張艷，周威，王穎，芮昱雯，蘇欣

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院/南京軍區(qū)南京總醫(yī)院a.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，b.中心實驗科微生物室，南京 210002)

·專題筆談·

呼吸系統(tǒng)標本采集技術(shù)在肺部感染診斷中的應(yīng)用

張艷a，周威a，王穎b，芮昱雯a，蘇欣a

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院/南京軍區(qū)南京總醫(yī)院a.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，b.中心實驗科微生物室，南京 210002)

獲得準確可靠的病原學(xué)檢測結(jié)果是進行目標性抗肺部感染治療的前提。該文討論臨床傳統(tǒng)的呼吸系統(tǒng)標本采集手段(包括采集痰和胸水等標本)以及新的標本采集技術(shù)(經(jīng)氣管鏡肺泡灌洗液、保護性毛刷和經(jīng)皮肺穿刺獲取標本等)在肺部感染病原學(xué)診斷中的應(yīng)用。痰標本易獲，采集方法簡單，應(yīng)用最廣，但易受口咽部正常菌群污染，檢測結(jié)果可靠性較低。胸水系無菌標本，陽性結(jié)果往往具有確定診斷意義，但敏感性較低。經(jīng)氣管鏡取樣標本包括經(jīng)氣管鏡直接吸引物、肺泡灌洗液和保護性毛刷標本等，其定量培養(yǎng)對于判斷肺部感染臨床價值較高。經(jīng)皮肺穿刺可精確采集病變部位肺組織標本，對于肺結(jié)核、肺曲霉病和肺隱球菌病等特異性感染診斷價值大，但因其存在一定并發(fā)癥，需注意掌握適應(yīng)證。

肺部感染；標本采集；病原學(xué)診斷

目標性抗菌治療首先須明確感染的病原菌，才能減少不必要的抗生素使用和降低耐藥率。肺部感染的病原體構(gòu)成非常復(fù)雜，涵蓋了細菌、非典型病原體、結(jié)核菌、真菌和病毒等。選擇正確的標本采集技術(shù)方可提高病原體檢出率，以明確診斷進行對癥治療。

1 痰標本采集

痰培養(yǎng)是我國最常用的肺部感染病原學(xué)診斷方法。但痰標本易受口腔正常菌群污染，因此，痰標本采集過程中應(yīng)該注意盡量減少污染。痰培養(yǎng)結(jié)果與無菌液體及其他部位標本培養(yǎng)結(jié)果一致時對于診斷肺部感染更具有價值。

目前，痰標本的留取仍以自主咳嗽為主。由于正常人口腔和鼻咽部存在微生物菌群，肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、嗜血桿菌屬等可以是上呼吸道定植菌，也可以是下呼吸道致病菌，因此經(jīng)口咳出的痰標本存在被口腔污染的問題。痰標本接種前經(jīng)過洗滌可以減少上呼吸道細菌的污染。判斷標本是否來源于下呼吸道一般通過痰標本的涂片染色來決定。一般認為，鱗狀上皮細胞<10個/低倍視野、多核白細胞>25個/低倍視野，或兩者比例<1∶2.5，表明標本來自下呼吸道。為提高痰培養(yǎng)的敏感性，應(yīng)強調(diào)在抗生素使用前采集痰標本。取標本前應(yīng)清潔口腔，囑患者漱口3遍以除去淺表固有定植菌。由醫(yī)生或護士指導(dǎo)患者深咳，以取得下呼吸道標本(而不是唾液及鼻咽部的分泌物)置于無菌容器。標本采集后1～2 h內(nèi)必須立即進行實驗室處理。

無痰或痰量極少者可采用誘導(dǎo)痰技術(shù)，即在固定的時間段霧化吸入相同濃度或漸增濃度的高滲氯化鈉溶液誘導(dǎo)取痰。具體操作可參考歐洲呼吸病學(xué)會(ERS)制定的誘導(dǎo)痰處理流程[1]。利用簡易肺功能儀監(jiān)測患者第1秒用力呼氣容積以確保安全。誘導(dǎo)痰分析不僅可以在氣道炎癥性疾病如哮喘[2]等的診斷、病情評估及治療選擇中起到重要作用，亦可為肺結(jié)核[3]等疾病的診斷提供依據(jù)。

2 經(jīng)支氣管鏡采樣

2.1 經(jīng)支氣管鏡直接吸引采樣 經(jīng)支氣管鏡直接吸引采集標本受口腔菌群污染比咳痰標本少。但由于支氣管鏡經(jīng)鼻、咽、喉進入下呼吸道，取樣過程中仍舊有可能混入上呼吸道的分泌物。

2.2 保護性毛刷刷檢 采用防污染毛刷(protective specimen brush, PSB)獲取下呼吸道分泌物進行病原學(xué)檢測，可有效避免上呼吸道分泌物污染，提高病原檢出率。經(jīng)支氣管鏡引入PSB至病灶引流支氣管，在病變部位反復(fù)刷取分泌物后退回內(nèi)套管，從口腔退出PSB后，將毛刷伸出內(nèi)套管，剪下刷頭，置入1 mL無菌生理鹽水中立即送檢。PSB盡管有內(nèi)、外套管保護，避免了毛刷直接接觸氣管鏡活檢通道內(nèi)壁，但尚無法達到完全不受污染的效果，所以應(yīng)進行定量培養(yǎng)來判斷病原菌。取樣后的毛刷頭在1 mL生理鹽水中經(jīng)渦旋器振蕩后，用洗入樣本的生理鹽水進行定量培養(yǎng)，細菌濃度>103CFU/mL則有意義。PSB取樣時應(yīng)深入，且應(yīng)多方向旋轉(zhuǎn)及上下移動，如此可提高標本培養(yǎng)的敏感性。

2.3 支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage, BAL) 當分泌物較少時可行BAL吸取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)進行病原學(xué)分析。按照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的《支氣管肺泡灌洗液細胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范(草案)》[4]，要求BAL操作在保障標本收集合理又將操作危險性降到最低的前提下進行規(guī)范化操作。規(guī)范提出BAL中肺段灌洗用100～250 mL室溫生理鹽水，均分3～5次序貫灌入。國內(nèi)臨床專家建議對于感染性疾病的病原學(xué)檢測，可以采取小灌洗策略，即每次灌洗20～30 mL，重復(fù)數(shù)次，灌洗總量60～120 mL。每灌入一份生理鹽水后，以低于100 mmHg的負壓吸引獲取BALF。每次回收率以≥30%為宜。至少需要提取5 mL BALF用于實驗室檢查(以10～20 mL為宜)。

BAL已廣泛應(yīng)用于各種肺部感染性疾病的診斷。通過BAL直接獲取的標本進行涂片、培養(yǎng)或抗原等檢查，對病原學(xué)診斷發(fā)揮重要作用。但BALF也能被口咽部分泌物污染，檢查及評價結(jié)果時應(yīng)予注意。研究發(fā)現(xiàn)BALF培養(yǎng)對于肺部感染患者檢測陽性率為66.17%，遠高于痰培養(yǎng)陽性率[5]。對于肺曲霉病患者，BALF的半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)檢測陽性率顯著高于外周血GM檢測[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，290例痰涂片陰性臨床可疑的肺結(jié)核患者行BAL檢查，其中110例(38%)BALF抗酸染色陽性，其敏感性為60%，特異性為91%[7]。對BALF進行的包括抗酸染色涂片、RT-PCR檢測及傳統(tǒng)的結(jié)核菌培養(yǎng)等檢查中，以RT-PCR方法敏感性最高[8]。對有肺部浸潤病變、懷疑肺曲霉病或地方性真菌病的患者，如果不能通過痰標本或檢測尿液、血清標本中的抗原來明確診斷，推薦用BALF進行真菌抗原檢測[9]。

3 經(jīng)皮肺穿刺

經(jīng)皮肺穿刺因其在肺部感染，尤其是肺結(jié)核和肺真菌病等特異性感染診斷中有較高的敏感性和特異性，臨床價值日漸突顯。

常用的穿刺引導(dǎo)技術(shù)包括B超定位及CT定位。B超定位適用于緊貼胸壁的胸膜下肺部病變的穿刺。CT定位是目前臨床使用最廣泛的定位技術(shù)。CT可顯示不同密度的病灶，有利于更精確定位穿刺部位；CT還可顯示病灶周邊的組織分布及血管分布，可有效避免或減少穿刺導(dǎo)致的咯血、氣胸等并發(fā)癥，對周圍型肺部病變，尤其直徑小于2 cm的小病灶是首選。

對于初次就診的肺部感染患者，臨床醫(yī)生往往傾向于通過非創(chuàng)傷性檢查判斷可能的病原菌，例如痰培養(yǎng)和血培養(yǎng)。在治療失敗的情況下，臨床可考慮微創(chuàng)性操作取標本。Ideh等[10]報道，肺炎患者經(jīng)驗性抗感染治療效果不佳時，行經(jīng)皮肺穿刺針吸活檢獲取肺組織進行細菌培養(yǎng)，對肺炎病原菌的診斷陽性率為35%～57%，而血培養(yǎng)陽性率為15%～27%。經(jīng)皮肺穿刺活檢獲取的肺組織除了可以行組織培養(yǎng)，還可行組織病理檢查，通過針對病原體的特殊染色，對提高真菌、結(jié)核分枝桿菌等特殊病原的檢出率意義重大。燕軍等[11]對特殊類型肺炎患者進行肺組織培養(yǎng)，陽性率達65.2%，其中結(jié)核分枝桿菌占40%。孟家曉等[12]對肺結(jié)核患者聯(lián)合組織病理檢查和組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)對菌陰肺結(jié)核診斷的敏感性達95.9%，特異性達100%。

4 胸腔積液

肺部感染性疾病常合并胸腔積液。胸腔積液標本由臨床醫(yī)師行胸腔穿刺術(shù)采集，送檢常規(guī)檢驗、生化檢驗、免疫學(xué)檢驗、微生物學(xué)檢驗、細胞學(xué)檢驗以及分子生物學(xué)檢驗等。標本采集后應(yīng)及時送檢，以防止標本凝塊形成、細胞變形及細菌自溶等，否則應(yīng)將標本置于4 ℃保存。胸腔積液沉渣涂片進行革蘭染色鏡檢可直接查找細菌，對于懷疑為結(jié)核性胸腔積液的則做胸水腺苷脫氨酶、γ干擾素檢測和抗酸染色，也可充分混勻后分離培養(yǎng)，但易受抗生素使用情況的影響，陽性率不高。有研究者發(fā)現(xiàn)膿性胸腔積液的病原學(xué)陽性率只有60%[13]。此外，還可以用免疫電泳法或凝集試驗的方法檢測病原體抗原。Strachan等[14]采用免疫層析法檢測胸水中肺炎鏈球菌抗原的含量，發(fā)現(xiàn)其敏感性大于84%，特異性大于94%。

5 小結(jié)

痰液細菌培養(yǎng)結(jié)果是目前指導(dǎo)臨床用藥的主要病原學(xué)依據(jù)，但痰培養(yǎng)的局限性限制了其對疾病診斷和指導(dǎo)治療的價值。經(jīng)氣管鏡進入下呼吸道取樣可以最大程度避免上呼吸道定植菌的污染，為提高陽性率、降低漏診率，最好結(jié)合經(jīng)氣管鏡直接吸引取樣、保護性毛刷刷檢及BAL 3種方法。經(jīng)皮肺穿刺可以直接從病變肺組織獲取標本，可作組織學(xué)檢查、特殊病原學(xué)檢查和培養(yǎng)，確診率較高。氣管鏡和肺穿刺等微創(chuàng)檢查有一定的痛苦和風(fēng)險，臨床上部分患者有可能無法耐受。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)掌握好檢查的適應(yīng)證，實驗室更應(yīng)高度重視、按規(guī)范操作這些來之不易的標本。對于那些診斷困難，經(jīng)驗治療無效，且身體狀況允許的患者，上述微創(chuàng)檢查對于確定診斷，給予針對性目標治療有較高臨床價值。

[1]Djukanovic＇R, Sterk PJ, Fahy JV,etal. Standardised methodology of sputum induction and processing[J]. Eur Respir J Suppl, 2002, 37:1s-2s.

[2]Bandyopadhyay A, Roy PP, Saha K,etal. Usefulness of induced sputum eosinophil count to assess severity and treatment outcome in asthma patients[J]. Lung India, 2013, 30(2):117-123.

[3]Park JS. Efficacy of induced sputum for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in adults unable to expectorate sputum[J]. Tuberc Respir Dis(Seoul), 2015, 78(3):203-209.

[4]中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會. 支氣管肺泡灌洗液細胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范(草案)[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2002, 25(7): 390-391.

[5]楊瑞紅，盧冰冰，曹照龍，等. 纖維支氣管鏡及支氣管肺泡灌洗檢查對免疫功能低下合并肺炎病原學(xué)診斷價值[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(1): 33-36.

[6]Zhou W, Li H, Zhang Y,etal. Diagnostic value of the galactomannan antigen test in serum and bronchoalveolar lavage fluid samples from patients with non-neutropenic invasive pulmonary aspergillosis[J]. J Clin Microbiol, 2017,55(7):2153-2161.

[7]Nikbakhsh N, Bayani M, Siadati S. The value of bronchoalveolar lavage in the diagnosis of sputum smear-negative pulmonary tuberculosis[J]. Iran J Pathol, 2015, 10(1): 35-40.

[8]Wang X, Wu Y, Zhang K.etal. Value of real-time polymerase chain reaction in bronchoalveolar lavage fluid for diagnosis of pediatric pulmonary tuberculosis [J]. Braz J Infect Dis, 2013, 17(6): 718-719.

[9]Hage CA, Knox KS, Davis TE,etal. Antigen detection in bronchoalveolar lavage fluid for diagnosis of fungal pneumonia [J]. Curr Opin Pulm Med, 2011, 17(3): 167-171.

[10]Ideh RC, Howie SR, Ebruke B,etal. Transthoracic lung aspiration for the aetioogical diagnosis of pneumonia: 25 years of experience from the cambia [J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2011, 15(6): 729-735.

[11]燕軍, 李吉臣, 張西嶺, 等. CT引導(dǎo)下肺組織穿刺活檢病理檢查聯(lián)合組織培養(yǎng)診斷特殊類型肺炎的價值[J]. 中華實用診斷與治療雜志, 2015, 29(7): 660-661.

[12]孟家曉, 王建華, 李品林, 等. 經(jīng)皮肺穿刺活檢+組織培養(yǎng)在菌陰肺結(jié)核診斷中的價值[J]. 當代醫(yī)學(xué), 2011, 17(14): 60-62.

[13]Porcel JM, Esquerda A, Vives M,etal. Etiology of pleural effusions: analysis of more than 3000 consecutive thoracenteses [J]. Arch Bronconeumol, 2014, 50(5): 161-165.

[14]Strachan RE, Cornelius A, Gilbert GL,etal. A bedside assay to detect streptococcus in children with empyema [J]. Pediatr Pulmonol, 2011, 46(2): 179-183.

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.14

張艷，1985年生，女，醫(yī)師，博士，從事肺部感染和肺部腫瘤方面的研究。

蘇欣,主任醫(yī)師，博士，E-mail:suxinjs@163.com。

R446.5

A

2017-03-21)