徐婷，徐國賓，b，賈淑芹，康曉征，張連海，季加孚

(北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所a.檢驗科，b.分子診斷中心，c.胸部腫瘤外一科，d.胃腸中心，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

·專家論壇·

循環(huán)腫瘤DNA檢測在惡性腫瘤診治中的應(yīng)用進展與問題思考

徐婷a，徐國賓a，b，賈淑芹a，康曉征c，張連海b，d，季加孚b，d

(北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所a.檢驗科，b.分子診斷中心，c.胸部腫瘤外一科，d.胃腸中心，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

腫瘤組織是檢測驅(qū)動基因突變的理想標本，獲得組織標本的方式有內(nèi)鏡活檢、淋巴結(jié)活檢、手術(shù)切除等。對于失去手術(shù)機會的晚期腫瘤患者，臨床很難獲得或難以獲得足量組織標本用于基因檢測。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是腫瘤細胞壞死、凋亡釋放入血的DNA，其基因組信息與腫瘤組織一致。晚期腫瘤患者ctDNA是良好的組織替代品，可作為靶向藥物基因靶點檢測的補充。常見ctDNA檢測技術(shù)有突變擴增阻滯系統(tǒng)(ARMS)、數(shù)字PCR(dPCR)、新一代測序(NGS)等。不同方法原理不同，靈敏度不同，一次可檢測的基因個數(shù)和位點也不同。該文對ctDNA檢測及其在腫瘤早期診斷、用藥指導、療效評估、復發(fā)監(jiān)測、預后等方面的研究作一簡要概述，并闡述存在的問題和一些思考。

循環(huán)腫瘤DNA；核酸擴增技術(shù)；早期診斷；指導用藥；療效評價；復發(fā)監(jiān)測；預后

驅(qū)動基因的檢測是晚期腫瘤患者靶向藥物選擇的基礎(chǔ)，腫瘤組織是靶基因檢測的理想標本。獲取組織標本的常見方式包括內(nèi)鏡活檢、淋巴結(jié)活檢、手術(shù)切除等。多數(shù)晚期患者往往難以接受有創(chuàng)檢查，臨床很難獲得或難以獲得足夠量的腫瘤組織用于基因檢測[1]。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)作為組織學基因檢測的補充，在指導靶向用藥方面具有潛在價值，并在腫瘤的早期診斷、預后判斷、殘留與復發(fā)監(jiān)測和治療反應(yīng)監(jiān)測等方面也具有潛在的應(yīng)用價值。

1 ctDNA檢測方法和原理

生理或病理狀態(tài)下，細胞壞死或凋亡時細胞核內(nèi)或線粒體內(nèi)DNA會釋放到血液、胸腔積液、腦脊液、尿液、痰液或糞便中。細胞外游離 DNA(cell-free DNA，cfDNA)是細胞 DNA 降解產(chǎn)物，片段大小約150～200 bp[2]。ctDNA作為 cfDNA 的一類，來源于腫瘤細胞，可反映腫瘤的異質(zhì)性。血液中ctDNA半衰期為15 min至數(shù)小時[3]。人cfDNA 濃度多低于100 μg/L，平均約30 μg/L[4]；中晚期腫瘤患者cfDNA 濃度可高達 1 000 μg/L，平均約180 μg/L[5]。cfDNA中ctDNA占比較低。研究發(fā)現(xiàn)，中晚期腫瘤患者ctDNA占cfDNA的比例約為8%～10%，在腫瘤早期或治療緩解后可低至0.01%～1.7%[3, 6-7]。ctDNA檢測的主流方法有突變擴增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)、數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)、新一代測序(next-generation sequencing，NGS)等，各方法檢測原理和靈敏度不同。低豐度ctDNA對檢測技術(shù)的靈敏度要求很高。上述基于PCR技術(shù)的ctDNA檢測方法要求加入的cfDNA起始量為30～80 ng，各方法的靈敏度、特異性和通量各不相同。對于ARMS和dPCR，不同試劑盒間的檢測差異與ctDNA提取率、引物位置、探針修飾有關(guān)。對于基于PCR反應(yīng)的NGS，其檢測靈敏度除與樣本處理有關(guān)外，還與每一步反應(yīng)效率和測序深度有關(guān)。

1.1 ARMS ARMS技術(shù)利用探針或染料在實時熒光PCR平臺上實現(xiàn)對特異引物擴增突變序列的檢測。探針法較染料法特異性好、應(yīng)用廣[8-9]。ARMS檢測特異性取決于引物特異性，1個反應(yīng)中加入多個特異引物，可實現(xiàn)多重擴增，檢測同一基因的多個突變。檢測血漿ctDNA的商品化ARMS試劑盒有人表皮生長因子受體(EGFR)基因突變檢測試劑盒(廈門艾德公司)、cobas?EGFRMutation Test v2(美國Roche公司)、therascreenEGFRPlasma RGQ PCR(德國凱杰公司)。人EGFR基因突變檢測試劑盒可檢測29種EGFR熱點突變，靈敏度為1.0%[10]，已獲國家藥監(jiān)局(CFDA)臨床應(yīng)用批準和歐盟ISO13485認證。該公司開發(fā)的新一代super ARMS試劑盒正在審批過程中，其靈敏度約為0.2%。cobas?EGFRMutation Test v2和therascreenEGFRPlasma RGQ PCR可檢測的EGFR位點分別為42和23種，靈敏度分別為0.5%和1%，這兩種試劑盒中EGFR19外顯子缺失突變(exon 19 deletion)和 21外顯子突變(L858R)的檢測已獲美國食品及藥物管理局(FDA)批準和歐洲共同體體外診斷產(chǎn)品(CE-IVD)認證。

Liu等[11]用人EGFR基因突變檢測試劑盒檢測86例ⅢB-Ⅳ期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者組織和血漿EGFR突變，陽性率分別為46.5%(40/86)和31.4%(27/86)；40例組織EGFR突變型患者中，27例患者血漿中檢測到EGFR突變，敏感性為67.5%；27例組織EGFR野生型患者血漿均未檢測到EGFR突變，特異性為100%；該試劑盒檢測血漿EGFR基因突變的敏感性較低，但特異性和陽性預測值高。有研究[12]顯示治療前組織EGFR突變豐度低于1%的患者較高于1%的患者使用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)后的中位無進展生存時間(progression-free survival，PFS)和總生存時間(overall survival，OS)更短。而治療前血漿中EGFR突變豐度低于0.04%的患者較高于0.04%的患者使用EGFR-TKI后的中位PFS更短[13]。

商品化ARMS試劑盒定性檢測EGFR的靈敏度為0.5%～1%，可用于組織EGFR檢測，但用于血漿EGFR檢測時需慎重。血漿EGFR突變豐度與患者預后的關(guān)系還有待進一步研究，而選擇高靈敏度ctDNA檢測技術(shù)是開展這項研究的關(guān)鍵因素之一。

1.2 dPCR dPCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，分為DNA單分子化、PCR擴增和熒光信號分析3部分。與ARMS檢測存在大量cfDNA背景干擾不同，在dPCR擴增前樣品被平均分配到幾至幾百萬個單元中。由于每個單元中靶基因以單分子狀態(tài)呈現(xiàn)，背景干擾少，解決了突變與野生DNA分子基礎(chǔ)拷貝數(shù)不同而導致二者PCR擴增效率差異大的缺陷。dPCR以反應(yīng)達到終點時每個反應(yīng)單元是否具有熒光信號判定反應(yīng)的陰陽性，根據(jù)泊松分布計算原始樣本突變基因的拷貝數(shù)，實現(xiàn)核酸的絕對定量。探針特異的dPCR檢出基因突變的靈敏度可高達0.005%～0.01%[14-18]，高于特異引物擴增的ARMS分析法。dPCR靈敏度除與檢測器的靈敏度和PCR擴增效率等因素有關(guān)外，還取決于樣本總量和可用于反應(yīng)的單元總數(shù)。樣本量足夠時，可用于反應(yīng)的單元總數(shù)越多，檢測的靈敏度越高，準確度也越高。dPCR適用于拷貝數(shù)變異及突變的檢測、二代測序結(jié)果及等位基因頻率的驗證等。

根據(jù)反應(yīng)單元形成的方式不同，dPCR主要有微滴和微流控芯片2類。微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)源于乳液PCR技術(shù)[19-20]。ddPCR是在傳統(tǒng)PCR擴增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的油包水微滴，對每個微滴同時進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，依次采集每個微滴中的熒光信號。一個微滴發(fā)生卡可一次檢測8個樣本。目前應(yīng)用較多的微滴技術(shù)平臺有Rain DropTM數(shù)字PCR系統(tǒng)(美國Rain Dance公司)和QX200系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。微流控芯片技術(shù)是一種基于超高密度親疏水微孔芯片的dPCR 平臺。該平臺采用包含20 000 個微孔的超高密度芯片作為反應(yīng)載體。每張芯片只能檢測一個樣品。目前采用微流控芯片技術(shù)的平臺有Bio-MarkTM基因分析系統(tǒng)(美國Fluidigm公司)和QuantStudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)(美國Life Technologies公司)。

一項前瞻性研究[21]采用ddPCR分析了29例早期乳腺癌患者腫瘤組織和ctDNA中PIK3CA突變，在15例腫瘤組織中檢測到PIK3CA突變的患者中，有14例患者外周血中檢測到PIK3CA突變，14例腫瘤組織陰性患者均未在ctDNA中檢測到PIK3CA突變(敏感性為93.3%，特異性為100%)。但dPCR一次只可檢測一個已知突變。若需要檢測靶基因的多個敏感突變位點，則需行多次dPCR。例如，需要檢測肺癌患者血漿EGFR基因L858R、E746_A750del、G719X和T790M 4個位點時，則需進行4次dPCR反應(yīng)，操作繁瑣耗時。

1.3 SBE結(jié)合MALDI-TOF-MS 該技術(shù)首先通過多重PCR同時擴增多個待測基因突變和野生目的片段，然后加入蝦堿酶水解PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和針對待測基因的引物。其后，在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)加入單堿基延伸引物，該引物的3′末端堿基與待檢突變位點的前一個堿基互補。采用4種雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)替代dNTP參加反應(yīng)。由于ddNTP在脫氧核糖的3′位置缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的ddNTP形成磷酸二酯鍵。探針在突變位點處僅延伸一個堿基，且連接上的ddNTP與突變位點的堿基互補。經(jīng)樹脂純化后的延伸產(chǎn)物和非延伸引物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜?；|(zhì)從激光中吸收能量傳遞給核酸分子，核酸分子解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子。產(chǎn)物離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而測定離子的質(zhì)荷比(m/z)，從而確定該位點的堿基。

Margulies等[22]收集122例Ⅲ～Ⅳ期黑色素瘤患者石蠟包埋組織和配對血漿，采用ARMS法檢測腫瘤組織中BRAFV600E突變；與組織檢測結(jié)果相比，質(zhì)譜法和ARMS法檢測ctDNA的陽性一致率分別為76.4%(55/72)和54.2%(39/72), 陰性一致率分別為98%(49/50)和96%(48/50)。單堿基延伸技術(shù)(single base extension,SBE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)可同時檢測同一基因或多個不同基因已知的熱點突變，檢測通量較大，操作時間短，成本低，也可定量檢測突變豐度。突變基因質(zhì)譜法檢測的靈敏度約為1%，并且由于多重PCR的循環(huán)數(shù)較多(約40個循環(huán))，突變DNA分子和野生DNA分子可能存在非等倍擴增現(xiàn)象，導致質(zhì)譜法檢測到的突變豐度與實際豐度存在一定偏差。

1.4 NGS NGS可實現(xiàn)對多基因核酸片段進行高通量平行深度測序，定量檢測突變豐度，發(fā)現(xiàn)未知突變。cfDNA加入量足夠時，NGS的靈敏度(0.02%～5%)取決于測序深度[23-25]。美國Illumina公司和Life公司是目前使用較廣泛的測序平臺。Illumina公司測序分為文庫構(gòu)建、橋式PCR擴增和可逆性末端邊合成邊測序3部分。采用超聲或酶切法將待測基因組DNA樣本打斷為100～200 bp小片段，這些小片段兩端連接不同粘性末端接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫。血漿cfDNA不需經(jīng)過處理，可用于文庫構(gòu)建。將生物素標記的捕獲探針與單鏈DNA文庫混合，目標區(qū)域基因片段被雜交到探針上，采用親和素包被的磁珠捕獲雜交到探針上目標區(qū)域基因片段，去除未被吸附的基因片段。將經(jīng)過富集的目標區(qū)域基因片段洗脫下來即可獲得目標區(qū)域基因片段DNA文庫。文庫中具有粘性末端接頭分子可與flowcell表面附有的互補探針結(jié)合。當含DNA文庫的反應(yīng)液流過flowcell表面時，每條連接有粘性末端接頭的單鏈DNA片段與flowcell表面的接頭牢牢結(jié)合在一起。每條固定在flowcell表面的DNA片段都經(jīng)過橋式PCR擴增形成各自的簇，即每個簇都由單個DNA模板的很多個拷貝組成。橋式擴增結(jié)束后向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和4種帶有熒光標記的dNTP。這些dNTP的3′-OH被疊氮基保護，不能與下一個dNTP形成磷酸二酯鍵，因而每次只能添加一個dNTP。dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶被水洗脫掉。再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，光學設(shè)備記錄熒光信號，計算機分析系統(tǒng)根據(jù)4種不同顏色的熒光信號確認堿基種類。熒光信號記錄完成后，加入化學試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3′-OH疊氮基團，暴露dNTP 3′-OH。再加入新的dNTP、 DNA聚合酶和接頭引物，進行下一輪測序反應(yīng)，如此循環(huán)，直到記錄下每條模板的堿基序列。

Life公司測序分為文庫構(gòu)建、乳液PCR擴增和可逆性末端邊合成邊測序3部分。小片段DNA的兩端連接上平端接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫。其目標區(qū)域基因片段的捕獲方法與Illumina平臺相同。將包含單鏈DNA文庫、5′端標記生物素的接頭引物、DNA聚合酶和測序微珠(表面連接有與平端接頭互補的引物序列)的水溶液混合均勻后，加入油，油和水混合后形成的每個小微滴中都包含0到若干個文庫分子和測序微珠，每個微滴同時進行獨立的PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，測序微珠上就連接了同一微滴中擴增出的生物素標記的DNA分子。破壞微滴結(jié)構(gòu)，加入鏈霉親和素標記的磁珠，磁珠會和發(fā)生PCR反應(yīng)的帶有生物素的測序微珠結(jié)合，富集這些測序微珠，然后通過洗脫液把磁珠富集的測序微珠洗脫下來。Life測序芯片含有數(shù)以百萬、千萬計的小孔。每個小孔既是測序微珠的容器，又是一個微型的pH計。測序時將測序微珠的混懸液從芯片的進口注入，當混懸液流過芯片時，每個測序微珠沉積在1個小孔中。測序時堿基ACGT依次連續(xù)流過芯片。如果核苷酸與小孔中DNA 分子互補，則該核苷酸與DNA 分子結(jié)合，釋放1分子焦磷酸，1個焦磷酸分子被酶進一步分解為2個磷酸分子(即兩個酸性分子)。一個測序微珠上有幾百、幾千條DNA鏈，因此，每次發(fā)生聚合反應(yīng)，每個測序微珠就會釋放出幾百、幾千個酸性分子，小孔的pH值下降。芯片中每個小孔中的離子傳感器檢測到pH 變化后，即刻將化學信息轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字電子信息。如果DNA 鏈含有連續(xù)兩個相同的堿基，則有雙倍的酸性分子釋放，記錄的電壓信號也是雙倍的。如果堿基不匹配，則無酸性分子釋放，也就沒有電壓信號的變化。不同研究中，與組織相比，不同ctDNA檢測方法的陽性一致率(敏感性)、陰性一致率(特異性)和總一致率存在差異，這種差異可能與組織異質(zhì)性和腫瘤分期(以往的研究，多選擇晚期腫瘤的患者)相關(guān)。不同ctDNA檢測方法針對不同分期的真陽性和真陰性的頭對頭比較研究(head to head comparative trial)目前未見報道。

2 ctDNA檢測在惡性腫瘤中的應(yīng)用

2.1 早期診斷 早期腫瘤患者cfDNA含量低，ctDNA豐度低，對檢測靈敏度要求高。雖然ctDNA在腫瘤早期篩查中的價值并未被看好，但其仍然受到關(guān)注。2014年，Newman等[23]從腫瘤基因圖譜庫407位NSCLC患者全基因組測序結(jié)果和腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫篩選139個基因設(shè)計成NGS檢測組合，該組合基因突變在肺腺癌或鱗癌患者中發(fā)生率為96%。研究者將這種方法命名為癌癥個體化深度測序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing， CAPP-Seq)。與組織結(jié)果相比，CAPP-Seq在Ⅰ期(4例)和Ⅱ～Ⅳ期(9例)NSCLC中檢出基因突變的敏感性分別為50%和100%，在各期NSCLC中特異性為96%。ctDNA用于腫瘤早期診斷，除需高靈敏度的技術(shù)，還需設(shè)定合適的基因組合。由于不同種類的腫瘤突變譜不同，設(shè)定的基因組合最好能覆蓋不同腫瘤80%～90%突變。

2.2 微小殘留病灶和復發(fā)監(jiān)測 液體活檢，包括ctDNA和循環(huán)腫瘤細胞(CTC)，在微小殘留病灶和復發(fā)監(jiān)測中的應(yīng)用研究成為近2年來的熱點，在微小殘留病灶檢測和復發(fā)預警中具有潛在應(yīng)用價值。ctDNA對于微小殘留病灶評估和復發(fā)監(jiān)測研究多集中于直結(jié)腸癌和胰腺癌。Tie等[26]對178例術(shù)后未接受輔助化療的Ⅱ期結(jié)腸癌患者進行為期4年的追蹤試驗。研究者采用NGS(Illumina公司)監(jiān)測血漿體細胞突變?；颊哂谛g(shù)后每6個月接受一次全身CT掃描，4～10周內(nèi)、10周后每3個月分別采集新鮮外周血。采用NGS對連續(xù)收集的外周血漿行6個基因外顯子突變檢測，術(shù)后ctDNA陽性和陰性患者例數(shù)分別為14和164，復發(fā)率分別為78.6%(11/14)和9.8%(16/164)，無復發(fā)生存時間分別為7.9和27個月；提示ctDNA檢測或可作為病灶是否完全清除的指標，對部分早期結(jié)腸癌患者腫瘤復發(fā)風險具有預測作用。Reinert等[27]還比較了影像學、癌胚抗原(CEA)、ctDNA監(jiān)測結(jié)直腸癌術(shù)后早期復發(fā)的性能，發(fā)現(xiàn)ctDNA較CEA升高和影像學發(fā)現(xiàn)改變早10個月。微小殘留病灶和復發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)對于復發(fā)的早期干預和延長患者生存時間非常重要。早期腫瘤患者血清蛋白質(zhì)類腫瘤標志物陽性率低，對于微小殘留檢測價值有限。腫瘤患者術(shù)后復發(fā)監(jiān)測主要靠影像學和蛋白質(zhì)類腫瘤標志物，但前者不能及時反映患者病情的進展，后者敏感性低。ctDNA在監(jiān)測結(jié)直腸癌和胰腺癌患者術(shù)后微小殘留病灶和復發(fā)方面具有一定價值，但在其他腫瘤中的應(yīng)用價值以及向臨床轉(zhuǎn)化還有待進一步研究。

2.3 療效評價 腫瘤療效評價為基于影像學檢查的實體瘤療效評價標準[28]。血清蛋白質(zhì)類腫瘤標志物的變化與影像學療效評價的一致率不超過50%[29]。近2年來，已有ctDNA用于晚期肺癌、結(jié)直腸癌治療的耐藥預警[23,26-27]，較早的相關(guān)研究發(fā)表于新英格蘭醫(yī)學雜志[30]。該項研究采用靶向或全基因組測序檢測了52例正接受全身性治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者腫瘤基因組改變，采用ddPCR或靶向測序檢測組織基因突變陽性患者(以PIK3CA和TP53基因突變居多)血漿中對應(yīng)基因突變拷貝數(shù)改變。研究還檢測了相同時間點CA15-3水平和CTC數(shù)量。CTC檢測采用CellSearch平臺。研究驗證NGS檢測ctDNA突變豐度與ddPCR具有良好的一致性。該研究發(fā)現(xiàn)在30例組織中檢測到基因突變患者的外周血中ctDNA檢出的陽性率為97%，而CTC和CA15-3陽性率分別為87%和78%。與影像學結(jié)果相比，無論用NGS或ddPCR檢測的ctDNA水平動態(tài)改變與腫瘤負荷改變一致性好，且兩者的關(guān)聯(lián)性優(yōu)于CA15-3及CTC。ctDNA可以成批檢測，避免影像學檢查的長時間等候預約。ctDNA中多個突變基因檢測可以反映腫瘤克隆的演變，但向臨床轉(zhuǎn)化還需要大規(guī)模多中心的前瞻性研究。

2.4 指導靶向藥物使用 癌組織基因檢測對于指導靶向治療具有重要意義。2015年2月CFDA批準對吉非替尼說明書的更新，新說明書要求晚期NSCLC患者治療前應(yīng)檢測組織EGFR突變，但如不可獲得或不可獲得足夠的腫瘤組織時，則可檢測血液標本中ctDNA并評估，以鑒別出最可能從吉非替尼治療中受益的NSCLC患者。2015年，《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》也提出當腫瘤組織難以獲取時，血液是EGFR基因突變檢測合適的替代生物材料，也可作為對可疑組織檢測結(jié)果的補充[31]。2014年，Weber等[32]分別采用Roche公司組織和血漿EGFRARMS-PCR試劑盒檢測196例Ⅱ～Ⅳ期NSCLC患者腫瘤組織和對應(yīng)血漿中EGFR基因突變，血漿EGFR突變患者使用TKI治療的PFS顯著長于EGFR未突變者(5.7個月 vs 2.8個月)。該研究中組織和血漿EGFR突變的檢出例數(shù)分別為28例和24例，組織和血漿總一致率為179/196(91%)。血漿EGFR定性和定量檢測對于指導NSCLC靶向用藥十分重要。2016年，文獻[33]報道采用ddPCR檢測73例組織EGFR突變的晚期肺腺癌患者TKI治療前和治療后不同時間段血漿中EGFR突變頻率，治療前血漿EGFR突變頻率0.04%～5.15%的患者，其PFS顯著短于血漿EGFR突變頻率>5.15%的患者(11.1個月 vs 15.4個月)，但顯著長于血漿EGFR突變頻率<0.04%的患者(11.1個月 vs 6.7個月)。該項研究還發(fā)現(xiàn)治療后血漿EGFR豐度下降患者的PFS(12.7個月 vs 7.1個月)和OS(overall survival，總生存時間)(28.3個月 vs 14.9個月)均顯著長于治療后未下降者。目前已有部分廠家可檢測血漿中的某些融合基因，如ALK、ROS1等，但這些技術(shù)之間的陽性一致率、陰性一致率以及檢測結(jié)果能否指導用藥，進一步改善患者轉(zhuǎn)歸還未見報道。

耐藥是靶向治療的必然結(jié)果，耐藥突變基因檢測有助于耐藥的發(fā)現(xiàn)和治療方案的調(diào)整。TKI治療后耐藥的晚期NSCLC患者中EGFRT790M突變率約為50%，T790M突變患者被推薦使用AZD9291。2014年，Oxnard等[34]采用dPCR連續(xù)監(jiān)測9例晚期肺癌患者厄洛替尼治療過程中血漿中EGFRT790M突變，結(jié)果6例患者進展，這6例患者的血漿中均檢測到T790M 突變。該研究顯示血漿T790M突變可在影像學發(fā)現(xiàn)疾病進展前8～24周被檢測到，提示ctDNA動態(tài)監(jiān)測可及時發(fā)現(xiàn)T790M耐藥基因位點，有助于臨床及時更換方案。

組織KRAS基因突變檢測已被NCCN指南推薦為結(jié)直腸癌患者用抗EGFR治療前的檢測項目，KRAS基因突變患者不推薦用西妥昔單抗(抗EGFR)治療。早在2010年，比利時De Roock等[35]采用質(zhì)譜法檢測750例接受西妥昔單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA基因的突變狀態(tài)，并分析這些基因的突變狀態(tài)與患者的治療反應(yīng)率、PFS和OS的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)KRAS突變型患者的治療反應(yīng)率、中位PFS和中位OS均低于KRAS野生型患者(治療反應(yīng)率：6.7% vs 35.8%；中位PFS：12周 vs 24周；中位OS：32周 vs 50周)。目前血漿KRAS基因突變檢測用于指導用藥還未達成專家共識，但未來或可先通過血漿KRAS基因檢測，免除對血漿KRAS基因突變陽性患者的活檢。結(jié)直腸癌血漿KRAS檢測的陽性預測值受到關(guān)注。2015年，Danese等[36]采用ARMS法檢測了85例Ⅰ～Ⅳ期(以Ⅱ～Ⅲ期為主)結(jié)直腸癌患者血漿和新鮮冰凍組織中KRAS突變。組織KRAS基因突變陽性率為34%。與組織相比，血漿檢測KRAS突變的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為85%、93%、84.6%和93%，血漿和組織KRAS檢測的總一致率為89.4%。同年，Spindler等[37]采用ARMS法檢測211例Ⅳ期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者石蠟包埋組織和血漿中KRAS突變，組織中KRAS基因突變率為66.4%。與組織相比，血漿檢測KRAS突變的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為80%、95.8%、97.4%和70.8%，血漿與組織KRAS檢測的總一致率為85.3%。以上研究結(jié)果表明血漿KRAS基因檢測在中、晚期結(jié)直腸癌中具有理想的陽性預測值。術(shù)后或不可手術(shù)晚期胃腸間質(zhì)瘤患者組織C-KIT和PDGFR及晚期黑色素瘤患者組織BRAFV600E和C-KIT基因突變應(yīng)用于前者選擇伊馬替尼和后者選擇威羅替尼。胃腸間質(zhì)瘤、黑色素瘤血漿基因突變檢測也應(yīng)該具有意義。

2.5 生存評估 研究顯示年齡、性別、病理類型、T分期、N分期、淋巴結(jié)采樣數(shù)量與NSCLC患者術(shù)后生存有關(guān)[38]，而初始ctDNA定性和定量檢測預測腫瘤患者生存的研究少見。Kinugasa等[39]采用ddPCR檢測了75例Ⅱ～Ⅳ期(Ⅲ～Ⅳ期患者占97%)胰腺癌患者腫瘤組織和cfDNA中KRAS突變，結(jié)果在腫瘤組織和cfDNA中檢測到KRAS突變比例分別為74.7%和62.7%。研究發(fā)現(xiàn)，組織KRAS基因檢測陽性和陰性患者OS差異無統(tǒng)計學意義(351 d vs 301 d)，而ctDNA檢測陽性患者OS較陰性患者短 (413 d vs 276 d)。Sanmamed等[14]采用ddPCR檢測19例組織BRAFV600E突變的晚期黑色素瘤患者治療前外周血中BRAFV600E的濃度(copies/mL)，結(jié)果在16例患者外周血中檢測到BRAFV600E突變。研究發(fā)現(xiàn)OS超過2年的患者，其初治時血漿BRAFV600E濃度較OS短于2年的患者低(27 copies/mL vs 478 copies/mL)。以216 copies/mL為臨界值，ctDNA低于臨界值患者的PFS和OS較ctDNA高于臨界值的患者長(PFS：9個月 vs 3個月；OS：27.7個月 vs 8.6個月)。腫瘤患者的生存與腫瘤病理類型、腫瘤分期和負荷、生理狀況等諸多因素相關(guān)。目前已有研究綜合患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、病理類型、分期、淋巴結(jié)采樣數(shù)目等構(gòu)建模型，評估患者預后，但未見結(jié)合臨床資料和ctDNA濃度及豐度評估預后的模型。該模型的構(gòu)建或能更好地評估腫瘤患者的預后。

3 存在的問題與思考

不同分析技術(shù)平臺的涌現(xiàn)實現(xiàn)了ctDNA基因檢測從單基因到多基因、定性到定量的發(fā)展。ctDNA在實體腫瘤中的應(yīng)用研究層出不窮，目前只有血漿EGFR檢測被推薦作為組織檢測的補充，用于指導晚期NSCLC患者的靶向用藥。ctDNA檢測在早期診斷、微小殘留檢測和復發(fā)監(jiān)測、治療效果評價、生存評估中的應(yīng)用價值仍在研究和驗證中。ctDNA檢測的臨床應(yīng)用價值已經(jīng)受到關(guān)注，正逐步進入臨床應(yīng)用。不同ctDNA檢測平臺的分析性能和臨床診斷性能的評價、ctDNA的規(guī)范檢測應(yīng)該受到關(guān)注。以下4個方面值得思考。

3.1 ctDNA反映腫瘤異質(zhì)性的能力 腫瘤異質(zhì)性是基因檢測和腫瘤治療面對的難題。腫瘤異質(zhì)性主要表現(xiàn)為不同個體之間、不同癌細胞之間、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間、不同轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性。ctDNA能反映腫瘤異質(zhì)性是其檢測優(yōu)勢。組織中基因突變頻率與癌組織占有的比例及突變與未突變的克隆比例有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者血漿EGFR和晚期結(jié)直腸癌患者血漿KRAS檢測的敏感性可達60%～80%，說明ctDNA可敏感地檢測出大部分晚期肺癌和晚期直結(jié)腸癌患者攜有該突變的克隆。哪些腫瘤患者血漿ctDNA可作為組織基因檢測的替代材料需要深入研究。對于進展期患者，如果轉(zhuǎn)移灶靶基因檢測陰性，而血漿檢測陽性，可能與取得的活檢標本未包括有突變的克隆有關(guān)。要驗證此假設(shè)，需對患者進行多部位活檢或尸檢，比較活檢或尸檢組織與ctDNA檢測的一致性。類似研究僅有個案報道。

3.2 不同平臺檢測ctDNA基因突變的一致性與假陽性 不同平臺檢測ctDNA突變結(jié)果不一致令臨床和患者困惑。檢測結(jié)果不一致與方法不同、同一方法不同平臺的敏感性及特異性、對檢出信號陽性閾值的設(shè)置不同有關(guān)。如前所述，dPCR檢測的靈敏度最高，可達0.1%?；贏RMS和NGS的檢出靈敏度有的僅達1%，有的可接近0.2%～0.5%。如用于復發(fā)監(jiān)測、靶基因豐度改變的監(jiān)測、療效評估、結(jié)局預測，則要求該技術(shù)的靈敏度達到0.1%，且可定量報告ctDNA豐度和拷貝數(shù)。我們的研究初步發(fā)現(xiàn)當晚期NSCLC患者血漿EGFR突變豐度>1%時，ARMS、ddPCR和NGS的陽性一致率、陰性一致率均高于90%，而當突變豐度<1%時，較低靈敏度的某ARMS產(chǎn)品與較高靈敏度的NGS和ddPCR平臺的陽性一致率低于15%。似乎1%的檢出敏感性是評價基于PCR檢測ctDNA的不同平臺檢測能力的分水嶺。文獻和我們的研究均發(fā)現(xiàn)EGFRT790M(ACG>ATG)陽性結(jié)果的報告富有挑戰(zhàn)性，該位點的C堿基可自發(fā)脫氨基生成U，且該點位于CpG島內(nèi)，C堿基的甲基化可增加其脫氨基的風險，三聯(lián)密碼子對應(yīng)的氨基酸由蘇氨酸(T)變成甲硫氨酸(M)，從而出現(xiàn)假陽性。有廠家通過提高該位點的判讀閾值來降低假陽性率。

樣本前處理也影響ctDNA檢測結(jié)果。使用含不同種類細胞保護劑樣本采集管和樣本采集后放置的時間、cfDNA提取試劑種類都會影響ctDNA檢測結(jié)果的陰陽性，未見到相關(guān)系統(tǒng)研究報告。

3.3 優(yōu)化分子病理檢測和液體活檢的流程 不同平臺檢測ctDNA的通量不同，價格相差很大。合理和優(yōu)化使用ctDNA檢測以減輕患者負擔受到重視。合理應(yīng)用ctDNA檢測的指導意見有待討論與出版。為此，分子病理檢測和液體活檢流程的優(yōu)化被納入了“重大慢性非傳染性疾病防控研究”2017年度重點專項的資助范圍。

ARMS檢測價格適宜，一次可檢測單個基因的多個已知突變，操作簡單。檢測已知的、單個臨床上可用藥物抑制的靶點(如EGFR、KRAS、BRAF等基因突變)，ctDNA檢測推薦ARMS法。dPCR是近年來發(fā)展起來的具有高靈敏度的新技術(shù)，其一個反應(yīng)只能定量檢測一個已知突變位點，對于多個突變位點的檢測，需要更多的樣本量，操作繁瑣，價格較ARMS貴。目前有許多廠家試圖開發(fā)dPCR試劑盒。dPCR現(xiàn)多用于臨床研究。dPCR檢測敏感突變的基線豐度以及治療過程中ctDNA的豐度消漲對于療效評價和生存評價具有價值，是一個具有應(yīng)用潛力的技術(shù)。NGS可定量檢測多個基因的多個位點。NGS檢測ctDNA突變豐度可與dPCR相當。普通和超靈敏的NGS成本高，但最具應(yīng)用潛力。以EGFR檢測為例，由于多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后復發(fā)患者的EGFR突變狀態(tài)與患者數(shù)年前的組織EGFR檢測結(jié)果具有良好的一致性，所以當原始組織標本可獲得時，采用ARMS檢測組織EGFR突變狀態(tài)用于指導用藥可行。需動態(tài)監(jiān)測者可采用dPCR監(jiān)測血漿EGFR突變以用于療效評價和預后評估，該模式具有較好的分子檢測經(jīng)濟學。普通NGS尚不能完全取代EGFR等突變基因的ARMS檢測、ALK和ROS1等融合基因的免疫組化或逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測，但其在腫瘤組織基因突變檢測中的應(yīng)用將越來越廣泛。如經(jīng)濟條件允許，可首先直接采用普通NGS檢測組織基因突變譜，其后采用dPCR或超靈敏NGS平行定量檢測血漿驅(qū)動基因以及其他基因突變豐度消漲以預測腫瘤克隆演變。目前血漿中ALK、ROS1等融合基因的NGS檢測方法正在開發(fā)中。臨床醫(yī)生應(yīng)該向患者說明不同檢測技術(shù)的檢測性能(包括靈敏度、特異性、假陽性、通量等)及花費，讓患者做出適合自身檢測的選擇。

3.4 ctDNA標準品的研制 ctDNA檢測質(zhì)控品的研發(fā)和室間質(zhì)量評價計劃剛起步。含突變位點的細胞系基因組DNA或重組質(zhì)粒均可作為ARMS和dPCR檢測的質(zhì)控物。由于ctDNA片段小，制備與ctDNA長度相當、基質(zhì)與血漿類似的參考物用于NGS的質(zhì)量控制應(yīng)該受到關(guān)注，此類參考物也適用于ctDNA ARMS和dPCR的質(zhì)量控制。英國Horizon Discovery 公司發(fā)布了商品化的ctDNA標準品，該標準品來源于細胞系基因組DNA。近2年來，美國病理學家協(xié)會也啟動了ctDNA檢測的室間質(zhì)量評價。與人血漿ctDNA性質(zhì)相似的標準品制備瓶頸包括DNA的片段化和ctDNA突變豐度的定值。片段化DNA包括超聲法和酶切法，有學者認為酶切法產(chǎn)生的DNA片段用于建庫的效率更高。ctDNA突變豐度的定值較困難。理論上采用具有100%突變頻率的細胞系基因組DNA與野生型細胞系勾兌可完成配制。但細胞系的基因組突變與健康人的胚系基因突變不同，純合型和雜合型突變的頻率多不是100%和50%，難以克隆到某基因突變頻率為100%的細胞系，即便尋找到或克隆到這類細胞系，傳代對突變豐度的影響也不清楚。期待突變豐度賦值準確、基質(zhì)與血漿類似、內(nèi)含的DNA建庫效率高、片段大小與ctDNA一致、適用于NGS質(zhì)量控制的參考品問世。

[1]Xue C, Hu Z, Jiang W,etal. National survey of the medical treatment status for non-small cell lung cancer (NSCLC) in China[J]. Lung Cancer, 2012, 77 (2): 371-375.

[2]Fleischhacker M, Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer--a survey[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1775 (1): 181-232.

[3]Diehl F, Schmidt K, Choti MA,etal. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics[J]. Nat Med, 2008, 14 (9): 985-990.

[4]Langford MP, Redens TB, Harris NR,etal. Plasma levels of cell-free apoptotic DNA ladders and γ-glutamyltranspeptidase (GGT) in diabetic children[J]. Exp Biol Med, 2007, 232 (9): 1160-1169.

[5]Anker P, Stroun M. Circulating DNA in plasma or serum[J]. Medicina, 2000, 60 (5 Pt 2): 699-702.

[6]Diehl F, Li M, Dressman D,etal. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102 (45): 16368-16373.

[7]Holdhoff M, Schmidt K, Donehower R,etal. Analysis of circulating tumor DNA to confirm somaticKRASmutations[J]. J Natl Cancer Inst, 2009, 101 (18): 1284-1285.

[8]Baris I, Etlik O, Koksal V,etal. SYBR green dye-based probe-free SNP genotyping: introduction of T-Plex real-time PCR assay[J]. Anal Biochem, 2013, 441 (2): 225-231.

[9]姜文燦，岳素文，江洪，等. TaqMan 探針法實時熒光定量PCR 的應(yīng)用和研究進展[J]. 臨床檢驗雜志, 2015, 33(1): 797-805.

[10]Liu W, Hu T, Chen Y,etal. Development and validation of a tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction combined with melting analysis-assay for clinicalJAK2 V617F mutation detection[J]. Mol Diagn Ther, 2014, 18 (5): 579-585.

[11]Liu X, Lu Y, Zhu G,etal. The diagnostic accuracy of pleural effusion and plasma samples versus tumour tissue for detection ofEGFRmutation in patients with advanced non-small cell lung cancer: comparison of methodologies[J]. J Clinl Pathol, 2013, 66 (12): 1065-1069.

[12]Zhou Q, Zhang XC, Chen ZH,etal. Relative abundance ofEGFRmutations predicts benefit from gefitinib treatment for advanced non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2011, 29 (24): 3316-3321.

[13]Yang X, Zhuo M, Ye X,etal. Quantification of mutant alleles in circulating tumor DNA can predict survival in lung cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(15): 20810-20824.

[14]Sanmamed MF, Fernandez-Landazuri S, Rodriguez C,etal. Quantitative cell-free circulatingBRAFV600E mutation analysis by use of droplet digital PCR in the follow-up of patients with melanoma being treated withBRAFinhibitors[J]. Clin Chem, 2015, 61 (1): 297-304.

[15]Watanabe M, Kawaguchi T, Isa S,etal. Ultra-sensitive detection of the pretreatmentEGFRT790M mutation in non-small cell lung cancer patients with anEGFR-activating mutation using droplet digital PCR[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21 (15): 3552-3560.

[16]Zhu G, Ye X, Dong Z,etal. Highly sensitive droplet digital PCR method for detection ofEGFR-activating mutations in plasma cell-free DNA from patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. J Mol Diagn, 2015, 17 (3): 265-272.

[17]Oshiro C, Kagara N, Naoi Y,etal.PIK3CAmutations in serum DNA are predictive of recurrence in primary breast cancer patients[J]. Breast Cancer Res Treat, 2015, 150 (2): 299-307.

[18]Taly V, Pekin D, Benhaim L,etal. Multiplex picodroplet digital PCR to detectKRASmutations in circulating DNA from the plasma of colorectal cancer patients[J]. Clin Chem, 2013, 59 (12): 1722-1731.

[19]Tawfik DS, Griffiths AD. Man-made cell-like compartments for molecular evolution[J]. Nat Biotechnol, 1998, 16 (7): 652-656.

[20]Margulies M, Egholm M, Altman WE,etal. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J]. Nature, 2005, 437(7057): 376-380.

[21]Beaver JA, Jelovac D, Balukrishna S,etal. Detection of cancer DNA in plasma of patients with early-stage breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20 (10): 2643-2650.

[22]Mosko MJ, Nakorchevsky AA, Flores E,etal. Ultrasensitive detection of multiplexed somatic mutations using MALDI-TOF mass spectrometry[J]. J Mol Diagn, 2016, 18 (1): 23-31.

[23]Newman AM, Bratman SV, To J,etal. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J]. Nat Med, 2014, 20 (5): 548-554.

[24]Forshew T, Murtaza M, Parkinson C,etal. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA[J]. Sci Transl Med, 2012, 4 (136): 1-14.

[25]Rothe F, Laes JF, Lambrechts D,etal. Plasma circulating tumor DNA as an alternative to metastatic biopsies for mutational analysis in breast cancer[J]. Ann Oncol, 2014, 25 (10): 1959-1965.

[26]Tie J, Wang Y, Tomasetti C,etal. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage II colon cancer[J]. Sci Transl Med, 2016, 8 (346): 1-11.

[27]Reinert T, Scholer LV, Thomsen R,etal. Analysis of circulating tumour DNA to monitor disease burden following colorectal cancer surgery[J]. Gut, 2016, 65 (4): 625-634.

[28]Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J,etal. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1)[J]. Eur J Cancer, 2009, 45 (2): 228-247.

[29]陳陽陽，張潔，徐國賓. 晚期肺癌患者一線化療后6 種血清腫瘤標志物水平的變化及意義[J]. 臨床檢驗雜志, 2015, 33 (2): 124-129.

[30]Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M,etal. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer[J]. N Engl J Med, 2013, 368 (13): 1199-1209.

[31]《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制. 非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2015, 95 (46): 3721-3726.

[32]Weber B, Meldgaard P, Hager H,etal. Detection ofEGFRmutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays[J]. BMC Cancer, 2014, 14 (294): 1-6.

[33]Yang X, Zhuo M, Ye X,etal. Quantification of mutant alleles in circulating tumor DNA can predict survival in lung cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7 (15): 20810-20824.

[34]Oxnard GR, Paweletz CP, Kuang Y,etal. Noninvasive detection of response and resistance inEGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20 (6): 1698-1705.

[35]De Roock W, Claes B, Bernasconi D,etal. Effects ofKRAS,BRAF,NRAS, andPIK3CAmutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis[J]. Lancet Oncol, 2010, 11 (8): 753-762.

[36]Danese E, Minicozzi AM, Benati M,etal. Comparison of genetic and epigenetic alterations of primary tumors and matched plasma samples in patients with colorectal cancer[J]. PLoS One, 2015, 10 (5): 1-11.

[37]Spindler KL, Pallisgaard N, Andersen RF,etal. Circulating free DNA as biomarker and source for mutation detection in metastatic colorectal cancer[J]. PLoS One, 2015, 10 (4): 1-14.

[38]Liang W, Zhang L, Jiang G,etal. Development and validation of a nomogram for predicting survival in patients with resected non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2015, 33 (8): 861-869.

[39]Kinugasa H, Nouso K, Miyahara K,etal. Detection of K-ras gene mutation by liquid biopsy in patients with pancreatic cancer[J]. Cancer, 2015, 121 (13): 2271-2280.

(本文編輯：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.01

徐婷，1989年生，女，博士研究生，研究方向為腫瘤液體活檢技術(shù)的應(yīng)用；徐國賓，1963年生，男，研究員，博士研究生導師，研究領(lǐng)域為腫瘤生物化學與分子生物學檢驗；徐婷與徐國賓對本文具有同等貢獻，同為第一作者。

季加孚，教授，博士研究生導師，E-mail：jijiafu@hsc.pku.edu.cn。

R446；R730.3

A

2016-12-20)