李曉姝，張霖，高大成，師文靜，樊亞超

（中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，遼寧 撫順113001）

發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究進(jìn)展

李曉姝，張霖，高大成，師文靜，樊亞超

（中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，遼寧 撫順113001）

1,3-丙二醇是一種重要的化合物，近年來(lái)由于其用途的不斷拓寬而越來(lái)越受到廣泛重視。生物合成法生產(chǎn)1,3-丙二醇具有綠色高效、使用可再生能源等特點(diǎn)，是目前最具前景的生產(chǎn)方式。本文從發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化和精制提純幾個(gè)方面對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了介紹。提出為使生物法生產(chǎn)1,3-丙二醇在成本上與化學(xué)法相比更具優(yōu)勢(shì)，在提高產(chǎn)量的同時(shí)應(yīng)該引入新技術(shù)、新手段對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行強(qiáng)化，使得過(guò)程更加精準(zhǔn)且易于控制；同時(shí)指出綜合考慮經(jīng)濟(jì)性與能耗問(wèn)題，對(duì)發(fā)酵與分離的全過(guò)程進(jìn)行整合，是今后發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的研究重點(diǎn)。

1,3-丙二醇；發(fā)酵；生物轉(zhuǎn)化；甘油

1,3-丙二醇（1,3-PD）是一種重要且用途廣泛的化工原料，其與對(duì)苯二甲酸聚合合成的聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯（PTT），是一種性質(zhì)優(yōu)良的聚酯材料。目前1,3-PD的合成方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種?；瘜W(xué)合成法的工藝條件較為苛刻，反應(yīng)的選擇性差，副產(chǎn)物較多，且產(chǎn)品精制難度大，高品質(zhì)1,3-PD產(chǎn)品提純困難。這些都嚴(yán)重限制了化學(xué)法合成1,3-PD的進(jìn)一步應(yīng)用[1-2]。微生物發(fā)酵法制備1,3-PD有著反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)。2014年1,3-PD全球市場(chǎng)容量為3.1億美元，預(yù)計(jì)到2021年達(dá)到6.2億美元，平均年復(fù)合增長(zhǎng)率為10.4%。下游產(chǎn)品中合成PTT是1,3-PD最主要的應(yīng)用，占據(jù)了接近市場(chǎng)90%的份額[3-4]。隨著1,3-PD的應(yīng)用范圍不斷拓寬，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求不斷增大。因此，尋找低成本、低能耗、高轉(zhuǎn)化率的1,3-PD生產(chǎn)方法，將具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本文就1,3-PD的應(yīng)用、發(fā)酵菌種、發(fā)酵方式、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化和精制提純幾個(gè)方面進(jìn)行了綜述。

1 1,3-PD的應(yīng)用

1,3-PD是一種無(wú)色、無(wú)味的黏稠液體，可溶于水、醇、醚等多種溶劑。1,3-PD本身作為一種特殊的化合物可以用作保護(hù)劑、溶劑、抗凍劑。作為化工原料，在食品領(lǐng)域可以作為調(diào)味劑、增稠劑、吸濕劑等[5-6]，也可以用于化妝品、樹(shù)脂、黏合劑、洗滌劑等產(chǎn)品的合成。1,3-PD是一種有機(jī)合成的重要中間物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于各種藥品、殺蟲(chóng)劑、芳香劑等[7-8]；參與聚合反應(yīng)時(shí)1,3-PD能表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，但1,3-PD的高制備成本和下游市場(chǎng)開(kāi)發(fā)一度是限制其應(yīng)用的兩個(gè)主要因素。隨著1,3-PD作為聚酯單體的商業(yè)化應(yīng)用，尤其是聚酯材料PTT的廣泛需求，1,3-PD開(kāi)始展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域和巨大的商業(yè)價(jià)值。PTT作為一種新型聚酯，用途十分廣泛，可以作為熱塑性工程塑料、薄膜和涂料[9]。此外，其最主要的用途是用來(lái)生產(chǎn)毛毯和紡織品纖維，這種纖維因其回彈性好、染色牢固、抗著色污染性能好、抗靜電以及良好的生物降解性而越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。

2 發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD的研究進(jìn)展

2.1 發(fā)酵菌種

1,3-丙二醇的生產(chǎn)菌種來(lái)源主要包括自然界分離的野生菌及基因工程構(gòu)建菌。其中對(duì)于野生菌種的研究主要是利用物理化學(xué)手段對(duì)菌種進(jìn)行誘變和篩選，基因工程菌的構(gòu)建主要是利用基因工程手段對(duì)野生菌或本身不能進(jìn)行甘油和1,3-PD代謝生產(chǎn)的其他菌種進(jìn)行改造。

2.1.1 甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,3-丙二醇的代謝途徑

甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,3-PD是通過(guò)氧化和還原兩個(gè)途徑進(jìn)行的[10-11]。氧化途徑的主要步驟：首先通過(guò)甘油脫氫酶將甘油氧化為2-羥基丙酮（DHA）；之后，DHA在2-羥基丙酮激酶作用下生成磷酸二羥丙酮（DHAP）；DHAP進(jìn)一步被氧化生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)而再代謝生成乙酸、乳酸等副產(chǎn)物，丙酮酸代謝過(guò)程同時(shí)產(chǎn)生ATP和NADH，一方面為細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝提供能量，另一方面為還原途徑中產(chǎn)物1,3-PD的合成提供足夠的還原力。還原途徑有2步酶反應(yīng)：①甘油脫水酶將甘油轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛（3-HPA）；②由1,3-丙二醇氧化還原酶將3-HPA還原生成1,3-PD，該過(guò)程需要消耗NADH。

甘油轉(zhuǎn)化1,3-PD過(guò)程的關(guān)鍵酶主要有：甘油脫水酶（GDHt）、甘油脫氫酶（GDH）、1,3-PD氧化還原酶、2-羥基基丙酮激酶（DHAK）和丙酮酸脫氫酶系（PDH）等[12]。其中甘油脫水酶是還原途徑的限速酶，需要在VB12的輔助下才能進(jìn)行有效催化。

2.1.2 菌種的篩選與馴化

已知自然界生產(chǎn)1,3-PD的菌種中，丁酸梭菌的甘油脫水酶可以不依賴(lài)于輔酶VB12，而克雷伯氏菌具有較高的底物甘油耐受力和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，是受到較多關(guān)注的兩種菌[13]。王揚(yáng)等[14]以克雷伯氏菌為出發(fā)菌，利用紫外誘變及亞硝基胍和超聲協(xié)同處理獲得1,3-PD高產(chǎn)突變株，發(fā)酵產(chǎn)量提高了38.64%。文獻(xiàn)[15]報(bào)道利用大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體對(duì)克雷伯氏菌進(jìn)行誘變，并對(duì)誘變菌進(jìn)行馴化，獲得的突變株間歇發(fā)酵產(chǎn)量比野生菌提高43%。朱曉麗等[16]也作了類(lèi)似研究，在使用LiCl與大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體復(fù)合誘變后，突變株的l,3-PD產(chǎn)量和摩爾轉(zhuǎn)化率為70.2g/L和57.6%，比出發(fā)菌分別提高24.9%和17.7%。突變株對(duì)粗甘油耐受良好，利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)1,3-PD水平與原始菌株利用精甘油發(fā)酵的水平相當(dāng)。ZHOU等[17]從海洋中分離出一株克雷伯氏菌，該菌株發(fā)酵產(chǎn)1,3-PD終濃度可達(dá)80.08g/L，且具有良好的耐鹽、耐有機(jī)酸特性。REIMANN等[18]利用亞硝基胍對(duì)丁酸梭菌進(jìn)行誘變，再經(jīng)耐高滲與質(zhì)子自殺手段對(duì)獲得的突變株進(jìn)行篩選，補(bǔ)料批式發(fā)酵結(jié)果表明產(chǎn)物1,3-PD終濃度達(dá)70g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.4g/L/h，大大縮短了發(fā)酵時(shí)間。采用物理化學(xué)手段對(duì)自然菌進(jìn)行誘變篩選是傳統(tǒng)且較為成熟的育種手段，其優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)相對(duì)成熟，菌種的遺傳穩(wěn)定性較好，但對(duì)于改造目標(biāo)的定向性較差。

2.1.3 菌種的基因工程改造

由于甘油轉(zhuǎn)化1,3-PD轉(zhuǎn)化率的限制（理論上轉(zhuǎn)化率最高為72%），發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的成本受到一定影響。為了提高生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，獲得在轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物量、生產(chǎn)強(qiáng)度等方面更具優(yōu)勢(shì)的菌種，科學(xué)家們開(kāi)始對(duì)現(xiàn)代基因技術(shù)聚焦。早期基因工程菌的構(gòu)建常選用以大腸桿菌為代表的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的微生物作為表達(dá)宿主。隨著研究的深入和基因構(gòu)建技術(shù)的不斷發(fā)展，直接利用1,3-PD生產(chǎn)菌種作為表達(dá)宿主，對(duì)其代謝途徑進(jìn)行改造的路線(xiàn)漸受關(guān)注，從而將傳統(tǒng)育種方式與先進(jìn)基因工程技術(shù)相結(jié)合。陳利飛等[19]通過(guò)敲除克雷伯氏菌產(chǎn)乳酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶基因（1dhA），使獲得的基因工程菌株副產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量由原來(lái)的10.16g/L降為0.49g/L，而1,3-PD的產(chǎn)量和甘油轉(zhuǎn)化率提高到85.76g/L和65.97%，分別提高了8.79%和5.33%。副產(chǎn)物積累量的降低不僅提高了碳源的轉(zhuǎn)化效率，對(duì)下游分離的成本降低也有一定貢獻(xiàn)。劉陳才等[20]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)某些生長(zhǎng)基因時(shí)克雷伯氏菌的生物量、甘油轉(zhuǎn)化率和1,3-PD產(chǎn)量有所提高，表明刺激菌體生長(zhǎng)與提高目標(biāo)產(chǎn)物的積累成正相關(guān)。付曉萌等[21]將大腸桿菌中的木糖異構(gòu)酶基因引入克雷伯氏菌中，利用重組菌發(fā)酵的1,3-PD產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了20%。木糖異構(gòu)酶基因的表達(dá)提高了細(xì)胞內(nèi)還原力NADH，從而促進(jìn)了產(chǎn)物的生成。

2,3-丁二醇是1,3-PD發(fā)酵過(guò)程一種主要副產(chǎn)物，由于與產(chǎn)物的沸點(diǎn)接近，增加了下游分離的難度，因此對(duì)高純1,3-PD的獲得造成一定困難。乙酰乳酸合酶缺陷的克雷伯氏菌突變株由于在甘油代謝中存在缺陷無(wú)法生產(chǎn)1,3-丙二醇或2,3-丁二醇[22]。LEE等[23]將Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶（pdc）和醛脫氫酶（aldB）基因引入乙酰乳酸合酶缺陷的克雷伯氏菌突變株中，異源表達(dá)pdc和aldB有效地恢復(fù)了突變株的甘油代謝，發(fā)現(xiàn)該菌株的甘油代謝受中間代謝物丙酮酸的影響，通過(guò)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇，實(shí)現(xiàn)了2,3-丁二醇的產(chǎn)量最小化，同時(shí)強(qiáng)化了1,3-PD的生產(chǎn)。2,3-丁二醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化是由乙偶姻還原酶（AR）催化完成的，WU等[24]通過(guò)在K. pneumoniaeCF中插入甲酸脫氫酶基因使得AR產(chǎn)生了失活變異。AR的失活和甲酸脫氫酶的表達(dá)降低了2,3-丁二醇的生成，同時(shí)提高了1,3-PD的產(chǎn)量。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，甘油到1,3-PD的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0. 74mol/mol，高于理論值。5L批式發(fā)酵的產(chǎn)物終濃度和轉(zhuǎn)化率分別為72.2g/L和0. 569mol/mol，2,3-丁二醇和甲酸濃度分別降低了52.2%和73. 4%。

為了從原料價(jià)格上進(jìn)一步提升生物法生產(chǎn)1,3-PD的競(jìng)爭(zhēng)力，有研究者將目標(biāo)轉(zhuǎn)向廉價(jià)的碳源，如葡萄糖。LIANG等[25]通過(guò)將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的3-磷酸甘油脫氫酶（gpd1）和3-磷酸甘油磷酸化酶（gpp2）基因引入大腸桿菌（E. coli），同時(shí)表達(dá)來(lái)自克雷伯氏菌的dha操縱子，構(gòu)建了一株可以直接利用葡萄糖生產(chǎn)1,3-丙二醇的大腸桿菌工程菌，該菌株發(fā)酵的中間代謝物積累量小，副產(chǎn)物濃度較低。饒志明等[26]將獲得的來(lái)源于克雷伯氏菌的甘油脫水酶基因dhaB和來(lái)源于大腸桿菌的1,3-丙二醇氧化還原酶同工酶基因yqhD，分別與載體PGAPZB連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PGAPZB-dhaB和PGAPZB-yqhD，同時(shí)構(gòu)建載體pYX212-zeocin；并進(jìn)一步構(gòu)建了釀酒酵母的游離型表達(dá)載體YX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB，首次成功實(shí)現(xiàn)基因yqhD和dhaB串聯(lián)后在釀酒酵母中表達(dá)。美國(guó)DuPont公司和Genencor公司開(kāi)發(fā)構(gòu)建了以大腸桿菌為宿主的基因工程菌，可以發(fā)酵葡萄糖轉(zhuǎn)化為高濃度的1,3-PD[27]，但1,3-PD生產(chǎn)成本較高的問(wèn)題卻仍難以解決。1,3-PD的高濃度生產(chǎn)取決于菌種對(duì)底物和產(chǎn)物的耐受力，取決于副產(chǎn)物量的降低和轉(zhuǎn)化率的提高，取決于發(fā)酵過(guò)程的還原力與代謝流的整體平衡。因此，高產(chǎn)菌種的獲得需要多種手段的系統(tǒng)改造和多種技術(shù)的高效集成。

2.2 發(fā)酵方式

微生物生產(chǎn)過(guò)程中，不同的發(fā)酵方式和條件，對(duì)菌種的代謝流以及遺傳進(jìn)化會(huì)有一定的定向誘導(dǎo)作用，其所需要的設(shè)備形式、能耗物耗、控制條件也有較大差異。目前，1,3-PD生產(chǎn)的發(fā)酵方式主要有批次發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、固定化和混合菌發(fā)酵等，下面對(duì)這幾種發(fā)酵方式的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

2.2.1 批次發(fā)酵

批次發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的利用效率較高，產(chǎn)物濃度高，工藝操作簡(jiǎn)單，但生產(chǎn)效率相對(duì)較低。因此，為提高1,3-PD生產(chǎn)強(qiáng)度，進(jìn)一步提高產(chǎn)量，可以采用補(bǔ)料批式發(fā)酵方式。薛學(xué)東等[28]通過(guò)甘油的流加來(lái)控制菌體比生長(zhǎng)速率，發(fā)現(xiàn)菌體比生長(zhǎng)速率控制較高時(shí)，甘油的比消耗速率隨之提高，同時(shí)可減少副產(chǎn)物的生成。WILKENS等[29]利用丁酸梭菌（Clostridium butyricumAKR102a）在1L和200L規(guī)模分別進(jìn)行了補(bǔ)料批式發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD。1L發(fā)酵使用精甘油為原料，產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度分別在93.9g/L和3.3g/L/h，1L發(fā)酵采用粗甘油為原料，產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度分別在76.2g/L和2.3g/L/h，利用粗甘油200L規(guī)模發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度分別在61.5g/L和2.1g/L/h。這是因?yàn)榇指视驮现械闹舅?、重金屬離子以及鹽類(lèi)等雜質(zhì)的存在對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定抑制和毒害作用。另有文獻(xiàn)[30]報(bào)道在非無(wú)菌條件下，利用粗甘油為原料脈沖式補(bǔ)料批式發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD，發(fā)酵87h產(chǎn)物終濃度可達(dá)到67.9g/L。

2.2.2 連續(xù)發(fā)酵

連續(xù)發(fā)酵是指物料以一定速度流入和流出發(fā)酵罐，使得罐內(nèi)各物質(zhì)濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定的發(fā)酵方式。相對(duì)于批次發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵無(wú)需頻繁滅菌、配料、清洗及種子培養(yǎng)等，因此可以節(jié)省大量的輔助操作時(shí)間。連續(xù)發(fā)酵最重要的操作參數(shù)是稀釋率（D）。一定條件下，隨著D的增加，產(chǎn)物濃度降低，同時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度增大。

賀璐等[31]對(duì)1,3-PD發(fā)酵進(jìn)行了多級(jí)連續(xù)發(fā)酵考察，采用單級(jí)連續(xù)發(fā)酵，二級(jí)連續(xù)發(fā)酵和三級(jí)連續(xù)發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物1,3-PD的濃度分別為37.08g/L，68.11g/L和67.73g/L。其中二級(jí)連續(xù)發(fā)酵的1,3-PD生產(chǎn)強(qiáng)度是1.89g·(L·h)–1，認(rèn)為二級(jí)連續(xù)發(fā)酵是較優(yōu)的方式。有文獻(xiàn)[32]報(bào)道采用丁酸梭菌VPI 3266連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD，產(chǎn)物的生產(chǎn)強(qiáng)度最高達(dá)到了10.3g·(L·h)–1。丁酸梭菌合成1,3-PD的過(guò)程中甘油脫水酶不依賴(lài)價(jià)格昂貴的輔酶VB12，從生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性考慮，可以顯著降低1,3-PD的生產(chǎn)成本。通常消除產(chǎn)物抑制的途徑是把產(chǎn)物從發(fā)酵液中移除，連續(xù)發(fā)酵可以有效解決產(chǎn)物抑制問(wèn)題，故生產(chǎn)強(qiáng)度較高，但由于高補(bǔ)料及發(fā)酵液移出率，產(chǎn)物濃度較低，后續(xù)分離提取負(fù)荷較大。連續(xù)發(fā)酵中細(xì)胞可以懸浮于發(fā)酵液中，也可以固定于反應(yīng)器中。

2.2.3 固定化發(fā)酵

細(xì)胞固定化是在酶固定化的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。固定化細(xì)胞發(fā)酵可以重復(fù)利用細(xì)胞，在高細(xì)胞濃度下連續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，且發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞不受剪切效應(yīng)的影響，單位容積下能夠獲得高產(chǎn)率（生產(chǎn)強(qiáng)度高），同時(shí)發(fā)酵液中菌體含量少，有利于產(chǎn)品的分離純化。但固定化發(fā)酵過(guò)程中，載體亦會(huì)存在擴(kuò)散限制作用，即載體形成的孔隙大小一定程度上會(huì)影響底物的通透性。

文獻(xiàn)[33]以粗甘油為原料，固定化發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD，采用了3種不同的固定材料，即不銹鋼絲、玻璃拉西環(huán)和陶瓷泡沫過(guò)濾材料，發(fā)現(xiàn)以不銹鋼絲作為固定材料時(shí)，1,3-PD的生產(chǎn)強(qiáng)度最高，達(dá)到了4.8g/L/h，以玻璃拉西環(huán)作為固定材料時(shí)產(chǎn)物濃度最高，達(dá)到了17.9g/L。楊博等[34]采用生物膜固定化發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD，在發(fā)酵罐外連通填充有纖維載體的生物膜反應(yīng)器，利用克雷伯氏菌細(xì)胞自身形成的生物膜固定于纖維床反應(yīng)器中，取得了較好的發(fā)酵效果。GONEN等[35]利用拜氏梭菌，以粗甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD，分別采取固定化和懸浮混合兩種連續(xù)發(fā)酵方式，固定化發(fā)酵使用玻璃材料作為固定材料。研究結(jié)果表明前者的生產(chǎn)強(qiáng)度和操作穩(wěn)定性均高于后者。GUNGORMUSLER等[36]也得到了類(lèi)似結(jié)論，認(rèn)為相對(duì)于懸浮發(fā)酵，固定化發(fā)酵的穩(wěn)定性和生產(chǎn)強(qiáng)度更高，且需要的反應(yīng)器體積更小，減小了反應(yīng)器的投資成本，同時(shí)發(fā)現(xiàn)停留時(shí)間是影響反應(yīng)器性能的重要參數(shù)。

2.2.4 混合菌發(fā)酵

混合菌種發(fā)酵指發(fā)酵菌種中包含兩種或多種微生物的發(fā)酵過(guò)程。目前生產(chǎn)1,3-PD的混合發(fā)酵常以葡萄糖為底物，先用一種可利用葡萄糖的微生物（如酵母菌、腸道細(xì)菌等）將葡萄糖轉(zhuǎn)化為甘油，再供另一種可將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD的微生物利用轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)品。

這種混合菌發(fā)酵實(shí)際上是兩步發(fā)酵制備1,3-PD。郭玲等[37]以葡萄糖為底物，利用基因構(gòu)建大腸桿菌和克雷伯氏菌共發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD，發(fā)酵結(jié)果表明，在30L發(fā)酵罐中發(fā)酵68h，1,3-PD終濃度為24.09g/L，認(rèn)為混合菌發(fā)酵中不同階段條件的要求不同造成了發(fā)酵工藝難度較大。PACHAPUR等[38]利用E. aerogenesNRRL B-407和C. butyricumNRRL B-41122兩種微生物混合發(fā)酵，以生物柴油副產(chǎn)物粗甘油為底物生產(chǎn)1,3-PD和H2。以氫氣作為另一目標(biāo)產(chǎn)物，一定程度上提高了該過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，另外，氫氣易于從體系中分離，不需要額外的純化工序。該研究顯示了通過(guò)生產(chǎn)1,3-PD，整合生物柴油產(chǎn)品及提高生物柴油產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)性的可行性。有機(jī)酸是甘油發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的典型副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成均存在抑制作用。文獻(xiàn)[39]報(bào)道了利用混合菌C. butyricum和M. mazei發(fā)酵，C. butyricum發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PD時(shí)產(chǎn)生的70%以上的有機(jī)酸類(lèi)副產(chǎn)物可以被M. mazei利用而產(chǎn)生甲烷。研究結(jié)果表明，使M. mazei的代謝途徑最大化傾向甲烷生成且控制避免其過(guò)多的菌體量生長(zhǎng)是有利于從體系中移除具有毒害作用的有機(jī)酸的最佳培養(yǎng)條件。

2.3 發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化

工業(yè)微生物發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)于一定的菌種和發(fā)酵形式來(lái)說(shuō)，發(fā)酵過(guò)程的控制條件也是至關(guān)重要的，適宜的發(fā)酵條件可以使得菌種自身的特性得到最大限度的發(fā)揮。為了探索最優(yōu)化的控制條件，近年來(lái)學(xué)者們針對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、底物濃度控制、適宜pH、中和劑的選擇以及新技術(shù)在1,3-PD生產(chǎn)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了研究，其中間歇發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制研究較多。

鄭宗明等[40]通過(guò)考察pH對(duì)克雷伯氏菌關(guān)鍵酶酶活的影響，發(fā)現(xiàn)偏酸性的發(fā)酵條件和對(duì)數(shù)期維持一定的底物濃度可以促進(jìn)1,3-PD的合成。董曉宇等[41]通過(guò)大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體預(yù)處理克雷伯氏菌接種體后搖瓶發(fā)酵，結(jié)果表明，等離子體處理4min組在6%甘油發(fā)酵中1,3-PD產(chǎn)量最大，達(dá)到17.2g/L。等離子體誘變使菌體細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)；同時(shí)改變了關(guān)鍵代謝酶的酶活，因此菌體合成產(chǎn)物的能力得到強(qiáng)化。但是甘油代謝生產(chǎn)1,3-PD過(guò)程中三種關(guān)鍵酶比活性增加程度不同，表明等離子體對(duì)每種酶在基因水平或蛋白水平誘導(dǎo)效應(yīng)是不同的，還需要今后進(jìn)一步研究。WOJTUSIK等[42]以克雷伯氏菌Klebsiella oxytocaNRRL-B199發(fā)酵甘油產(chǎn)1,3-PD，發(fā)現(xiàn)甘油和磷酸鹽濃度對(duì)生物量和產(chǎn)物量的影響較大，其他因素，如鎂離子含量和K : Na對(duì)于生物量和產(chǎn)物濃度影響較??；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中，采用變化的攪拌速率（從50～100r/min）和37℃恒定溫度條件下，甘油轉(zhuǎn)化率和1,3-PD產(chǎn)量均有所增加。宋志遠(yuǎn)等[43]通過(guò)對(duì)1,3-PD發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的分析，建立了底物流加量與生物量和堿液消耗量間的函數(shù)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中底物濃度的精確控制。黃金海等[44]根據(jù)建立的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，將甘油流加速率與堿液流加速率和發(fā)酵時(shí)間相耦聯(lián)，提出了甘油的自動(dòng)流加策略并搭建了自動(dòng)流加裝置。文獻(xiàn)[45]報(bào)道了丁酸梭菌Clostridium butyricumVPI 1718利用菜籽粉水解物作為培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-PD，產(chǎn)物終濃度可達(dá)65.5 g/L，平均生產(chǎn)強(qiáng)度1.15g·(L·h)–1，近似等于以酵母膏為培養(yǎng)基組分時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度的2倍。菜籽粉水解物富含氨基酸、肽類(lèi)以及多種微量營(yíng)養(yǎng)素，是一種更加經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物，為降低發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的成本提供了又一思路。

3 1,3-丙二醇的精制提純

3. 1 發(fā)酵液性質(zhì)與預(yù)處理

1,3-PD發(fā)酵液體系中主要包括產(chǎn)物1,3-PD、有機(jī)酸、甘油、微生物菌體、無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、水及其他中間代謝產(chǎn)物等，是一個(gè)復(fù)雜的混合體系。由于國(guó)內(nèi)外發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的菌種及工藝不同，發(fā)酵液的性質(zhì)、副產(chǎn)物的種類(lèi)和濃度會(huì)有一定的差別。終止發(fā)酵液通常需要采用絮凝、過(guò)濾、離心等手段對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，將其中的微生物菌體、蛋白、核酸等大分子雜質(zhì)除去，得到澄清發(fā)酵液，以使后續(xù)的提純過(guò)程能夠順利進(jìn)行。

3.2 發(fā)酵液脫鹽、除雜

1,3-PD分子中含有兩個(gè)羥基，親水性較乙醇更強(qiáng)，同時(shí)1,3-PD的沸點(diǎn)高、黏度較大。在前期的提取工藝中很難將其與水分開(kāi)，因此應(yīng)盡量將發(fā)酵液中的雜質(zhì)去除，得到體系組成較為簡(jiǎn)單的發(fā)酵液。脫鹽過(guò)程去除的雜質(zhì)主要是發(fā)酵液中的有機(jī)鹽和無(wú)機(jī)鹽。1,3-PD發(fā)酵液脫鹽方法主要有電滲析法、離子交換法、有機(jī)溶劑萃取法、雙水相萃取法和鹽析法等。

電滲析法[46]是一種特殊的膜分離操作，在直流電場(chǎng)作用下，溶液中的離子選擇性地通過(guò)離子交換膜，所使用的膜只允許一種電荷的離子通過(guò)而將另一種電荷的離子截留。郝健等[47]采用電滲析法對(duì)1,3-丙二醇發(fā)酵液進(jìn)行脫鹽，發(fā)現(xiàn)1,3-PD損失與脫鹽所耗時(shí)間近似呈線(xiàn)性關(guān)系，耗時(shí)越長(zhǎng)1,3-PD損失越多，因此在電滲析操作中應(yīng)選用較高操作電壓以保持較短的耗時(shí)減少產(chǎn)物損失；同時(shí)發(fā)現(xiàn)絮凝處理可使發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量明顯減少，減輕膜的污染，從而提高脫鹽效率，當(dāng)離子交換膜連續(xù)重復(fù)使用15批次后性能下降明顯需要進(jìn)行清洗。文獻(xiàn)[48]報(bào)道了1,3-PD發(fā)酵液電滲析法脫鹽中試試驗(yàn)，結(jié)果表明流速越大產(chǎn)品1,3-PD的損失率也越大，在試驗(yàn)范圍內(nèi)選擇小流速（0.617cm/s）比較理想，在此流速下產(chǎn)品損失率小于5%。電滲析法可以有效脫除發(fā)酵液中的鹽分，過(guò)程中不使用酸堿和溶劑等，具有環(huán)境友好的特點(diǎn)，但發(fā)酵液除鹽過(guò)程中存在膜污染嚴(yán)重的問(wèn)題，膜的清洗、維護(hù)和更換頻繁，增加了操作成本。

離子交換法[49]是應(yīng)用離子交換劑與不同離子間結(jié)合力不同的原理將鹽分從發(fā)酵液中脫除的。侯志強(qiáng)等[50]分別采用6種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和3種陰離子交換樹(shù)脂處理1,3-丙二醇發(fā)酵液，結(jié)果表明，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中的D001-cc對(duì)發(fā)酵液的處理效果最好，電導(dǎo)率能降到2250μS/cm，3種陰離子交換樹(shù)脂中，D301R的去鹽效果最好。王領(lǐng)民等[51]利用離子交換耦聯(lián)電滲析工藝進(jìn)行了1,3-PD發(fā)酵液脫鹽的中試試驗(yàn)，結(jié)果表明耦聯(lián)后的兩步脫鹽工藝可以使產(chǎn)物損失率由單純使用電滲析法脫鹽時(shí)的11.41%，降低到5.88%，提高了生產(chǎn)效率。離子交換法的脫鹽效果較為理想，但樹(shù)脂再生時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量酸堿廢液，對(duì)廢水處理造成較大負(fù)荷。生產(chǎn)中可以考慮設(shè)計(jì)使用連續(xù)離子交換，降低廢水排放及酸堿的消耗量。

有機(jī)溶劑萃取法是利用醇、酮類(lèi)等有機(jī)溶劑對(duì)菌體、蛋白和鹽類(lèi)等的沉淀析出作用進(jìn)行分離的。徐育燁等[52]將1,3-PD發(fā)酵液離心或過(guò)濾得到清液，對(duì)清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮得到母液，按一定體積比在母液中加入C1～C4醇或C3～C5酮，降溫?cái)嚢柚烈欢囟葧r(shí)加入晶種，伴隨溫度降低，較大地增加了蛋白和鹽的析出量。有機(jī)溶劑萃取法在一定程度上簡(jiǎn)化工藝流程，但還存在脫鹽效果有限和后續(xù)的溶劑分離回用問(wèn)題。

雙水相萃取法是向發(fā)酵液中加入一定量的高聚物與無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)溶劑與無(wú)機(jī)鹽，使發(fā)酵液形成不互溶的兩相，利用1,3-PD與鹽類(lèi)等雜質(zhì)分別進(jìn)入不同相中而實(shí)現(xiàn)分離。修志龍等[53]在1,3-PD發(fā)酵液中直接加入可溶性無(wú)機(jī)鹽以及親水有機(jī)物（醇類(lèi)或酮類(lèi)）形成雙水相，從而達(dá)到萃取發(fā)酵液中1,3-PD的作用，免去了菌體分離步驟，雙水相體系對(duì)1,3-PD有較好的萃取效果，1,3-PD回收率大于86%。雙水相萃取的過(guò)程中，由于影響萃取分配的因素眾多且作用復(fù)雜，雜質(zhì)的分離并不完全，對(duì)終產(chǎn)品的純度會(huì)有一定影響。

鹽析法主要是利用在高濃度中性鹽存在下，固體溶質(zhì)在水中的溶解度降低產(chǎn)生沉淀而進(jìn)行分離。修志龍等[54]首先將1,3-PD發(fā)酵液用過(guò)濾、離心等手段將菌體除去，然后將清液蒸餾濃縮，再加入不同飽和度的硫酸銨，使溶液的離子強(qiáng)度增加，除去沉淀物后，再對(duì)清液進(jìn)行濃縮，進(jìn)一步將濃縮液中蛋白、多糖、核酸及部分有機(jī)鹽和無(wú)機(jī)鹽沉淀析出，最后進(jìn)行精餾提純，可獲得純度95%以上的1,3-PD產(chǎn)品。鹽析法對(duì)于蛋白質(zhì)、多糖、多肽等生物大分子的沉淀效果較好，但對(duì)于發(fā)酵液中的某些鹽分的脫除效果并不理想。

3.3 1,3-PD的精制

經(jīng)過(guò)前期一系列處理過(guò)程，1,3-丙二醇發(fā)酵液中通常還含有水、甘油、其他醇類(lèi)（如2,3-丁二醇）等。同時(shí)由于發(fā)酵所使用的原料（例如生物柴油副產(chǎn)物粗甘油）在其制備過(guò)程中會(huì)伴有少量副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物隨原料一同引入發(fā)酵過(guò)程中，含量雖少但組分復(fù)雜且難以去除，這無(wú)疑增加了高品質(zhì)1,3-PD產(chǎn)品提純的難度。

一般除鹽后的發(fā)酵液可以先經(jīng)過(guò)脫水濃縮后再進(jìn)行精制，常用的1,3-PD精制方法有精餾法和萃取法等。精餾是化工分離操作中廣泛使用的提純工藝，可以利用料液中各組分沸點(diǎn)不同而實(shí)現(xiàn)分離。杜邦公司[55]將離子交換處理后的1,3-丙二醇發(fā)酵液進(jìn)行4柱蒸餾，第1蒸餾柱除去多余的水，第2蒸餾柱中除去重雜質(zhì)、大部分甘油和殘?zhí)?，再?duì)柱頂餾分進(jìn)行加氫處理以改善1,3-PD的顏色（主要是脫除縮醛和其他羰基化合物、過(guò)氧化物等發(fā)色基團(tuán)），減少硫含量，從而提高1,3-PD在各種應(yīng)用中的性能，第3蒸餾柱進(jìn)一步除去料液在1號(hào)柱中未除盡的雜質(zhì)及2號(hào)柱加氫反應(yīng)的副產(chǎn)物等輕雜質(zhì)，4號(hào)柱除去剩余的重雜質(zhì)，最終獲得高純度的1,3-PD產(chǎn)品。精餾操作具有料液處理量大，產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)；但同時(shí)也存在能耗大、產(chǎn)品收率不高等問(wèn)題。

萃取法主要包括溶劑萃取、超臨界萃取和絡(luò)合萃取等。有專(zhuān)利[56]報(bào)道了采用己醇、磷酸三丁酯、油酸、大豆油等溶劑萃取發(fā)酵液中的1,3-PD，由于產(chǎn)物1,3-PD在有機(jī)相中的分配系數(shù)較低，過(guò)程中需要采取多級(jí)萃取的方式。文獻(xiàn)[57]報(bào)道了在表面活性劑存在下利用超臨界二氧化碳萃取發(fā)酵清液中的1,3-PD，通過(guò)表面活性劑的增溶作用，可以將極性的1,3-PD溶解而形成微乳或反膠團(tuán)，很好地分散在非極性的超臨界二氧化碳中，再通過(guò)膜分離將產(chǎn)物分離出來(lái)，1,3-PD的截留率大于95%。方云進(jìn)等[58]選取脂肪醇為萃取劑，烴類(lèi)物質(zhì)為稀釋劑，組成復(fù)合萃取劑直接對(duì)1,3-PD發(fā)酵液進(jìn)行接觸萃取，1,3-PD的萃取率大于93%，再經(jīng)過(guò)產(chǎn)品精餾，1,3-PD產(chǎn)品純度達(dá)99.5%以上。萃取過(guò)程常與精餾操作聯(lián)用以獲得更高的產(chǎn)物純度并回收萃取劑，通常萃取劑回收過(guò)程的能耗也較大。

4 結(jié)論與展望

發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD因其反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好而成為目前公認(rèn)的最具前景的生產(chǎn)方式，隨著1,3-PD下游產(chǎn)品應(yīng)用范圍的不斷拓廣，1,3-PD的市場(chǎng)容量迅速擴(kuò)大。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外通過(guò)對(duì)生物法生產(chǎn)1,3-PD的生產(chǎn)菌種、發(fā)酵方式、過(guò)程控制及提純精制的大量研究，該領(lǐng)域的諸多方面已經(jīng)取得了很大突破，但由于生物法1,3-PD的生產(chǎn)成本相較于化學(xué)法的優(yōu)勢(shì)并不突出，目前的研究多集中在實(shí)驗(yàn)室階段，生產(chǎn)的工業(yè)化放大仍然存在一些問(wèn)題有待解決。因此今后的研究可以從以下幾個(gè)方面重點(diǎn)入手。

（1）關(guān)于高產(chǎn)菌種的獲得，如何將基因工程手段與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，篩選出對(duì)底物耐受性好且副產(chǎn)少，產(chǎn)量高的優(yōu)異菌種；并且在提高產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率的同時(shí)保證菌種的遺傳穩(wěn)定性。

（2）引入新技術(shù)、新手段對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行強(qiáng)化，使得過(guò)程更加精準(zhǔn)且易于控制，能夠使菌種的特性達(dá)到最大限度的發(fā)揮。例如工程策略的深入研究，包括批次發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵（細(xì)胞固定、細(xì)胞懸?。⒍嗉?jí)發(fā)酵等。除此之外，數(shù)學(xué)模型設(shè)計(jì)對(duì)1,3-PD生產(chǎn)過(guò)程中的底物、產(chǎn)品和生物量等各種限制因素的研究，亦會(huì)促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制。

（3）1,3-丙二醇產(chǎn)品的精制提純應(yīng)該根據(jù)不同的原料、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵料液性質(zhì)和產(chǎn)品要求等靈活調(diào)整和組合分離工藝，集成有效分離手段的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行耦合處理，兼顧收率并盡量簡(jiǎn)化工藝流程。

（4）對(duì)發(fā)酵法1,3-PD生產(chǎn)的全過(guò)程進(jìn)行整合，綜合考慮發(fā)酵與精制提取的經(jīng)濟(jì)性和能耗，選取最為合理、經(jīng)濟(jì)、高效的路線(xiàn)。相信在不久的將來(lái)，隨著基礎(chǔ)研究和發(fā)酵工程技術(shù)的長(zhǎng)足發(fā)展，生物基1,3-PD的生產(chǎn)能夠迎來(lái)經(jīng)濟(jì)和市場(chǎng)的新局面。

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Progress on the production of 1,3-propanediol by fermentation

LI Xiaoshu，ZHANG Lin，GAO Dacheng，SHI Wenjing，F(xiàn)AN Yachao
（Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals，SINOPEC，F(xiàn)ushun 113001，Liaoning，China）

1,3-propanediol is an important chemical compound，which has recently received more and more attention due to its wide applications. Synthesizing 1,3-propanediolviathe biological method has some merits，such as green，high efficiency，and sustainable. This method is the most promising for the 1,3-propanediol production.In this paper，the research advances on production of 1,3-propanediol by fermentation were reviewed with regard to fermentative strains，fermentation process，process optimization and purification. To have a low cost advantage over the other chemical synthesizes，the biological method needs to increase the concentration of 1,3-propanediol，to strengthen the fermentation process that is more accurate and easier control. Economy and energy consumption need to be considered to integrate the whole process of fermentation and separation，which should be the focus of research and industrial production of 1,3-propanediol by biological process in the future.

1,3-propanediol；fermentation；bioconversion；glycerol

TQ 923

A

1000–6613（2017）04–1395–09

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.04.032

2016-09-10；修改稿日期：2016-11-17。

及聯(lián)系人：李曉姝（1984—），女，碩士，工程師，從事生物基化學(xué)品研究開(kāi)發(fā)工作。E-mail：lixiaoshu. fshy@sinopec. com。