李雪 吳曉梅

干細胞與肺的損傷和修復(fù)的最新研究

李雪 吳曉梅

肺臟組織結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，包括多種分化成熟的上皮細胞、兩套血液系統(tǒng)、兩種分化成熟的平滑肌組織及獨立的免疫系統(tǒng)。由于肺臟結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，所以我們對肺臟的損傷及其修復(fù)機制的了解是有限的，世系追蹤法和細胞標記技術(shù)的發(fā)展，讓我們更多的認識了不同的肺干細胞。關(guān)于肺干細胞的研究主要側(cè)重于上皮細胞的研究，目前還沒有證據(jù)證明在肺臟損傷及其修復(fù)過程中，一個單一的肺干細胞能夠像血液系統(tǒng)中祖細胞那樣分化成不同的細胞系。研究證實不同部位的肺上皮細胞是由相應(yīng)解剖部位的肺干細胞分化而來，雖然肺間質(zhì)祖細胞在小鼠胚胎組織研究中也具有解剖局限性[1]，但在成熟的肺臟組織中是否具有同樣局限性，目前研究還未證實。研究發(fā)現(xiàn)，從肺臟近端氣管遠端到肺泡，至少有40種不同表型的細胞，由此可見肺組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。越來越多的研究熱衷于肺干細胞，是基于探究肺干細胞在肺臟受損修復(fù)過程中的作用。

肺干細胞

一、氣管和近端支氣管干細胞

小鼠的氣管和主支氣管表面是由假復(fù)層纖毛柱狀上皮覆蓋，假復(fù)層纖毛柱狀上皮包括基底細胞和三種不同類型的腔細胞(纖毛細胞、棒狀細胞、刷細胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細胞)。基底細胞高表達轉(zhuǎn)錄因子Trp63和細胞角蛋白5,14(Krt5/14)及水通道蛋白3。在一些活體的世系追蹤試驗中發(fā)現(xiàn)基底細胞是由許多不同的干細胞組成，是肺部許多其他細胞的前體細胞[2],并且在穩(wěn)態(tài)時分化成不同的腔細胞，而在肺臟修復(fù)過程中分化成不同的上皮細胞[3]。研究表明在氣管受到損傷時棒狀細胞可以分化成纖毛細胞[4]，可以說棒狀細胞在細胞系中是位于基底細胞和纖毛細胞之間的一種中間態(tài)細胞。在實驗研究中，人為去除Krt5的基底細胞，則發(fā)現(xiàn)一種已分化的棒狀細胞會發(fā)生去分化，補充被去除Krt5+的基底細胞，并且擁有與原基底細胞相同的增殖分化能力[5]。這證明了氣道上皮細胞的可塑性，同時也說明了在氣道損傷修復(fù)過程中，不同細胞表型的氣道上皮干細胞之間可以相互轉(zhuǎn)化。

二、遠端氣道干細胞

研究發(fā)現(xiàn)小鼠的遠端氣道表皮是由單層纖毛細胞和一些分泌性細胞構(gòu)成，在人體氣道的遠端也存在Trp63+/ Krt5+的基底細胞。纖毛細胞遍布整個氣道，并且表達轉(zhuǎn)錄因子FOXJ1和細胞骨架蛋白TUBB4。遠端氣道也存在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(NECs)，其表達轉(zhuǎn)錄因子ASCL1和PROX1[6]，與近端氣管支氣管的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞相比，遠端氣道的NECs紊亂的排列在上皮細胞中。分泌細胞也被稱作棒狀細胞，能夠特異性的表達SCGB1A1。最近研究數(shù)據(jù)表明，在肺臟的穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中，棒狀細胞通過NOTCH2受體與纖毛細胞的JAG1和JAG2相互作用，在實驗小鼠的大氣道及小氣道中，若這一信號軸被破壞，將會導(dǎo)致大量的纖毛細胞取代棒狀細胞，同時在患有哮喘的小鼠模型中，這一信號軸的破壞會逆轉(zhuǎn)杯狀細胞的化生[7]。許多關(guān)于氣道遠端上皮修復(fù)的研究數(shù)據(jù)來源于特異性萘標記的棒狀細胞，將棒狀細胞暴露于萘毒素中，將會導(dǎo)致大量杯狀細胞損傷和脫落等一系列損傷反應(yīng)。然而，還存在一種棒狀細胞亞型，特征性的缺失細胞色素P450家族成員中的CYP2F2，其可以抵抗萘毒素的損傷。這種細胞亞型分布于神經(jīng)內(nèi)分泌小體和肺泡導(dǎo)管連接處，并特異性的轉(zhuǎn)化成棒狀細胞，這位于神經(jīng)內(nèi)分泌小體附近的棒狀細胞轉(zhuǎn)化體能夠特異性的表達UPK3A[8]。通過世系追蹤法研究發(fā)現(xiàn)， SCGB1A1+/CYP2F2棒狀細胞經(jīng)萘毒素損傷后可以通過自我修復(fù)和分化成纖毛細胞和CYP2F2棒狀細胞,進而來修復(fù)損傷的上皮細胞，這表明在小氣道損傷中，轉(zhuǎn)化體棒狀細胞作為上皮細胞的祖細胞參與修復(fù)。同時，實驗研究證實，在小氣道上皮的損傷中，神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的缺失并不總影響轉(zhuǎn)化體棒狀細胞參與上皮細胞的損傷修復(fù)[9]。在實驗中，在小鼠出生后，人為去除棒狀細胞的組蛋白脫乙?；?和組蛋白脫乙酰基酶2，將會導(dǎo)致棒狀細胞的增殖減少和上皮細胞的持續(xù)性損失，這表明在小氣道上皮的再生和經(jīng)萘毒素損傷后的修復(fù)過程中，組蛋白脫乙?；?和組蛋白脫乙酰基酶2發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。在上氣道表型細胞的可塑性研究中，通過世系追蹤法研究表明，在遠端氣道上皮細胞的損傷中，神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(NCEs)也可以分化成棒狀細胞，但是他莫昔芬藥物會影響此實驗結(jié)果[9]。

三、肺泡導(dǎo)管連接處干細胞

終末細支氣管和肺泡的過渡區(qū)域被成為肺泡導(dǎo)管鏈接處，此處存在一種細胞被稱作支氣管肺泡干細胞(BASCs)，其共同表達Ⅱ型肺泡上皮細胞(AEC2s)標記物SCGB1A1和SFTPC，并能夠特異性表達Clara細胞特異性蛋白(CCSP)和肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(SP-C)，BASCs在上皮損傷修復(fù)期間增殖，在體外培養(yǎng)可形成細胞克隆，具有自我復(fù)制和定向分化的能力。在基于大量的活體小鼠氣道上皮細胞更新的研究中，BASCs可以抵抗細支氣管和肺泡的損傷，并可以增殖分化為上皮細胞，這表明對于小氣道和肺泡上皮而言，BASCs是具有干細胞增殖分化能力的[11]。

四、肺泡上皮細胞

肺泡上皮細胞主要分為I型(AEC1)和Ⅱ型(AEC2)肺泡上皮細胞。AEC1約占肺泡表面的95%，主要參與氣體的交換，細胞表面特異性表達水通道蛋白5。最近一項研究表明，一小部分特異性表達HOPX的I型肺泡上皮細胞在局部肺切除后，能夠分化增殖為Ⅱ型肺泡上皮細胞[12]。Ⅱ型肺泡上皮細胞(AEC2)鑲嵌于I型肺泡上皮細胞中，并可以分泌肺泡表面活性物質(zhì)，細胞表面特異性表達SFTPC和LYZ2。Barkauskas 等人研究發(fā)現(xiàn)，在肺的穩(wěn)態(tài)環(huán)境中，成熟小鼠肺臟的AEC2作為一種祖細胞，可以分化成I型和Ⅱ型肺泡上皮細胞[13]。在高氧、博來霉素損傷及人為去除AEC2后，細胞的增殖加速，并且一小部分AEC2可以分化成AEC1[12、14]。在損傷后，多種信號分子參與AEC2的增殖與調(diào)控，如：表皮生長因子和癌基因Kras。最新研究發(fā)現(xiàn)，在遠端氣道存在另一種肺干細胞，例如，一種整合素蛋白a6b4+SFTPC-的肺泡干細胞被發(fā)現(xiàn)，并且被認為在肺泡上皮的損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[15]。在小鼠流感病毒感染后，遠端氣道干細胞立即增殖參與損傷修復(fù)，這些遠端氣道干細胞可以表達基底細胞標記Trp63和Krt5，并且在損傷后可以分化成不同的肺泡細胞和細支氣管上皮細胞[16]。

五、成纖維細胞和肌成纖維細胞

目前尚無明確的定義來界定成纖維細胞和肌成纖維細胞，兩種細胞的外形相似，并且均來自于間葉細胞。氣道損傷后，肌成纖維細胞是組織連接蛋白的主要來源，并且在肺纖維化中的致病作用越來越受到人們的重視。有研究證明肺肌成纖維細胞是來源于血管周圍間葉組織干細胞，生長因子-β、Wnt/β-catenin信號通路，血管內(nèi)皮生長因子、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等在肺纖維化這一病理過程中起重要的推動作用[17]。遠端肺臟纖維化源于局部遭受一系列的反復(fù)性損傷所致，這些持續(xù)性損傷會導(dǎo)致毛細血管周圍成纖維細胞的Wnt/β-catenin信號通路、Notch通路被激活，進而發(fā)生成纖維細胞與肌成纖維細胞間的相互轉(zhuǎn)化，促使肺纖維化這一病理過程的進展[18]。

六、間充質(zhì)干細胞

Friedenstein首次發(fā)現(xiàn)在骨髓里存在一種不純一的細胞群體，這種細胞在體外培養(yǎng)時貼壁生長，形態(tài)和成纖維細胞相似，呈克隆性增殖，并提出“髓間充質(zhì)干細胞”(mesenchymal stem cells MSC)的概念[18]。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)是骨髓來源的造血干細胞以外的另一種成體干細胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，因此，MSC被認為是一種理想的外源性修復(fù)種子細胞。間充質(zhì)干細胞可以從多種器官的間質(zhì)組織中分離出來，比如：骨髓組織、肌肉組織、骨膜、 脂肪組織、皮膚及肺臟等。

干細胞治療肺部疾病的臨床進展

2014年Matthay等開展了針對人體間充質(zhì)干細胞(MSCs)治療ARDS安全性的Ⅰ期臨床試驗，將為MSCs應(yīng)用于臨床治療ARDS提供可靠依據(jù)[19]。在動物模型中，MSCs通過免疫調(diào)節(jié)、旁分泌機制在急性肺損傷、支氣管哮喘、先天性支氣管肺發(fā)育不良、慢性阻塞性肺疾病、呼吸機相關(guān)性肺損傷及其他肺部疾病中發(fā)揮治療作用[20]。2013年Weiss等人開展的一項Ⅱ期臨床試驗證明，注射MSCs后，可以明顯降低慢阻肺患者血清中的C反應(yīng)蛋白(CRP)等炎性介質(zhì)水平，證明MSCs具有抑制慢阻肺患者體內(nèi)過度炎癥反應(yīng)的作用，一項最近研究已經(jīng)證實了MSCs用于治療慢阻肺的安全性[21]。

干細胞在肺再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展

由Jackson實驗室的Frank Mckeon博士和Wa Xian博士領(lǐng)導(dǎo)的一個研究小組研究發(fā)現(xiàn)：肺干細胞在疾病損傷后肺臟的再生過程中發(fā)揮重要作用。這項發(fā)表在《Nature》雜志上的研究闡明了肺臟再生新興概念的內(nèi)部運作機制。Mckeon說：“生物醫(yī)學(xué)研究界一直遲遲未接受肺臟可以再生這一觀點，其部分原因在于人們看到罹患慢阻肺和肺纖維化等嚴重疾病的患者中肺功能在進行性的衰退[16]。” 肺移植是治愈支氣管哮喘、BDP、慢阻肺和IPF等疾病的唯一治療方法，然而移植供體的嚴重短缺和移植后免疫排斥反應(yīng)，大大限制了肺移植的臨床應(yīng)用。2013年Huan運用IPS技術(shù)將人體皮膚細胞誘導(dǎo)成多功能干細胞 再誘導(dǎo)其分化出6種肺和氣道上皮細胞，包括基底上皮細胞 、杯狀上皮細胞 、Clara上皮細胞 纖毛上皮細胞及I型和Ⅱ型肺泡上皮細胞 其中90%的分化細胞產(chǎn)生了6種細胞的表面標記分子， 誘導(dǎo)分化效率極高。此外，分化得到的Ⅱ型肺泡上皮細胞具有攝取表面活性蛋白-β的能力,且在刺激下能分泌表面活性物質(zhì),直接提供了分化細胞具有特定功能的證據(jù)[22]。此成果將在工程肺構(gòu)建臨床肺部疾病模型的建立、藥物篩選和肺發(fā)育研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。

結(jié) 論

肺干細胞研究尚處于初級階段，很多問題尚未明確。由于肺部結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性及肺臟上皮細胞較低的更新率，目前還未找到鑒定肺干細胞組織的特異性因子，這使肺干細胞的研究面臨較大的困難。對于進一步明確肺部有關(guān)疾病的發(fā)病機制以及移植過程中可能會出現(xiàn)的免疫排斥等問題仍有待于進一步探索研究。面對肺干細胞研究所存在的困難，需要通過創(chuàng)新研究思路和技術(shù)方法來更深入的揭示肺干細胞在肺臟發(fā)育生長、損傷、疾病中的機理，為肺部疾病的治療奠定更好的基礎(chǔ)。

[1] Kumar M E, Bogard P E, Espinoza F H, et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution.[J]. Science, 2014, 346(6211):1258810-1258810.

[2] Watson J, Rulands S, Wilkinson A, et al. Clonal Dynamics Reveal Two Distinct Populations of Basal Cells in Slow-Turnover Airway Epithelium[J]. Cell Reports, 2015, 12(1):90-101.

[3] Rock J R, Onaitis M W, Rawlins E L, et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.[J]. Proc Nat Acad Scienc Unit Stat Am, 2009, 106(31):12771-12775.

[4] Rawlins E L, Okubo T, Xue Y, et al. The role of Scgb1a1+Clara cells in the long-term maintenance and repair of lung airway, but not alveolar, epithelium.[J]. Cell Stem Cell, 2009, 4(6):525-534.

[5] Tata P R, Mou H, Pardo-Saganta A, et al. Dedifferentiation of committed epithelial cells into stem cells in vivo.[J]. Nature, 2013, 503(7475):218-223.

[6] 薛明明, 李焱, 亓雪蓮,等. 肺臟的呼吸腺泡及其成體干細胞研究進展[J]. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報, 2011(2):159-166.

[7] Lafkas D, Shelton A, Chiu C, et al. Therapeutic antibodies reveal Notch control of transdifferentiation in the adult lung.[J]. Nature, 2015, 528(7580):127-131.

[8] Guha A, Vasconcelos M, Cai Y, et al. Neuroepithelial body microenvironment is a niche for a distinct subset of Clara-like precursors in the developing airways.[J]. Proc Nat Acad Scienc, 2012, 109(31):12592-12597.

[9] Song H, Yao E, Lin C, et al. Functional characterization of pulmonary neuroendocrine cells in lung development, injury, and tumorigenesis.[J]. Proc Nat Acad Scienc, 2012, 109(43):17531-17536.

[10] Wang Y, Tian Y, Morley M P, et al. Development and regeneration of Sox2+endoderm progenitors are regulated by a Hdac1/2-Bmp4/Rb1 regulatory pathway.[J]. Developm Cell, 2011, 24(4):345-358.

[11] van Klaveren R J, van't Westeinde S C, de Hoop B J, et al. Stem Cells and the Natural History of Lung Cancer: Implications for Lung Cancer Screening[J]. Clin Canc Res, 2009, 15(7):2215-2218.

[12] Jain R, Barkauskas CE, Takeda N, et al. Plasticity of Hopx(+) type I alveolar cells to regenerate type Ⅱ cells in the lung[J]. Nat Commun, 2015, 6: 6727.

[13] Barkauskas C E, Cronce M J, Rackley C R, et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung[J]. J Clin Invest, 2013, 123(7):3025-3036.

[14] Desai T J, Brownfield D G, Krasnow M A. Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer[J]. Nature, 2014, 507(7491):190-194.

[15] Chapman H A, Li X, Alexander J P, et al. Integrin alpha6beta4 identifies an adult distal lung epithelial population with regenerative potential in mice[J]. J Clinl Invest, 2011, 121(7):2855-2862.

[16] Zuo W, Zhang T, Wu D Z, et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration[J]. Nature, 2015, 517(7536):616-620.

[17] Zheng Y, Zhang K, Zhu P. Reviews and prospectives of signaling pathway analysis in idiopathic pulmonary fibrosis.[J]. Autoimmunity Reviews, 2014, 13(10):1020-1025.

[18] Caplan A I. Mesenchymal stem cells [J]. J Orthop Res, 2009, 9(5):641-650.

[19] Weiss D J, Bertoncello I, Borok Z, et al. Stem cells and cell ther-apies in lung biology and lung diseases.[J]. Proceed Am Thor Soc, 2011, 8(3):637-667.

[20] Toonkel R L, Hare J M, Matthay M A, et al. Mesenchymal stem cells and idiopathic pulmonary fibrosis. Potential for clinical testing[J]. Am J Resp Crit Care Med, 2013, 188(2):133-140.

[21] Weiss D J, Casaburi R, Flannery R, et al. A Placebo-Controlled, Randomized Trial of Mesenchymal Stem Cells in COPD[J]. Chest, 2013, 143(6):1590-1598.

[22] 李燕, 陳誠, 邵燕,等. 干細胞在肺部疾病治療中的研究和應(yīng)用進展[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué), 2016(1):57-59.

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.04.042

150086 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科

吳曉梅 ，E-mail：wuxiaomeihx@163.com

2016-11-03]