陳信忠，郭書(shū)林，龔艷清

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 廈門 361026)

DNA條形碼技術(shù)在主要觀賞魚(yú)物種鑒定中的應(yīng)用分析

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 廈門 361026)

通過(guò)檢索BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)和GenBank中錦鯉、金魚(yú)、慈鯛、神仙魚(yú)、七彩神仙魚(yú)、血鸚鵡、花羅漢、龍魚(yú)、孔雀魚(yú)、鼠魚(yú)、魟魚(yú)等主要觀賞魚(yú)的DNA條形碼和基因序列，應(yīng)用MEGA軟件計(jì)算種間遺傳距離，在BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相似序列，以分析DNA條形碼在主要觀賞魚(yú)物種鑒定中的應(yīng)用效果。結(jié)果表明該技術(shù)可以有效鑒別大多數(shù)種以上階元的觀賞魚(yú)類，但對(duì)親緣關(guān)系較近、種類繁多的多種慈鯛、孔雀魚(yú)等觀賞魚(yú)物種難以獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，對(duì)金龍、紅龍等亞洲龍魚(yú)的亞種以及人工繁育的不同品系的錦鯉、金魚(yú)、神仙魚(yú)、七彩神仙魚(yú)、血鸚鵡、花羅漢等魚(yú)類，無(wú)法通過(guò)COI基因條形碼進(jìn)行鑒別，需要研究其他分子生物學(xué)方法。

觀賞魚(yú)；DNA條形碼；物種鑒定；應(yīng)用

近年來(lái)我國(guó)觀賞魚(yú)產(chǎn)業(yè)和國(guó)際貿(mào)易快速發(fā)展。全球已知具有商業(yè)化價(jià)值的觀賞魚(yú)類約有2 000余種。雖然約80%的觀賞魚(yú)來(lái)自人工繁育，但絕大多數(shù)觀賞魚(yú)的原產(chǎn)地來(lái)自非洲、南美洲以及東南亞部分國(guó)家和地區(qū)[1]。由于觀賞魚(yú)種類繁多，欣賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值相差巨大，因此對(duì)觀賞魚(yú)物種的準(zhǔn)確鑒定，成為觀賞魚(yú)國(guó)際貿(mào)易中迫切需要解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別方法主要依據(jù)魚(yú)類的形態(tài)、體色和斑紋等特征，由于很多魚(yú)類的形態(tài)特征容易受年齡、環(huán)境和養(yǎng)殖條件等因素的影響，尤其許多魚(yú)類的卵和幼體很難進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)更加準(zhǔn)確的物種鑒別方法?；贒NA序列進(jìn)行物種鑒定的DNA條形碼技術(shù)為觀賞魚(yú)物種的準(zhǔn)確鑒定提供了全新的方法。全球魚(yú)類生命條形碼計(jì)劃(Fish Barcode of Life Initiative，F(xiàn)ISH-BOL)于2004年開(kāi)始實(shí)施，并建立了生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(Barcode of Life Data Systems，BOLD SYSTEMS)。該系統(tǒng)采用經(jīng)過(guò)權(quán)威的分類鑒定的標(biāo)本，以電子數(shù)據(jù)庫(kù)形式構(gòu)建含有DNA條形碼、圖像和地理坐標(biāo)的全球魚(yú)類參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，重點(diǎn)解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法無(wú)法鑒別的難題。DNA條形碼技術(shù)可以有效識(shí)別魚(yú)類，對(duì)大部分物種具有良好的鑒別結(jié)果，還可以測(cè)試現(xiàn)有分類系統(tǒng)的有效性，糾正一些同物異名，或者發(fā)現(xiàn)一些潛在的物種[2-7]。但由于觀賞魚(yú)的特殊性，該技術(shù)在鑒別很多親緣關(guān)系相近的觀賞魚(yú)物種時(shí)存在很多局限性。我國(guó)是觀賞魚(yú)主要生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，但我國(guó)的絕大多數(shù)觀賞魚(yú)物種原產(chǎn)地均來(lái)自國(guó)外，每年需要引進(jìn)大量的觀賞魚(yú)物種進(jìn)行人工繁育和種質(zhì)資源改良。我國(guó)的魚(yú)類DNA條形碼研究相對(duì)較少，在觀賞魚(yú)方面的研究更少。因此，通過(guò)分析DNA條形碼對(duì)主要觀賞魚(yú)物種鑒別的應(yīng)用，可以了解該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和存在的不足，更好地應(yīng)用于觀賞魚(yú)種類的鑒別。

1 材料和方法

檢索BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)和GenBank中錦鯉、金魚(yú)、慈鯛、神仙魚(yú)、七彩神仙魚(yú)、血鸚鵡、花羅漢、龍魚(yú)、孔雀魚(yú)、鼠魚(yú)、魟魚(yú)等主要觀賞魚(yú)的COI基因條形碼序列，應(yīng)用MEGA軟件[8]選擇Kimura-2參數(shù)模型制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，計(jì)算種內(nèi)或種間遺傳距離。應(yīng)用GenBank中的核酸BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，并在BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相似序列。依據(jù)DNA條形碼的物種鑒定原則，判定DNA條形碼在觀賞魚(yú)物種鑒別中的應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)中主要觀賞魚(yú)物種的DNA條形碼

觀賞魚(yú)種類繁多，在分類上分屬于鱸形目等近20目，其中鯉形目、鱸形目、脂鯉目和鯰形目種類最多。BOLD SYSTEMS是全球DNA條形碼的應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)，支持所有生命條形碼數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和應(yīng)用。經(jīng)過(guò)多年的努力，目前該系統(tǒng)已收集基因序列6 049 996條，DNA條形碼5 246 662條。其中動(dòng)物基因條形碼482 250條，涵蓋174 627種物種[9]。至今在GenBank和BOLD SYSTEMS中已收錄的與觀賞魚(yú)相關(guān)的COI基因條形碼數(shù)量見(jiàn)表1，涵蓋了目前國(guó)際上常見(jiàn)的觀賞魚(yú)種類，其中也包含了大量的非觀賞魚(yú)類物種。涵蓋近10 000種物種，但有基因條形碼的物種數(shù)量只有9 000余種，因有些物種為未定種，還有一些樣品沒(méi)有COI基因序列，或不符合基因條形碼的要求。不過(guò)，鯉形目、鱸形目、脂鯉目和鯰形目等數(shù)量較多的觀賞魚(yú)還有很多種類沒(méi)有基因條形碼或相關(guān)的基因序列。

表1 已收錄的觀賞魚(yú)類標(biāo)本和基因條形碼數(shù)量Tab.1 Number of specimens and species with barcodes of the ornamental fish

2.2 DNA條形碼鑒別慈鯛類觀賞魚(yú)

慈鯛是熱帶和亞熱帶地區(qū)最常見(jiàn)的觀賞魚(yú)類，是品種和數(shù)量最多的淡水觀賞魚(yú)，主要來(lái)自非洲維多利亞湖、坦噶尼喀湖和馬拉維湖，以及南美洲亞馬遜河流域和西印度群島。僅非洲大陸已發(fā)現(xiàn)的慈鯛科魚(yú)種就超過(guò)700種。加上許多慈鯛之間可以在人工養(yǎng)殖條件下進(jìn)行雜交，產(chǎn)生出許多人工改良的品種，使慈鯛種類不斷增加。慈鯛大多屬于鱸形目慈鯛科(Cichlidae)，至今BOLD已收錄160屬545種慈鯛的5 118條基因條形碼。DNA條形碼對(duì)鑒別大部分形態(tài)差異較大的科屬的慈鯛是有效的，對(duì)一些種類較多的屬，也有很好的鑒別效果。新亮麗鯛屬(Neolamprologus)已報(bào)告18個(gè)物種的40條基因條形碼，與形態(tài)學(xué)分類基本一致。

慈鯛具有超強(qiáng)的適應(yīng)能力與多變的色彩和斑紋，表現(xiàn)在形態(tài)上的多彩多姿。但由于很多慈鯛的形態(tài)變化與其特殊的生境密切相關(guān)，在基因進(jìn)化上尚未形成穩(wěn)定的變異，因此DNA條形碼在鑒定很多慈鯛時(shí)遇到了困難。隱帶麗魚(yú)屬(Apistogramma)的魚(yú)類又被稱為短鯛，至今已有60多種隱帶麗魚(yú)的記錄，但只報(bào)告了14個(gè)物種的79條基因條形碼?？兹铬爩?Aulonocara)已發(fā)現(xiàn)10多種，但至今只有火尾孔雀鯛(Aulonocarastuartgranti)的基因條形碼。而且，通過(guò)BOLD SYSTEMS檢索，火尾孔雀鯛與閃電王子(Pseudotropheuselongatus)、斑馬雀(Maylandialombardoi)、藍(lán)色非洲王子(Labidochromischisumulae)、金藍(lán)王子(Melanochromisjohannii)、米洛柔麗鯛(Placidochromismilomo)、杰弗瑞天使(Alticorpusgeoffreyi)、金背阿芙拉(Cynotilapiaafra)、馬湖劍沙(Diplotaxodonlimnothrissa)、快樂(lè)東方鯛(Astatotilapiacalliptera)、黑巖非鯽(Petrotilapianigra)、頰麗鯛(Genyochromismento)、馬拉維蒼皮麗魚(yú)(Pallidochromistokolosh)等至少14屬26種慈鯛的相似性大于98%。同樣的，非洲王子(Labidochromiscaeruleus)與扁頭恐怖麗魚(yú)(Dimidiochromiscompressiceps)、金藍(lán)斜間(Taeniolethrinopspraeorbitalis)、維納斯(Nimbochromisvenustus)、雪花豹(Fossorochromisrostratus)、藍(lán)蒂斯天使(Protomelasannectens)、帕雷克頓珍珠(Trematocranusplacodon)、長(zhǎng)鰭柔麗鯛(P.longimanus)、彩虹天使(Cheilochromiseuchilus)、藍(lán)茉莉(Cyrtocaramoorii)以及埃及艷后(Protomelastaeniolatus)等11屬12種慈鯛的COI基因同源性大于99.54%。顯然，應(yīng)用COI基因難以有效鑒別這些慈鯛。

2.3 DNA條形碼鑒別神仙魚(yú)

神仙魚(yú)又稱天使魚(yú)，因其獨(dú)特的造型、色彩和習(xí)性成為淡水觀賞魚(yú)最常見(jiàn)的種類。至今已發(fā)現(xiàn)橫紋神仙魚(yú)(Pterophyllumaltum)、大神仙魚(yú)(P.scalare)和黑神仙魚(yú)(P.leopordi)等3種，但只有橫紋神仙魚(yú)和大神仙魚(yú)的18條基因條形碼，尚無(wú)黑神仙魚(yú)的DNA條形碼。通過(guò)COI基因可以有效區(qū)別上述3種神仙魚(yú)，但現(xiàn)在觀賞魚(yú)市場(chǎng)上的神仙魚(yú)基本上都是人工雜交品種，經(jīng)過(guò)幾十年的人工改良，已經(jīng)繁育了幾十個(gè)品系的神仙魚(yú)，這些神仙魚(yú)的COI基因遺傳距離均小于1%，因此難以作為DNA條形碼進(jìn)行鑒別。

2.4 DNA條形碼鑒別七彩神仙魚(yú)

七彩神仙魚(yú)因其色彩艷麗、花色繁多而有熱帶魚(yú)王的美譽(yù)。屬鱸形目，麗魚(yú)科(Cichlidae)，盤麗魚(yú)屬(Symphysodon)，野生七彩神仙魚(yú)有黑格爾(Symphysodondiscus)、黃棕盤麗魚(yú)(S.aequifasciatus)和棕七彩(S.haraldi)等3種。通過(guò)COI序列可以區(qū)分3種七彩神仙魚(yú)，但棕七彩與黃棕盤麗魚(yú)的遺傳距離非常小，有很多學(xué)者認(rèn)為棕七彩尚未形成獨(dú)立的種?，F(xiàn)在觀賞魚(yú)市場(chǎng)上有大量人工繁育的品種，主要有藍(lán)七彩、紅七彩、棕七彩、黃七彩等多個(gè)品系。這些品種的COI基因序列高度相似，遺傳距離均小于1%，都未達(dá)到物種水平。

2.5 DNA條形碼鑒別血鸚鵡和花羅漢

血鸚鵡(Blood parrot cichlid)和花羅漢都不是自然進(jìn)化的物種，而是由來(lái)自南美洲的一些中大型慈鯛通過(guò)人工雜交得到的新魚(yú)種。血鸚鵡和花羅漢可愛(ài)、活潑、逗趣，外型令人喜愛(ài)，成為熱帶魚(yú)的主流。由于其親本的多樣性，血鸚鵡和花羅漢也表現(xiàn)出很大的多樣性和不確定性。

與血鸚鵡相關(guān)的麗體魚(yú)屬(Cichlasoma)已報(bào)告14個(gè)物種的111條基因條形碼。大部分血鸚鵡為紫紅火口(Paraneetroplussynspilus)♀×橘色雙冠麗魚(yú)(Amphilophuscitrinellus)♂，其COI序列與紫紅火口、胭脂火口(Viejamaculicauda)、黑帶鯛(Paraneetroplusmaculicauda)、金孔雀(Viejamelanura)以及紅頭麗體魚(yú)(Viejasynspila)的同源性大于99%。因此，難以進(jìn)行DNA條形碼的鑒別。

花羅漢的親本關(guān)系比血鸚鵡更加復(fù)雜，因此也有更多的不確定性。目前有關(guān)花羅漢的基因序列很少見(jiàn)，也沒(méi)有基因條形碼的數(shù)據(jù)。因此，無(wú)法應(yīng)用基因條形碼對(duì)花羅漢進(jìn)行分類。

2.6 DNA條形碼鑒別錦鯉

錦鯉(Cyprinuscarpio)是風(fēng)靡世界的高檔觀賞魚(yú)類，因其鮮艷似錦的色彩，變幻多姿的斑紋而得名。錦鯉由野生鯉魚(yú)演變而來(lái)。經(jīng)過(guò)數(shù)百年的培育，已經(jīng)培育出13大類共120多個(gè)品種[1]。至今已有大量錦鯉COI序列的數(shù)據(jù)，但這些序列的種間遺傳距離均小于1%，而且與赤棕鯉(C.rubrofuscus)、粗首馬口鱲(Opsariichthyspachycephalus)、烏鯉(Procyprismera)、藍(lán)黑鯪(Labeocalbasu)以及一些雜交鯉魚(yú)的遺傳距離均小于2%。顯然，這些種類無(wú)法依據(jù)DNA條形碼進(jìn)行區(qū)分。

2.7 DNA條形碼鑒別金魚(yú)

金魚(yú)(Carassiusauratus)是最早的觀賞魚(yú)類，也是中國(guó)特有的觀賞魚(yú)。金魚(yú)易于飼養(yǎng)，身姿奇異，色彩絢麗，形態(tài)優(yōu)美，深受世界各國(guó)人民的喜愛(ài)。在分類上屬鯉形目，鯉科(Cyprinidae)，鯽屬(Carassius)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培育，品種不斷優(yōu)化。金魚(yú)的演變體現(xiàn)了人類改良動(dòng)物所得到的神奇效果。根據(jù)金魚(yú)的主要變異特征可以將金魚(yú)分為金鯽、文魚(yú)、琉金、獅頭、絨球、珍珠鱗、龍晴、蝶尾、丹鳳、虎頭、水泡和望天等12個(gè)系列。雖然品系繁多，形態(tài)差異很大，但所有報(bào)告的金魚(yú)COI基因種間遺傳距離均小于1%，而且與銀鯽(C.gibelio)、蘭氏鯽(C.langsdorfii)等物種的相似性大于98.92%。因此，難以通過(guò)COI基因條形碼進(jìn)行鑒別。

2.8 DNA條形碼鑒別燈魚(yú)

燈魚(yú)是具有“小型”和“發(fā)光”特點(diǎn)的觀賞魚(yú)類的總稱，其體型嬌小，色彩豐富，性情溫順，喜歡成群結(jié)隊(duì)，是數(shù)量最多的熱帶觀賞魚(yú)。在分類上主要包括脂鯉目和鯉形目的一些魚(yú)類。大部分燈魚(yú)屬于脂鯉目，脂鯉科(Characidae)，已報(bào)告517個(gè)物種的7 847條基因條形碼，其中魮脂鯉屬(Hyphessobrycon)已報(bào)告58個(gè)物種的1 292條基因條形碼；半線脂鯉屬(Hemigrammus)已報(bào)告28個(gè)物種的328條基因條形碼。鯉形目的無(wú)須魮屬(Puntius)、波魚(yú)屬(Rasbora)、魚(yú)丹屬(Danio)和魮屬(Barbus)分別報(bào)告了60、43、24、22個(gè)物種的578、371、200、444條基因條形碼。

通過(guò)BOLD檢索發(fā)現(xiàn)，大部分燈魚(yú)通過(guò)DNA條形碼可以進(jìn)行有效鑒別。但也有一些種類的COI序列相同或相似。紅旗(Hyphessobryconeques)和黑幻旗(H.megalopterus)的DNA條形碼完全相同；小鰭魮脂鯉(Hyphessobryconmicropterus)與H.santae相同；日光燈(Paracheirodonaxelrodi)與紅蓮燈(P.innesi)完全相同；剛果燈魚(yú)(Phenacogrammusinterruptus)與黃金二線剛果燈(P.aurantiacus)、條紋斷線脂鯉(P.taeniatus)和巴勃小鮭脂鯉(Micralestescf.pabrensis)的同源性在99.39%以上。因此，這些燈魚(yú)無(wú)法通過(guò)DNA條形碼進(jìn)行區(qū)別。

2.9 DNA條形碼鑒別龍魚(yú)

龍魚(yú)是原產(chǎn)于東南亞的一種高價(jià)值觀賞魚(yú)，其體型雍容扁長(zhǎng)，軀干部覆蓋著排列整齊、光芒閃爍的碩大鱗片，嘴闊須長(zhǎng)，游動(dòng)時(shí)氣勢(shì)沉穩(wěn)威嚴(yán)，是最昂貴的觀賞魚(yú)。龍魚(yú)屬于骨舌魚(yú)目，骨舌魚(yú)科(Osteoglossidae)，已報(bào)告7個(gè)物種的138條基因條形碼，包括最常見(jiàn)的亞洲龍魚(yú)(Scleropagesformosus)、珍珠龍(S.jardinii)和銀龍(Osteoglossumbicirrhosum)等各種龍魚(yú)。這些龍魚(yú)的COI基因遺傳距離大于2%，因此可以通過(guò)DNA條形碼進(jìn)行有效區(qū)分。但亞洲龍魚(yú)包括青龍、紅龍和金龍等形態(tài)差異較大的品系，其中紅龍品系又可分為辣椒紅龍、血紅龍和橙紅龍3個(gè)品種，金龍品系也可分為紅尾金龍和過(guò)背金龍2個(gè)品種，通過(guò)測(cè)定這些不同品系的龍魚(yú)的COI、Cyt B基因序列，可知這些品系間的遺傳距離均小于1%(另文報(bào)告)，因此，難以通過(guò)DNA條形碼進(jìn)行有效鑒別。

2.10 DNA條形碼鑒別孔雀魚(yú)

孔雀魚(yú)又被稱為彩虹魚(yú)，有著非常漂亮的尾巴，體小玲瓏，體色斑斕多彩，活潑好動(dòng)，經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)代的人工改良和繁殖，已有幾百個(gè)品系，成為熱帶魚(yú)中最為人們喜愛(ài)的觀賞魚(yú)之一?？兹隔~(yú)屬于鯉齒目，花鳉科(Poecillidae)，花鳉屬(Poecilia)。根據(jù)國(guó)際比賽中的規(guī)定，大致可分為草尾、馬賽克、禮服、單色、蛇紋、劍尾、白子、特殊尾型等幾大類。雖然種類繁多，形態(tài)差異很大，但很多孔雀魚(yú)的COI序列差異很小。如秀美花鳉(Poeciliaformosa)與墨西哥帆鳉(P.mexicana)、茉莉花鳉(P.latipinna)、吉氏花鳉(P.gillii)、薩爾瓦多花鳉(P.salvatoris)、奧氏花鳉(P.orri)、黑花鳉(P.sphenops)、特里薩花鳉(P.teresae)的相似性均大于98%。其他一些人工繁育的孔雀魚(yú)品種的遺傳距離更小。因此，DNA條形碼在鑒定孔雀魚(yú)時(shí)也有很多局限性。

2.11 DNA條形碼鑒別魟魚(yú)

魟魚(yú)又稱魔鬼魚(yú)，大部分為海水魟魚(yú)。近年來(lái)淡水魟魚(yú)因其具有圓盤、長(zhǎng)尾等迥異于一般魚(yú)類的特殊外形，以及以形如翅膀狀的胸鰭通過(guò)波浪狀的擺動(dòng)方式來(lái)游動(dòng)，如同在水中飛翔一樣美麗的身姿，得到觀賞魚(yú)愛(ài)好者的喜愛(ài)。目前最流行的江魟科(Potamotrygonidae)已報(bào)告12個(gè)物種的106條基因條形碼。這些魟魚(yú)可以通過(guò)DNA條形碼進(jìn)行有效區(qū)分。除了野生種類，通過(guò)人工雜交得到的魟魚(yú)新品種越來(lái)越多，包括珍珠魟、黑白魟、金點(diǎn)魟、豹魟、黑白滿天星魟、黑帝王魟、帝王魟等。目前針對(duì)這些人工繁育的魟魚(yú)，很少有基因鑒別的報(bào)告。

2.12 DNA條形碼鑒別鼠魚(yú)

鼠魚(yú)嘴巴旁邊長(zhǎng)著兩撮可愛(ài)的小胡須，酷似水中游動(dòng)的小老鼠，因而被稱為“鼠魚(yú)”。鼠魚(yú)屬于鯰形目，美甲鯰科(Callichthyidae)的兵鯰屬(Corydoras)、盾皮鮠屬(Aspidoras)和弓背鯰屬(Brochis)，至今已記錄150余種。在BOLD SYSTEMS，美甲鯰科已收錄115個(gè)物種的1 108條基因條形碼，其中兵鯰屬(Corydoras)已收錄90個(gè)物種的819條基因條形碼。目前大多數(shù)鼠魚(yú)來(lái)自野生自然環(huán)境，人工繁殖種類較少。因此，DNA條形碼可以鑒別大部分鼠魚(yú)。檢索結(jié)果表明，熒光綠鼠(Corydorasaeneus)、阿卡西鼠(C.agassizii)、頑皮豹(C.ambiacus)、短兵鯰(C.brevirostris)、康帝斯鼠(C.condiscipulus)、戴維鼠魚(yú)(C.davidsandsi)、黑金紅頭鼠魚(yú)(C.duplicareus)、紳士鼠(C.elegans)、皇冠黑珍珠鼠(C.haraldschultzi)、茉莉豹鼠(C.julii)、側(cè)兵鯰(C.latus)、黑點(diǎn)兵鼠(C.melanistius)、藍(lán)鼠(C.nattereri)、暗鰭兵鯰(C.orphnopterus)、白棘豹鼠(C.pulcher)、紅黑帶鼠(C.rabauti)、大花網(wǎng)鼠(C.reticulatus)、飛鳳鼠(C.robineae)、長(zhǎng)吻紅翅帝王鼠(C.seussi)、一間鼠(C.virginiae)等22種兵鯰的遺傳距離大于3%，均可以有效區(qū)分。由于還有很多鼠魚(yú)沒(méi)有基因條形碼的數(shù)據(jù)，因此該技術(shù)鑒定其他鼠魚(yú)的效果還有待進(jìn)一步研究。

3 討論

目前大多數(shù)觀賞魚(yú)主要依據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類。由于魚(yú)類的體色、斑紋等形態(tài)特征很容易受其生長(zhǎng)環(huán)境的影響，因此不同地區(qū)、不同水域生活的同一種魚(yú)類可能表現(xiàn)出形態(tài)上的巨大差異，而被命名為不同的物種，但這些魚(yú)類的基因序列并沒(méi)有發(fā)生足夠大的分化，其中有一些種類可以在自然條件下進(jìn)行雜交并繁育后代，也表明這些魚(yú)類尚未進(jìn)化為獨(dú)立的物種。Mohd-Shamsudin等[10]研究表明龍魚(yú)的體色變化與COI或Cyt B基因分化程度沒(méi)有關(guān)系，無(wú)法根據(jù)這兩個(gè)基因來(lái)確定龍魚(yú)的品種。Mu等[11]發(fā)現(xiàn)三個(gè)品種的亞洲龍魚(yú)的12S rRNA、16S rRNA和COX3基因序列發(fā)生了顯著的遺傳分化，但因?yàn)檫z傳距離較小，這些分子標(biāo)記不適用于品種之間的鑒別。Decru等[12]對(duì)206種通過(guò)形態(tài)學(xué)識(shí)別的物種的COI序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有26.1%的物種間遺傳距離小于1，表明依據(jù)形態(tài)學(xué)分類可能存在錯(cuò)誤。Dirk Steinke等[13]鑒定了391種觀賞魚(yú)，超過(guò)98%的種類可以依據(jù)COI序列進(jìn)行有效區(qū)分。但背紋雙鋸魚(yú)(Amphiprionakallopisos)等3種小丑魚(yú)、多帶蝴蝶魚(yú)(Chaetodonmulticinctus)等2種蝴蝶魚(yú)以及黃高鰭刺尾魚(yú)(Zebrasomaflavescens)等 2種高鰭刺尾魚(yú)的序列高度相似，遺傳距離小于0.3%。因此，雖然目前的觀賞魚(yú)種類很多，但可能存在分類過(guò)細(xì)、同物異名的現(xiàn)象。由于DNA條形碼技術(shù)主要依據(jù)COI基因序列，因此有相當(dāng)一部分觀賞魚(yú)難以用DNA條形碼進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。針對(duì)這些近緣物種，需要研究進(jìn)化更快的基因作為DNA條形碼，或建立其他的分子生物學(xué)方法。Overdyk等[14]建立了實(shí)時(shí)PCR方法，可以特異性識(shí)別鯡形白鮭(Coregonusclupeaformis)的幼體，并可在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。

隨著人類對(duì)觀賞魚(yú)新、奇、特的不斷追求和生物改良技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步，出現(xiàn)了越來(lái)越多人工改良的觀賞魚(yú)品系或物種。實(shí)際上由于野生觀賞魚(yú)數(shù)量有限，目前絕大多數(shù)觀賞魚(yú)都來(lái)自人工繁育。雖然這些觀賞魚(yú)色彩斑斕、千姿百態(tài)，其欣賞價(jià)值甚至超過(guò)野生品種，但由于其形態(tài)特征尚未形成穩(wěn)定的遺傳特性，表現(xiàn)在基因序列的分化很小，或者很不穩(wěn)定?；驐l形碼技術(shù)要求物種間COI基因的遺傳距離大于2%才能準(zhǔn)確定種。顯然大多數(shù)人工繁育的觀賞魚(yú)品系之間的遺傳分化很難達(dá)到該水平，因此目前的基因條形碼不能適用于這些觀賞魚(yú)的鑒別。

經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，BOLD SYSTEMS已經(jīng)收錄了大部分魚(yú)類的基因條形碼，但由于完整的DNA條形碼需要提供地理分布等信息，而大部分野生觀賞魚(yú)均來(lái)自非洲、南美洲等經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)，有很多觀賞魚(yú)尚無(wú)DNA條形碼數(shù)據(jù)，因而影響了條形碼的分辨率。此外，研究表明，只有生態(tài)學(xué)家、分類學(xué)家、分子生物學(xué)家和地球科學(xué)家等科學(xué)團(tuán)隊(duì)的技術(shù)和研究的結(jié)合，才能從空間、時(shí)間和形式等方面解決魚(yú)類物種演化的復(fù)雜性[15]。因此，基因技術(shù)還應(yīng)該與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法相結(jié)合，才能對(duì)觀賞魚(yú)種類進(jìn)行綜合鑒定。

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Application analysis of DNA barcoding technology in the identification of main ornamental fish species

CHEN Xinzhong，GUO Shulin，GONG Yanqing

(Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，China)

In recent years，the international trade in ornamental fishes has grown rapidly.The traditional identification methods based mainly on fish morphology，color and pattern characteristics was difficult to identify fish species because these characteristics were easily affected by age，environment，culture conditions and other factors in many fishes，especially the eggs and larvae that had the similar morphological characteristics and the large number of species involved.DNA barcoding，the analysis of sequence diversity in a standardized gene region，has gained considerable validation as a tool for species identification and discovery.In this report，the DNA barcoding and gene sequence of koi，goldfish，cichlids，angelfish，discus，blood parrot cichlid，flower horn，dragon fish，bellyfish，ratfish，stingray fish and other ornamental fishes had been retrieved in GenBank and BOLD SYSTEMS database.The interspecific genetic distance had been calculated by using MEGA software and the similar sequences had been searched in BOLD SYSTEMS to study the application of DNA barcode to identify the main ornamental fish species.The results showed that this technology could effectively identify the most ornamental fish species，but it was difficult to obtain accurate identification on a wide variety of cichlid and guppies which had closer genetic relationship.The golden arowana，red arowana which belong to the subspecies of Asian arowana，and the artificial breeding fishes such as different strains of koi，goldfish，fairy fish，discus，blood parrot and flower horn also could not be identified through the COI barcoding.It is necessarily to study other molecular methods.

ornamental fishes；DNA barcoding；species identification；application.

2016-11-29

福建省科技廳農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性項(xiàng)目(2015N0015).

陳信忠(1964-)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué).Tel：13328766299.E-mail：chenxz@xmciq.gov.cn

S917.4，Q179

A

1006-5601(2017)01-0008-07