、羊肉和豬肉3種純?nèi)鈽悠?，均?gòu)買于哈爾濱市某大型超市和正規(guī)的商業(yè)屠宰場(chǎng)，剔除肉樣品中的脂肪組織和結(jié)締組織，剩余的瘦肉樣品被分割成小塊

2.2.2蛋白質(zhì)的提取用研缽將各肉類組織在液氮中充分碾碎，稱取約2 g的不同碎肉樣品于離心管中，各加入1 mL蛋白質(zhì)提取液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% （w/V） CHAPS）充分振蕩， 12000 r/min離心20 min，取上清液備用。蛋白濃度采用Bradford法分析測(cè)定。

2.2.3蛋白質(zhì)的消化取200 μg蛋白溶液于離心管中，加入DTT溶液，56 ℃反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，再加入IAA溶液，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，完成還原烷基化過程； 將溶液轉(zhuǎn)移至超濾管（截留分子量為10 K）中，離心除去過量的DTT、IAA和部分雜質(zhì)，并用NH4HCO3溶液洗3次； 向超濾管中加入100 μL含有3 μg 測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，37 ℃條件下振蕩反應(yīng)過夜，離心收集溶液。

2.2.4豬潛在肽生物標(biāo)志物的找尋采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)消化后的多肽樣品進(jìn)行分析鑒定。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm， Waters公司），ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈，流速為0.3 mL/min， 梯度洗脫條件為：0～40 min，5%～35% B； 40～55 min，35%～100% B； 55～55.1 min，100%～5% B； 55.1～60 min，5% B。

質(zhì)譜分析采用TripleTOF 5600飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，離子源為ESI源，離子源的電離電壓和溫度分別設(shè)定為5500 V和550 ℃。所有多肽樣品均在正離子模式狀態(tài)下掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1500之間。每個(gè)樣品重復(fù)掃描兩次。

使用ProteinPilot （Version 5.0，SCIEX）軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和豬潛在肽生物標(biāo)志物的找尋。

2.2.5質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)控（MRM）確認(rèn)豬的肽生物標(biāo)志物采用Exion LC AD超高效液相色譜串聯(lián)QTRAP 4500質(zhì)譜建立多反應(yīng)監(jiān)控檢測(cè)方法。液相色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm， Waters公司）柱，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相相為0.1%甲酸乙腈，流速為0.4 mL/min，梯度洗脫條件為：0～1 min， 5%～10% B； 1～15 min，10%～35% B； 15～16 min，35%～90% B； 16～18 min，90% B； 18～18.1 min，90%～5% B； 18.1～22 min，5% B。質(zhì)譜系統(tǒng)使用Turbo V的電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為550 ℃，噴霧電壓為5500 V。

使用Skyline工具構(gòu)建所有潛在肽生物標(biāo)志物的MRM 離子對(duì)，采用Analyst軟件（Version 1.6.2，SCIEX）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3結(jié)果與討論

3.1同源蛋白分析

同源蛋白是指氨基酸序列具有明顯的相似性，在不同生物體或同一機(jī)體內(nèi)行使相同或相似功能的一類蛋白質(zhì)。同源蛋白的發(fā)現(xiàn)是鑒定特異性肽生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)，肽生物標(biāo)志物的穩(wěn)定性與同源蛋白豐度有關(guān)。在本研究中，豬肉、牛肉和羊肉的3種多肽樣品經(jīng)LCTripleTOFMS質(zhì)譜鑒定，得到每個(gè)物種的總離子流（TIC）圖譜，經(jīng)ProteinPilot軟件與UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，最終得到豬、牛和羊3個(gè)物種肉的高豐度同源蛋白質(zhì)信息見表1。

采用本研究開發(fā)的檢測(cè)方法，每種肉可以檢測(cè)到500～700種蛋白質(zhì)，這與von Bargen等[14]的報(bào)道結(jié)果一致，但與Sarah等[19]的研究結(jié)果相比，本研究鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯增加。通過詳細(xì)比較和篩選3種動(dòng)物物種肉的所有蛋白質(zhì)，最終篩選出3種動(dòng)物物種肉的同源蛋白。同時(shí)，為了提高實(shí)驗(yàn)的可靠性，排除了同源蛋白質(zhì)中的低豐度蛋白（按照蛋白質(zhì)豐度排序，序列號(hào)60以后的蛋白質(zhì)）。由于不是所有的同源蛋白質(zhì)中都含有特異性的肽生物標(biāo)志物，為了減少數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，提前排除了不含有潛在肽生物標(biāo)志物的同源蛋白。最終，確定了3個(gè)動(dòng)物物種中的3種高豐度同源蛋白質(zhì)（按照蛋白質(zhì)豐度排序，序列號(hào)60之前的蛋白質(zhì)），詳細(xì)信息見表1。在高豐度同源蛋白信息中，肌紅蛋白（Myoglobin） 和3磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase）已被報(bào)道用于肉品摻假的鑒別[16～18]。但未有線粒體三功能酶α亞基（Trifunctional enzyme subunit alpha， mitochondrial）用于肉類摻假的報(bào)道，為本研究新發(fā)現(xiàn)的高豐度同源蛋白，此酶在線粒體中主要參與脂肪酸的β氧化和脂質(zhì)代謝，在豬肉組織中有較高的豐度，這可能與該蛋白在三元雜交豬中的高表達(dá)有關(guān)。

3.2豬物種肉潛在肽生物標(biāo)志物的找尋

豬物種肉潛在肽生物標(biāo)志物是指該多肽序列僅特異性的存在于豬物種肉中，而在本研究中的其它物種（牛和羊）中不存在，并且這些特異性的肽段所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)是3個(gè)動(dòng)物物種中的高豐度同源蛋白。同時(shí)，為了進(jìn)一步確認(rèn)肽段的特異性，將篩選到的豬物種肉特異性肽段在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast分析，即這些特異性肽段的氨基酸序列不能與牛和羊物種的氨基酸序列完全匹配[7，19]。詳細(xì)的豬潛在肽生物標(biāo)志物信息見表2。

由表2可見，利用本方法最終篩選出豬物種肉的8個(gè)潛在肽生物標(biāo)志物，其中包括文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道過的多肽序列GHHEAELTPLAQSHATK[16，20]和WGDAGATYVVESTGVFTTMEK[18]。而線粒體三功能酶α亞基（Trifunctional enzyme subunit alpha， mitochondrial）蛋白，作為新發(fā)現(xiàn)的同源蛋白，包含6種潛在肽生物標(biāo)志物，未見報(bào)道。在篩選豬物種肉潛在肽生物標(biāo)志物時(shí)，及時(shí)排除了高豐度同源蛋白質(zhì)中可信度（ProteinPilot軟件自動(dòng)給出）小于95%的肽段，增加了潛在肽生物標(biāo)志物的可靠性。另外，不同的胰蛋白酶酶切效率不同，常會(huì)出現(xiàn)誤切和漏切等現(xiàn)象[21]，在篩選肽生物標(biāo)志物時(shí)，應(yīng)及時(shí)排除出現(xiàn)天冬酰胺脫酰胺、谷氨酸N末端環(huán)化、甲基化和磷酸化等不穩(wěn)定存在的肽段。

3.3多反應(yīng)監(jiān)控模式下對(duì)豬潛在肽生物標(biāo)志物的確認(rèn)

通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的方式篩選到的豬物種肉潛在肽生物標(biāo)志物，須經(jīng)過質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)控（MRM）的進(jìn)一步驗(yàn)證，以確認(rèn)肽生物標(biāo)志物的特異性。Skyline工具會(huì)自動(dòng)生成目標(biāo)肽段的母離子和可能的子離子，在眾多的母離子和子離子對(duì)中，選擇轉(zhuǎn)換最為激烈的6對(duì)母離子和子離子，作為MRM的特異性驗(yàn)證離子[14～16]。根據(jù)同一肽的MRM離子對(duì)具有相同的保留時(shí)間，判斷潛在肽生物標(biāo)志物的特異性。圖1顯示了多肽序列WGDAGATYVVESTGVFTTMEK在3個(gè)物種前15 min的提取離子流色譜圖（XIC），圖1中的峰是由一個(gè)或者多個(gè)具有相同的母離子轉(zhuǎn)換得到的子離子形成的峰簇（見圖2、圖3）。由圖1可見，在豬物種肉的提取離子流色譜圖中，7.62和9.87 min出現(xiàn)兩個(gè)峰，結(jié)合牛和羊物種的提取離子流色譜圖，可以確認(rèn)7.62 min的低強(qiáng)度峰為豬物種肉的非特異性峰，而9.87 min的峰為豬物種肉的特異性峰。為了進(jìn)一步證明9.87 min的峰為豬物種肉的特異性峰，分析了7.62 min和9.87 min的峰。

本研究最終篩選并確認(rèn)了豬物種肉的5種肽生物標(biāo)志物。其中肽生物標(biāo)志物TVLGAPEVLLGILPGAGGTQR、ADMVIEAVFEELSLK和FAGGNLDVLK未見報(bào)道。本研究中未針對(duì)特定蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，而是采用了高分辨率、高掃描速度的質(zhì)譜對(duì)3個(gè)物種肉中的全蛋白進(jìn)行了分析鑒定，極大豐富了分析結(jié)果中的蛋白質(zhì)和多肽的信息。同時(shí)，也增加了質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果中的同源蛋白質(zhì)和肽生物標(biāo)志物的數(shù)量。另外，由于三元雜交豬的種屬和生長(zhǎng)環(huán)境的不同，可能導(dǎo)致了某些蛋白質(zhì)在肌肉中的含量有所差異，也影響到了肽生物標(biāo)志物的數(shù)量。新發(fā)現(xiàn)的肽生物標(biāo)志物可能與三元雜交豬的品種特異性有關(guān)，這需要后續(xù)的研究進(jìn)行驗(yàn)證。表3給出了豬物種肉肽生物標(biāo)志物的母離子、子離子和肽生物標(biāo)志物在MRM實(shí)驗(yàn)中具體的保留時(shí)間。

4結(jié) 論

本研究采用TripleTOFMS系統(tǒng)篩選出3個(gè)物種肉的3種高豐度同源蛋白和8種潛在的肽生物標(biāo)志物； 利用QTRAPMS系統(tǒng)建立的MRM方法，最終確認(rèn)了豬物種肉的5種肽生物標(biāo)志物，其中2種肽生物標(biāo)志物與之前的報(bào)道相符，而肽生物標(biāo)志物TVLGAPEVLLGILPGAGGTQR、ADMVIEAVFEELSLK和FAGGNLDVLK未見文獻(xiàn)報(bào)道。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）技術(shù)作為肉品摻假鑒定新方法，具有廣闊的發(fā)展空間。本方法可為后續(xù)混合肉中豬肉成分的定量分析以及豬物種肉檢測(cè)的商業(yè)ELISA試劑盒的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

AbstractThe samples of muscular tissue from pork， beef and lamb which were closely related in the genetic relationship were analyzed by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometric （UPLCMS） technique. The specific peptide biomarkers of pig meat species were found and confirmed. Proteins from three pure meat samples were extracted and digested using trypsin， the digested proteins were identified by UPLCtriple timeofflight （TOF）MS， and the total ion chromatogram （TIC） was searched and analyzed against the UniProt database. Three high abundant homologous proteins of three species and 8 potential peptide biomarkers of pork were found. A multiple reaction monitoring （MRM） QTRAPMS method was established to confirm the specificity of potential peptide biomarkers. As a result， five peptide biomarkers of pig species meat were confirmed， three of which were not reported.

KeywordsPork； Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Multiple reaction monitoring； Peptide biomarkers