徐華山　周雷　劉凱　李培德　游艾青

摘要 Pi35是具有廣譜持久抗性的水稻抗稻瘟病基因，在水稻抗病育種中具有重要作用。通過將不同等位基因測序及序列比對鑒定到1個(gè)Pi35基因內(nèi)特異SNP位點(diǎn)并開發(fā)了一套鑒定該SNP的分子標(biāo)記引物研究結(jié)果表明，利用該引物對水稻DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可快速判斷待測水稻Pi35的基因型。該方法簡便快速、成本低廉，可廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種或者水稻種質(zhì)資源Pi35基因型鑒定。

關(guān)鍵詞 水稻；Pi35基因；特異SNP；共顯性分子標(biāo)記

中圖分類號 S511；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）21-0020-02

水稻是我國重要的糧食作物，稻瘟病是我國稻作區(qū)最嚴(yán)重的的病害之一，嚴(yán)重影響稻谷產(chǎn)量和質(zhì)量。利用分子標(biāo)記輔助選擇組裝、聚合具有不同抗譜的抗性基因，培育廣譜、持久抗性水稻品種成為解決問題的最佳途徑。Pi35位于水稻1號染色體，供體親本來源于日本粳稻品種Hokkai 188（Nguyen等，2006），攜帶Pi35基因的Hokkai 188（北海188）和Fukei 138（藤系138）是日本水稻育種的骨干抗源，抗葉瘟水平高且穩(wěn)定，因此Pi35對于培育具有稻瘟抗性的水稻品種具有巨大的利用價(jià)值[1-2]。本研究在2對交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)創(chuàng)新，通過在內(nèi)引物倒數(shù)第3位引入錯(cuò)配堿基，開發(fā)出鑒定該SNP位點(diǎn)不同堿基類型的共顯性標(biāo)記，可廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種或者水稻種質(zhì)資源Pi35基因型鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料包括抗性品種Fukei 138（藤系138）；感病等位基因親本材料9311；Fukei 138（藤系138）與9311雜交獲得的F1代材料；生產(chǎn)上常用骨干親本材料培矮64S、廣占63S、HD9802S、明恢63、中國香稻、日本晴、桂朝2號、黃華占、Lemont、HP121、超級巴斯瑪?shù)佟Ⅺ}稻4號、R1128。

1.2 引物設(shè)計(jì)

本研究在2對交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)創(chuàng)新，通過在內(nèi)引物倒數(shù)第3位引入錯(cuò)配堿基，開發(fā)出鑒定該SNP位點(diǎn)不同堿基類型的共顯性標(biāo)記，如圖1所示，通過設(shè)計(jì)4條引物（PF、PR、NF、NR）并利用待測品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物詳細(xì)信息見表1，根據(jù)擴(kuò)增條帶類型鑒定基因型。

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為15 μL，含1.5 μL 10×Buffer，1.0 μL dNTPs（10 mmol/L），4條引物PF、PR、NF與NR各為0.1 μmol/L；Taq酶0.2 μL（5 U/μL），1.0 μL模板DNA（50 ng/μL），其余用ddH2O補(bǔ)齊；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀掃描記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對及標(biāo)記開發(fā)

對Pi35來源材料的Pi35編碼區(qū)的等位基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、等位基因重測序，將獲得序列首先與包含感病等位基因的材料日本晴及9311的對應(yīng)序列進(jìn)行比對，對于具有差異序列的位點(diǎn)再利用包含其余3個(gè)等位基因的材料進(jìn)行測序比對確認(rèn)，最終在Pi35基因3780T處獲得1個(gè)Pi35特異性SNP位點(diǎn)，Pi35等位基因型為T堿基，其余基因型均為G堿基。因此，通過設(shè)計(jì)特異性引物對該SNP位點(diǎn)特異性擴(kuò)增即可實(shí)現(xiàn)Pi35等位基因的鑒定。

引物設(shè)計(jì)原理如下（圖1）：在設(shè)計(jì)T型等位基因鑒定引物時(shí)，根據(jù)PCR-CTPP方法原理，首先在該SNP位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)正向引物PF（表1），以該SNP位點(diǎn)的T堿基的互補(bǔ)堿基A作為3′端在該位點(diǎn)設(shè)計(jì)反向引物PR，PR的3′端的A堿基與T型等位基因材料正常結(jié)合擴(kuò)增而與G型材料形成A/G錯(cuò)配無法擴(kuò)增。同理，按照上述思路開發(fā)出擴(kuò)增G型等位基因材料的NF與NR，試驗(yàn)結(jié)果表明，NF與NR在T型材料中也有較微弱的擴(kuò)增，因此為增強(qiáng)該引物特異性在NF的倒數(shù)第3位引入了一個(gè)錯(cuò)配堿基A增強(qiáng)其特異性，結(jié)果表明該引物只有與G型等位基因材料擴(kuò)增時(shí)有1條266 bp條帶，與T型材料沒有條帶擴(kuò)增；4條引物名稱、序列及擴(kuò)增片段長度如表1所示。

2.2 供試材料Pi35基因型鑒定

利用Pi35-PF、Pi35-PR、Pi35-NF、Pi35-NR鑒定Fukei 138（藤系138）、9311、Fukei 138（藤系138）與9311雜交獲得的F1代材料、生產(chǎn)上常用骨干親本材料培矮64S、廣占63S、HD9802S、明恢63、中國香稻、日本晴、桂朝2號、黃華占、Lemont、HP121、超級巴斯瑪?shù)佟Ⅺ}稻4號及R1128。結(jié)果顯示純合Pi35基因型材料可以擴(kuò)增出535 bp和317 bp 2條條帶，雜合Pi35基因型材料擴(kuò)增出535 bp、317 bp和266 bp 3條條帶，不含Pi35基因的材料只有535 bp和266 bp 2條條帶（圖2）。對擴(kuò)增產(chǎn)物測序的結(jié)果表明，該標(biāo)記引物可以準(zhǔn)確地鑒定水稻材料中的Pi35基因型。

3 結(jié)論與討論

利用分子標(biāo)記輔助選擇組裝、聚合具有不同抗譜的抗性基因，培育廣譜、持久抗性水稻品種是解決水稻稻瘟病抗性問題的最佳途徑。緊密連鎖的分子標(biāo)記存在交換的可能，不能完全準(zhǔn)確地鑒定水稻材料中的抗性基因，因此開發(fā)適合分子育種需要，能夠高通量、低成本檢測抗病基因的基因內(nèi)功能標(biāo)記成為當(dāng)務(wù)之急。馬 建等[3]開發(fā)的Pi35-dCAPS標(biāo)記能夠準(zhǔn)確鑒定水稻材料中是否含有Pi35基因，但是需要對水稻材料DNA擴(kuò)增后進(jìn)行酶切才能判定目標(biāo)基因型。本研究開發(fā)的Pi35基因內(nèi)特異性共顯性SNP分子標(biāo)記可以直接通過鑒定PCR產(chǎn)物判定目標(biāo)材料的基因型，無需酶切，檢測準(zhǔn)確率100%，不僅可以判斷目標(biāo)材料是否含有Pi35基因，還可以檢測出目標(biāo)材料的基因型是雜合還是純合[4-6]。該標(biāo)記具有高通量、低成本的優(yōu)點(diǎn)，適合分子育種材料的大批量檢測，為水稻抗稻瘟病育種提供了便利。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 雷財(cái)林，凌忠專，王久林.水稻抗病育種研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào)，2004（39）：4-7.

[2] FUKUOKA S，YAMAMOTO S，MIZOBUCHI R，et al.Multiple functional polymorphisms in a single disease resistance gene in rice enhance durable resistance to blast[J].Sci Rep，2014，4：4550.

[3] 馬建，馬小定，趙志超，等.水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用[J].作物學(xué)報(bào)，2015，41（12）：1779-1790.

[4] 易怒安，李魏，戴良英.水稻抗稻瘟病基因的克隆及其分子育種研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2015，13（7）：1653-1659.

[5] 邢鵬，張幸，李冬梅.稻瘟病抗性基因在主要育種親本中的分步研究[J].分子植物育種，2015，13（3）：505-512.

[6] 李江，黃東益.水稻抗稻瘟病分子育種研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（35）：11413-11415.