陳遂+黃景晟+王娟

摘要：采用超聲波-SDS協(xié)同體積分數(shù)70 %的乙醇提取雞蛋花總黃酮，通過單因素試驗和正交試驗確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：SDS濃度3.0 CMC（3.0×8.2 mmol/L），提取時間25 min，液料比25∶1（mL/g），在此條件下雞蛋花總黃酮得率為1.59±0.061 %。對雞蛋花總黃酮清除DPPH·、·OH及O-2 ·三種自由基能力進行了測定，結果表明，雞蛋花總黃酮具有良好的自由基清除效果，其中對·OH清除率最高，三種自由基清除率隨總黃酮濃度增加而增大。研究結果可為雞蛋花黃酮類物質的開發(fā)提供參考。

關鍵詞：雞蛋花；總黃酮；超聲波；提??；自由基清除

中圖分類號： TS202.3 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.03.009

雞蛋花，又名蛋黃花、擂捶花、大季花，系夾竹桃科植物雞蛋花（Plumeria rubra L. var. acutifolia，別名緬梔子），原產南美，在中國主要分布于廣東、福建、廣西及云南等地區(qū)[1]。雞蛋花富含黃酮類、萜類等多種活性成分，具有抗焦慮、抗菌及抑制HIV病毒等生物功能[2]。此外，雞蛋花作為中藥材，具有清熱祛濕、潤肺解毒、止咳化痰等藥理作用[4]。目前，關于雞蛋花的研究主要集中于雞蛋花揮發(fā)油化學成分的分析檢測方面[1-3]，而關于雞蛋花黃酮類成分的抗氧化研究未見報道。

黃酮類化合物因其顯著有效的抗氧化活性而一直作為研究重點并被廣泛用于食品、藥品、日化等領域。醇提法操作簡單、工藝成熟，是目前提取黃酮類化合物的常用方法。當輔以超聲波時，超聲波可通過空化效應破壞植物細胞壁及細胞膜，使溶劑向細胞內擴散并促使胞內有效成分溶出，因而可縮短提取時間[11]。另外，表面活性劑能降低溶劑與植物組織之間的表面張力，使植物組織被充分浸潤，加速溶劑深入組織內部，促進活性成分溶出[5]，如陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）在黃酮類化合物提取方面具有明顯的增效作用[6]。

本研究采用超聲波-SDS協(xié)同醇提法提取雞蛋花總黃酮，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并對雞蛋花總黃酮清除自由基能力進行測定，從而評價其抗氧化活性。本研究所建立的工藝方法可為植物黃酮類物質的高效提取提供參考，同時，研究結果為后期雞蛋花黃酮類化合物單體的分離、鑒定以及單體抗氧化活性的測定奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋花：洗凈、烘干、粉碎后裝袋備用。

蘆丁標準品：中國藥品生物制品檢定所，純度99.1%。蘆丁標準液（0.2mg/mL）的配制：稱取10.0mg蘆丁標準品，加體積分數(shù)95%的乙醇溶解，于50mL容量瓶中定容并搖勻。

1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）： 美國Sigma公司；SDS、乙醇、鄰苯三酚、水楊酸、Al（NO3）3、NaNO2、FeSO4、H2O2、NaOH、Na2S2O3、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

U-3010紫外可見分光光度計：日本HITACHI公司；202-3電熱恒溫干燥箱：鄭州宏朗儀器設備有限公司；KQ-250臺式超聲波清洗器：蘇州江東精密儀器有限公司；5417C高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市精達儀器制造廠；AL104電子天平：梅特勒—托利多（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雞蛋花總黃酮提取 稱取2.0 g雞蛋花粉末置于體積分數(shù)70 %的乙醇中，加入SDS，然后超聲（300 W）提取總黃酮。提取液離心（5000 r/min，10min）后取上清并定容至100mL，測定總黃酮質量，由下式計算總黃酮得率：

得率（%）=（m/W）×100

式中，m為總黃酮質量g；W為雞蛋花粉末質量g。

1.3.2 總黃酮含量測定 參考馬祥[7]等的方法并作改進。吸取1.0 mL上清樣品于10mL標準比色管，加體積分數(shù)60 %的乙醇至5.0mL；加0.3mL 50 g/L的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min；加0.3mL 100g/L的Al（NO3）3溶液，搖勻靜置6min；加4.0mL 40g/L的NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL，靜置20 min后倒入比色皿，在波長510nm處測定吸光度。以蘆丁標準液為對照，依據(jù)標準曲線（y =7.78x + 0.0036，R2 = 0.9982，其中y為吸光度，x為蘆丁質量濃度，mg/mL）求得樣品中總黃酮質量并計算出得率。

1.3.3 試驗設計

單因素試驗：依據(jù)我們前期試驗結果，分別考察SDS濃度、提取時間及液料比三個主要因素對雞蛋花總黃酮得率的影響，并確定各因素最優(yōu)水平。

正交試驗：在單因素試驗基礎上，以總黃酮得率為響應指標，建立SDS濃度（A）、提取時間（B）、液料比（C）及空白（D）的四因素三水平L9（34）正交試驗，考察各因素對響應指標影響的顯著性并確定提取總黃酮最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.3.4 清除自由基能力測定

清除DPPH·能力測定：參考吳瓊英[8]等的方法并作改進。將總黃酮上清樣品稀釋成一系列濃度的溶液，將每一稀釋度溶液加于2支10 mL試管中，每支試管加2 mL，一支試管再加1×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液2mL，一支試管再加乙醇2 mL，充分混勻并置暗處孵育30min，離心（3000 r/min， 10 min）后取上清于波長517 nm處測定吸光度。由下式計算DPPH·清除率（I1）：

I1（%）= [1 - （Ai - Aj） / A0] ×100

式中，Ai為2mL總黃酮溶液+2mLDPPH溶液的吸光度；Aj為2mL總黃酮溶液+2mL乙醇的吸光度；A0為2mLDPPH溶液+2mL乙醇的吸光度（參比）。

清除·OH能力測定： 參考候學敏[9]等的方法并作改進。將總黃酮上清樣品用dd水稀釋成一系列濃度的溶液。取10 mL試管若干，分別依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL以及不同濃度總黃酮樣品溶液2 mL（空白對照以dd水代替總黃酮溶液），最后加入8.8 mol/L H2O2溶液2 mL，混勻并于37℃水浴30min，離心（3，000 r/min， 10 min）后取上清于波長510nm處測定吸光度，參比溶液以dd水代替H2O2。由下式計算·OH清除率（I2）：

I2（%）= [1 - （Ax - Ax0） / A0]×100

式中，A0為空白對照吸光度；Ax為加入樣品溶液后的吸光度；Ax0為參比溶液吸光度。

取10 mL試管若干，分別加入pH 8.2的Tris-鹽酸緩沖液4.5 mL，25 ℃水浴20min，各試管再加入不同濃度的總黃酮樣品溶液0.2mL及30℃預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL（以10mmol/L鹽酸溶液配制），混勻后25℃水浴4min，立即加4滴8mol/L鹽酸終止反應。以蒸餾水作空白對照，于波長325nm處測定吸光度。由下式計算 ·清除率（I3）：

I3（%）= （A0 - An） / A0 ×100

式中，A0為空白對照吸光度；An為加入樣品溶液后的吸光度。

1.3.5 統(tǒng)計學處理

用SAS 8.2（SAS Institute Inc.， Cary， NC， USA）軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間差異比較采用t檢驗法。所有試驗均設3個重復，數(shù)據(jù)取均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 SDS濃度對雞蛋花總黃酮得率的影響

室溫下，SDS在水中的臨界膠束濃度（critical micell concentration， CMC）為8.2 mmol/L[10]。不同倍數(shù)CMC的SDS對雞蛋花總黃酮得率的影響，如圖1：

由圖1可知，在SDS濃度1.0-3.0 CMC時，雞蛋花總黃酮得率隨溶液中膠束的增加而提高。此后，隨著SDS濃度增加，過多的表面活性劑形成過于緊密的膠束系，可能會對總黃酮的浸出產生抑制作用，從而使總黃酮得率略有下降并趨于穩(wěn)定。

2.1.2 提取時間對雞蛋花總黃酮得率的影響

提取時間對雞蛋花總黃酮得率的影響，如圖2：

由圖2可知，在提取時間5～25min時，雞蛋花總黃酮得率隨提取時間的增加而提高。此后隨著提取時間的延長，總黃酮得率不斷降低。分析原因可能是長時間超聲會對SDS形成的膠束結構造成破壞，同時會導致其他雜質溶出，從而降低了總黃酮得率。

2.1.3 液料比對雞蛋花總黃酮得率的影響

液料比對雞蛋花總黃酮得率的影響，如圖3：

由圖3可知，液料比5∶1～20∶1時，雞蛋花總黃酮得率隨液料比增加而提高較快。此后，液料比增加，總黃酮得率提高緩慢并將趨于穩(wěn)定。盡管整體看，液料比越大，總黃酮得率越高，但過大的液料比會造成高能耗和溶劑浪費，且有較多雜質溶出，因此考慮到節(jié)能及提高效率，液料比不宜過大。

2.2 正交試驗結果與分析

正交試驗設計及結果，如表1：

由表1可知，各因素對雞蛋花總黃酮得率的影響大小順序為：C > A > B；最優(yōu)提取工藝為A2B2C3，即SDS濃度3.0CMC，提取時間25 min，液料比25∶1。此工藝下雞蛋花總黃酮提取得率最高：1.59±0.061 %。

方差分析（如表2）結果表明，液料比對雞蛋花總黃酮得率有顯著性影響。

2.3 清除自由基能力測定結果與分析

雞蛋花總黃酮清除自由基能力的測定結果如圖4：

3 結論

參考文獻

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