韓慶，沈德良，王勃，張金盈

（1.鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450007；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

瑞舒伐他汀抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

韓慶1，沈德良2，王勃2，張金盈2

（1.鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450007；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.006

目的研究瑞舒伐他汀是否可以抑制大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（VSM C s）表型轉(zhuǎn)化及其機(jī)制。方法SD大鼠主動(dòng)脈VSM C s原代細(xì)胞培養(yǎng)鑒定，取4～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)VSM C s，W es t ern bl ot檢測(cè)各組標(biāo)本中骨骼肌肌動(dòng)蛋白（SM-act i n）、平滑肌22α（SM-22α）、滑肌肌球蛋白重鏈（SMM H C）、骨橋蛋白（O PN）的表達(dá)，噻唑藍(lán)（M TT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，劃痕試驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況。通過免疫組織化學(xué)法（IC C）檢測(cè)SM-act i n的表達(dá)從而觀察VSM C的形態(tài)。轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4或空白對(duì)照質(zhì)粒至離體培養(yǎng)的VSM C s中，用瑞舒伐他汀干預(yù)，并采用上述實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)VSM C s表型轉(zhuǎn)化情況。結(jié)果M TT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組VSM C s增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，他汀組VSM C s遷移減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。W es t ern bl ot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，他汀組VSM C s中SM-22α、SM-M H C、O PN表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IC C結(jié)果顯示，與對(duì)照組VSM C s的細(xì)胞形態(tài)比較，他汀組VSM C s形態(tài)變細(xì)、變長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染KLF-4過表達(dá)質(zhì)粒后，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染KLF-4過表達(dá)質(zhì)?？梢栽黾覸SM C s的增殖和遷移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），逆轉(zhuǎn)他汀對(duì)VSM C s表型轉(zhuǎn)化有抑制作用。結(jié)論瑞舒伐他汀通過下調(diào)KLF-4，抑制大鼠主動(dòng)脈VSM C s表型轉(zhuǎn)化。

動(dòng)脈粥樣硬化；瑞舒伐他?。谎芷交〖?xì)胞；表型轉(zhuǎn)化

血管平滑肌細(xì)胞（vascul ar sm oot h m uscl e cel l s，VSM Cs）的增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中重要的病理基礎(chǔ)，也是造成支架植入術(shù)或冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后冠狀動(dòng)脈再狹窄的重要原因[1]。最近有研究顯示，血管平滑肌細(xì)胞在不同的分化階段具有不同的細(xì)胞表型，不同表型之間的平滑肌細(xì)胞生理特性相差巨大，并且在外界因素發(fā)生變化時(shí)，VSM Cs不同表型之間可以相互轉(zhuǎn)化[2]。正常血管中的VSM Cs一般是已分化的收縮型平滑肌細(xì)胞，在血管受到損傷時(shí)，一些已分化的收縮型VSM Cs可以去分化，成為分泌型細(xì)胞。收縮型VSM Cs低增殖、低分泌，特異性表達(dá)骨骼肌肌動(dòng)蛋白（skel et al m uscl e act i n，SM-act i n）、平滑肌22α（sm oot h m uscl e 22α，SM-22α）、滑肌肌球蛋白重鏈（sm oot h m uscl e m yosi n heavy chai n, SM-M H C）等具有標(biāo)志意義的特征性蛋白，分泌型VSM Cs增殖加快，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加[3]，骨橋蛋白（Ost eopont i n，OPN）、基質(zhì)金屬蛋白酶（m at ri x m et all oprot ei nases，M M Ps）等蛋白表達(dá)增多[4]。過去的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在粥樣斑塊中，收縮型VSM Cs減少，分泌型VSM Cs增多[5]。最近研究證實(shí)，V脈粥樣SM Cs表型轉(zhuǎn)化在動(dòng)硬化的病理發(fā)展過程中具有重要的作用[6]。

他汀類藥物通過降脂、改善內(nèi)皮功能、減輕或消除炎癥反應(yīng)、抑制血管平滑肌增殖等作用延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。瑞舒伐他汀可以顯著減少低密度脂蛋白受體-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)粥樣硬化斑塊的面積，抑制高半胱氨酸（H om ocyst ei ne，H cy）誘導(dǎo)的VSM Cs表達(dá)M M Ps等，破壞細(xì)胞外基質(zhì)平衡的蛋白[9]。但是瑞舒伐他汀是否可以抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化，以及其作用機(jī)制尚未探明。本實(shí)驗(yàn)通過用不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)VSM Cs，觀察瑞舒伐他汀對(duì) VSM Cs表型轉(zhuǎn)化及對(duì) Krüppel樣因子 4（Krüppel-l i ke f act or4，KLF4）表達(dá)的影響，再通過在VSM Cs中轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4質(zhì)粒，觀察過表達(dá)KLF-4對(duì)VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的影響，驗(yàn)證KLF-4是否參與他汀抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的過程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級(jí)SD大鼠，雌雄不限，50 d左右，體重150～180 g（購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清（美國(guó)Gi bco公司），瑞舒伐他汀鈣（美國(guó)Si gm a公司），RNA提取試劑（美國(guó)Invi t rogen公司），無內(nèi)毒素質(zhì)粒小、大提取試劑盒、脂質(zhì)體2000均購(gòu)自上海英駿公司，4',6-二脒基-2- 苯 基 吲 哚（4'，6-di am i di no-2-phenyl i ndol e，DAPI）（瑞士Rcohe公司），噻唑藍(lán)[3-（4，5-di m et hyl-2-t hi azol yl）-2，5-di phenyl-2-H-t et razol i um brom i de，M TT]（美國(guó)Em resco公司），兔或鼠抗兔SM-act i n、SM-22α、SM-M CH、OPN、KLF-4、β-act i n多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、異硫氰酸熒光素、異硫氰酸熒光素（f l uorescei n i sot hi ocyanat e，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G均購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，蛋白免疫印跡相關(guān)試劑（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VSM C原代細(xì)胞培養(yǎng) 采用組織貼塊法培育大鼠胸主動(dòng)脈VSM Cs，采用形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)SM A，鑒定VSM Cs。通過SM A與DAPI核染的關(guān)系鑒定VSM Cs的純度，取第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用脂質(zhì)體Li pof ect am i ne 2000轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)使用不含胎牛血清改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染6 h后改換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞中的總蛋白，通過W est ren bl ot檢測(cè)KLF-4的表達(dá)鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分兩部分，第一部分用以驗(yàn)證瑞舒伐他汀是否可以抑制KLF-4的表達(dá)及VSM Cs表型轉(zhuǎn)化。VSM Cs分4組：對(duì)照組、1μm ol/L瑞舒伐他汀組、5μm ol/L瑞舒伐他汀組、20μm ol/L瑞舒伐他汀組 [瑞舒伐他汀用0.1%二甲基亞砜（di m et hyl sul f oxi de，DM SO）溶解]。第二部分用以驗(yàn)證瑞舒伐他汀通過下調(diào)KLF-4抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化。細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、他汀組、過表達(dá)KLF-4組、他汀+過表達(dá)KLF-4組。

1.2.3 KLF-4過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 通過Pubm ed查找KLF-4基因序列，引物根據(jù)Genebank中KLF-4m RNA序列設(shè)計(jì)引物。正向引物：5'-CGCG GATCCATGAGCAGCCACCTGGCGAGTC-3'；反向引物：5'-CCGCTCGAGTCATTAAAAATGCCTCCTCATGTGT-3'。通過Pri m est ar法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增KLF-4基因片段，獲得的KLF-4基因片段用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線觀察目的條帶，膠回收，靶基因恢復(fù)KLF-4和質(zhì)粒DNA的T4DNA連接酶相同的酶切連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，涂層板，篩選重組質(zhì)粒，質(zhì)粒提取后測(cè)序驗(yàn)證。將VSM C細(xì)胞接種至6孔板，生長(zhǎng)至50%～70%密度時(shí)，以脂質(zhì)體Li pof ect am i ne 2000分別轉(zhuǎn)染KLF-4或空白對(duì)照各100 pm ol，24 h后，提取總蛋白鑒定轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 W es t ern bl ot檢測(cè)蛋白表達(dá)量 轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4的質(zhì)粒或者空白質(zhì)粒的VSM Cs血清饑餓24 h同步化，用1.2.2中不同的瑞舒伐他汀干預(yù)，培養(yǎng)48 h后，提取各組細(xì)胞中總蛋白，二喹啉甲酸（bi ci nchoni ni c aci d，BCA）法定量蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodi um dodecylsul f at e-pol yacryl am i de gel el ect ro-phoresi s，SDS-PAGE）凝膠每孔加入30μl樣品，70V 30m i n進(jìn)行蛋白濃聚，110V 2h進(jìn)行凝膠電泳，并用孔徑0.45μm聚偏氟乙烯膜250 m A 100 m i n進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后經(jīng)常溫下三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（t ri s buf f ered sal i ne and t ween 20，TBST）洗膜3次，封閉1 h后，以1∶1 000濃度加入兔（鼠）抗人 SM-act i n一抗（或抗SM-22α、SM-M H C、OPN、KLF-4、β-act i n一抗），4℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔（鼠）二抗孵育后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)?？逻_(dá)膠片暗室顯影，Quant i t y one軟件分析。

1.2.5 M TT法檢測(cè) VSM C s增殖 轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4的質(zhì)?；蛘呖瞻踪|(zhì)粒的VSM Cs在96孔板中培養(yǎng)，血清饑餓24 h同步化之后，用1.2.2中不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，2個(gè)不加細(xì)胞的空白孔。細(xì)胞在各自條件下培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入M TT液20μl，37℃下繼續(xù)孵育4～6 h，小心棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl DM SO溶液，震蕩10 m i n，選擇492 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光密度（opt i cal del nsi t y，OD）值并記錄。以時(shí)間為橫軸，吸光值為縱軸繪制各組VSM Cs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VSM C s遷移 轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4的質(zhì)?；蛘呖瞻踪|(zhì)粒的VSM Cs在6孔板中培養(yǎng)，血清饑餓24 h同步化之后，用1.8 m m ol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，100μl黃色槍頭垂直孔板制造細(xì)胞劃痕，吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液（phosphat e buf f er sal i ne，PBS）沖洗3次，用1.2.2中不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)，在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，拍照記錄0、12、24、48和72 h圖片，Im age pro pl us 6.0軟件分析計(jì)算細(xì)胞遷移面積，并以遷移面積與原劃痕面積比值來表示各組VSM Cs遷移的多少。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組SM-act i n在細(xì)胞中的分布及表達(dá) VSM Cs按1.2.2中分組在96孔板中培養(yǎng)，同步化之后加入不同濃度的瑞舒伐他汀，培養(yǎng)48 h后，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定，0.25% Tri t on X 100穿破細(xì)胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋250倍的ant i-SM A抗體，4℃過夜，PBS清洗3遍，加入結(jié)合有異硫氰酸熒光素的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后圖片用Iam ge pro pl us 6.0軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均比較用單因素方差分析，若方差齊則兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs原代培養(yǎng)鑒定

組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠胸主動(dòng)脈VSM Cs，8d左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出，2周左右細(xì)胞融合可傳代。傳代后細(xì)胞呈典型峰谷狀排列生長(zhǎng)，用SM-act i n細(xì)胞免疫熒光鑒定VSM C，DAPI核染后確定細(xì)胞純度＞99%。見圖1。

圖1 VSMCs原代培養(yǎng)鑒定

2.2 瑞舒伐他汀抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化

2.2.1 瑞舒伐他汀抑制VSM C s增殖和遷移 不同濃度的瑞舒伐他汀處理12 h后，各組OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.531，P=0.012）。與對(duì)照組比較，24 h后瑞舒伐他汀組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.513，P=0.012），并與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關(guān)，說明瑞舒伐他汀可抑制VSM Cs的增殖。各干預(yù)因素處理48 h后，與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組VM SCs的遷移面積減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 15.682，P=0.001），并與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關(guān)，說明瑞舒伐他汀可抑制VSM Cs的遷移。見圖2。

2.2.2 瑞舒伐他汀抑制VSM C s形態(tài)變化 不同濃度的瑞舒伐他汀處理48 h后，各組平滑肌細(xì)胞中SM-act i n熒光形態(tài)不同，對(duì)照組中形態(tài)變圓，SM-act i n排列紊亂，失去VSM Cs原有的細(xì)胞形態(tài)。與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組中VSM Cs細(xì)長(zhǎng)呈梭形，SM-act i n排列整齊。見圖3。

圖2 瑞舒伐他汀抑制VSMCs增殖和遷移

2.2.3 瑞舒伐他汀影響VSM C s內(nèi)細(xì)胞表型相關(guān)蛋白及KLF-4的表達(dá) 各組VSM Cs中SM-act i n表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.346，P=0.349）。與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組VSM Cs中SM-22α和SM-M H C表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.917，P=0.000），并與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關(guān)；OPN和KLF-4的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.371，P=0.000）。見圖4。

圖3 瑞舒伐他汀抑制VSMCs形態(tài)變化

2.3 過表達(dá)KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用

2.3.1 過表達(dá)KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM C s增殖和遷移的抑制作用 與空質(zhì)粒對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4質(zhì)粒組VSM Cs中KLF-4的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.838，P=0.000）。與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 9.436，P=0.002）；轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4質(zhì)粒后，與對(duì)照組比較，KLF-4組、瑞舒伐他汀+KLF-4組的OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.562，P=0.000），說明過表達(dá)KLF-4可以增加VSM Cs的增殖，逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM Cs增殖的抑制的作用。與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組VSM Cs遷移面積減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.255，P=0.000）；與對(duì)照組比較，KLF-4過表達(dá)組和瑞舒伐他汀+KLF-4組VSM Cs遷移面積增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.938，P=0.000），說明過表達(dá)KLF-4可以增加VSM Cs的遷移，逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM Cs遷移的抑制作用。見圖5。

2.3.2 過表達(dá)KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM C s形態(tài)變化的抑制作用 與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組中VSM Cs細(xì)長(zhǎng)呈梭形，SM-act i n排列整齊。轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4質(zhì)粒后，KLF-4組和瑞舒伐他汀+KLF-4組中VSM Cs形態(tài)變圓，SM-act i n排列紊亂，失去VSM Cs原有的細(xì)胞形態(tài)，說明過表達(dá)KLF-4可以導(dǎo)致VSM Cs形態(tài)變圓，逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀的作用。見圖6。

圖4 Western blot檢測(cè)各組VSMCs中SM-actin、SM-22α、SM-MHC、OPN及KLF-4的表達(dá)

圖5 過表達(dá)KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSMCs增殖和遷移的抑制作用

2.3.3 過表達(dá)KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM C s內(nèi)細(xì)胞表型相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組SM-M H C、SM 22α表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.541，P=0.000），OPN、KLF-4表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.518，P=0.000）；轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4質(zhì)粒后，與對(duì)照組比較，KLF-4組、瑞舒伐他汀+KLF-4組的SM-M H C、SM 22α表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.784，P=0.032），OPN表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.723，P=0.000），說明過表達(dá)KLF-4可以減少SM-M H C、SM 22α的表達(dá)，增加OPN的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用。見圖7。

圖6 過表達(dá)KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSMCs形態(tài)變化的抑制作用

圖7 Western blot檢測(cè)各組VSMCs中SM-actin、SM-22α、SM-MHC、OPN及KLF-4的表達(dá)

3 討論

在不同的外界因素刺激下，VSM C有不同的細(xì)胞表型，具有很強(qiáng)的可塑性。在正常血管中膜中，VSM Cs是一種高分化細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，主要起維持血管形狀和收縮血管的作用，具有低增殖、遷移慢、蛋白分泌少等特征[10]。當(dāng)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病時(shí)，VSM Cs可以去分化為未分化的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)變圓，收縮性能下降，表現(xiàn)出高增殖、高遷移、高蛋白分泌等特征[11]，在血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一大批特異性比較高，可以當(dāng)作已分化成熟VSM Cs標(biāo)志的蛋白，如與細(xì)胞收縮密切相關(guān)的 SM-act i n、SM-M H C、Cal poni n、SM 22α、Sm oot hel i n等蛋白，以及參與細(xì)胞骨架構(gòu)成的H-cal desm on、Tel oki n、β-vi ncul i n、M et avi ncul i n、Desm i n等蛋白[3]。該蛋白在收縮型VSM Cs中高表達(dá)，其表達(dá)量隨著VSM Cs的去分化而逐漸減少。相反，OPN、M M Ps、糖基質(zhì)蛋白等在去分化的分泌型VSM Cs中高表達(dá)，并且表達(dá)量跟細(xì)胞的去分化程度呈正相關(guān)[4]。因此結(jié)合VSM Cs的增殖和遷移，再檢測(cè)SM α-act i n、SM-M H C、 SM 22α及OPN等蛋白的表達(dá)，是近幾年來國(guó)內(nèi)外研究者常用的用來鑒別VSM Cs不同細(xì)胞表型的方法。

瑞舒伐他汀是一種選擇性羥甲基戊二酸甲酰輔酶A還原酶抑制劑，通過減少甲羥戊酸的生成，從而抑制膽固醇的合成，進(jìn)而降低血清中低密度脂蛋白的水平。最近許多研究表明，他汀類藥物的療效不僅能用其降脂作用來解釋，而且具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化、抗炎、抗心肌重構(gòu)等作用[12]。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀可以抑制VSM Cs的增殖和遷移，使VSM Cs細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)的梭形，增加SM-M H C、SM-22α的表達(dá)，減少OPN在VSM Cs中的表達(dá)，從而證實(shí)瑞舒伐他汀可以抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化，這可能也是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。同時(shí)，筆者也發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀可以抑制VSM Cs中KLF-4的表達(dá)。

KLF-4是一種真核鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖分化、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展等多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。過去的研究顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、血小板衍生生長(zhǎng)因子（pl at el et-deri ved growt h f act or-BB，PDGF-BB）、H cy等眾多因素對(duì)VSM Cs增殖有影響[13-16]。CHENG[17]和DAVIS-DUSENBERY等[18]發(fā)現(xiàn)，m i croRNA-145是通過抑制 KLF-4而減少VSM Cs的表型轉(zhuǎn)化。與此同時(shí)，ZH ENG等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在用PDGF-BB誘導(dǎo)VSM Cs表型轉(zhuǎn)化時(shí)，KLF-4的表達(dá)升高，抑制KLF-4的表達(dá)可以抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的作用。與上述研究結(jié)果相符，筆者通過向VSM Cs轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4的質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)KLF-4可以促進(jìn)VSM Cs的增殖和遷移，可以逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)VSM Cs，發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀具有抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化，減少KLF-4表達(dá)的作用。之后通過進(jìn)一步向VSM Cs轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF-4質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF-4可以促進(jìn)VSM Cs的增殖和遷移，逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對(duì)VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用，最終證實(shí)瑞舒伐他汀是通過下調(diào)KLF-4，抑制VSM Cs的表型轉(zhuǎn)化。

[1]ROTLLA N N,W ANSCH EL A C,FERNANDEZ-H ERNANDO A, et al.Genet i c evi dence support s a m aj or rol e f or AKT1 i n vsm cs duri ng at herogenesi s[J].Ci rc Res,2015,116(11)：1744-1752.

[2]OW ENS G K,KUM AR M S,W AM H OFF B R.M ol ecul ar regul at i on of vascul ar sm oot h m uscl e cel l di f f erent i at i on i n devel opm ent and di sease[J].Physi ol Rev,2004,84(3)：767-801.

[3]ALEXANDER M R,OW ENS G K.Epi genet i c cont rol of sm oot h m uscl e cel l di f f erent i at i on and phenot ypi c swi t chi ng i n vascul ar devel opm ent and di sease[J].Annu Rev Physi ol,2012,74：13-40.

[4]JIANG H,LUN Y,W U X,et al.Associ at i on bet ween t he hypom et hyl at i on of ost eopont i n and i nt egri n bet a3 prom ot ers and vascul ar sm oot h m uscl e cel l di f f erent i at i on i n great saphenous vari cose vei ns[J].Int J M ol Sci,2014,15(10)：18747-18761.

[5]GOM EZ D,OW ENS G K.Sm oot h m uscl e cel l phenot ypi c swi t chi ng i n at heroscl erosi s[J].Cardi ovasc Res,2012,95(2)：156-164.

[6]CH ISTIAKOV D A,OREKH OV A N,BOBRYSH EV Y V.Vascul ar sm oot h m uscl e cel l i n at heroscl erosi s[J].Act a Physi ol(Oxf), 2015,214(1)：33-50.

[7]KOH LI P,W ATERS D D,NEM R R,et al.Ri sk of new-onset di abet es and cardi ovascul ar ri sk reduct i on f rom hi gh-dose st at i n t herapy i n pre-di abet i cs and non-pre-di abet i cs：an anal ysi s f rom TNT and IDEAL[J].J Am Col l Cardi ol,2015,65(4)：402-404.

[8]ROSENSON R S,KENT S T,BROW N T M,et al.Underut i l i zat i on of hi gh-i nt ensi t y st at i n t herapy af t er hospi t al i zat i on f or coronary heart di sease[J].J Am Col l Cardi ol,2015,65(3)：270-277.

[9]SH I Y F,CH I JF,TANG W L,et al.Ef f ect s of rosuvast at i n on t he product i on and act i vat i on of m at ri x m et al l oprot ei nase-2 and m i grat i on of cul t ured rat vascul ar sm oot h m uscl e cel l s i nduced by hom ocyst ei ne[J].Journal of Zhej i ang Uni versi t y-Sci ence B, 2013,14(8)：696-704.

[10]季軍,潘一峰,何霞,等.超聲靶向轉(zhuǎn)染c-m yc基因的反義肽核酸抑制兔髂動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2015,25(2)：32-36.

[11]LIU R,LESLIE K L,M ARTIN K A.Epi genet i c regul at i on of sm oot h m uscl e cel l pl ast i ci t y[J].Bi ochi m Bi ophys Act a,2014, 24(4)：567-579.

[12]TOUSOULIS D,PSARROS C,DEM OSTH ENOUS M,et al.Innat e and adapt i ve i nf l am m at i on as a t herapeut i c t arget i n vascul ar di sease：t he em ergi ng rol e of st at i ns[J].J Am Col l Cardi ol, 2014,63(23)：2491-2502.

[13]ZH ENG B,H AN M,W EN JK.Rol e of Kruppel-l i ke f act or 4 i n phenot ypi c swi t chi ng and prol i f erat i on of vascul ar sm oot h m uscl e cel l s[J].IUBM B Li f e,2010,62(2)：132-139.

[14]YU K,ZH ENG B,H AN M,et al.ATRA act i vat es and PDGFBB represses t he SM 22 al pha prom ot er t hrough KLF4 bi ndi ng t o,or di ssoci at i ng f rom,i t s ci s-DNA el em ent s[J].Cardi ovasc Res,2011,90(3)：464-474.

[15]SIVRITAS D,BECH ER M U,EBRAH IM IAN T,et al.Ant i prol i f erat i ve ef f ect of est rogen i n vascul ar sm oot h m uscl e cel l s i s m edi at ed by Kruppel-l i ke f act or-4 and m anganese superoxi de di sm ut ase[J].Basi c Res Cardi ol,2011,106(4)：563-575.

[16]GARVEY S M,SINDEN D S,SCH OPPEE BORTZ P D,et al. Cycl ospori ne up-regul at es Kruppel-l i ke f act or-4(KLF4)i n vascul ar sm oot h m uscl e cel l s and dri ves phenot ypi c m odul at i on i n vi vo[J].J Pharm acol Exp Ther,2010,333(1)：34-42.

[17]CH ENG Y,LIU X,YANG J,et al.M i croRNA-145,a novel sm oot h m uscl e cel l phenot ypi c m arker and m odul at or,cont rol s vascul ar neoi nt i m al l esi on f orm at i on[J].Ci rc Res,2009,105(2)：158-166.

[18]DAVIS-DUSENBERY B N,CH AN M C,RENO K E,et al. Down-regul at i on of Kruppel-l i ke f act or-4 (KLF4)by m i croRNA-143/145 i s cri t i cal f or m odul at i on of vascul ar sm oot h m uscl e cel l phenot ype by t ransf orm i ng growt h f act or-bet a and bone m orphogenet i c prot ei n 4[J].J Bi ol Chem,2011,286(32)：28097-28110.

[19]ZH ENG B,H AN M,BERNIER M,et al.Kruppel-l i ke f act or 4 i nhi bi t s prol i f erat i on by pl at el et-deri ved growt h f act or recept or bet a-m edi at ed,not by ret i noi c aci d recept or al pha-m edi at ed, phosphat i dyl i nosi t ol 3-ki nase and ERK si gnal i ng i n vascul ar sm oot h m uscl e cel l s[J].J Bi olChem,2009,284(34)：22773-22785.

（童穎丹 編輯）

Rosuvastatin inhibits phonotype transformation of vascular smooth muscle cells by down-regulation of KLF-4

Qing Han1,De-liang Shen2,Bo Wang2,Jin-ying Zhang2
(1.Department of Cardiology,Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou,Henan 450007,China;2.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

ObjectiveTo verify whether Rosuvastatin could inhibit vascular smooth muscle cell(VSMC) phonotype switch by down-regulation of KLF-4.MethodsThe primary culture and identification of SD rat VSMCs were conducted,VSMCs in the 3rd to 5th passages were used for the following experiments.After treatment with different concentrations of Rosuvastatin,MTT was used to investigate the proliferative ability of VSMCs.Transwell chambers and wound healing were employed to test the migration ability of VSMCs.IHC was used to detect the expression of SM-actin and the morphological structure of VSMCs.Western blot was used to investigate the expressions of SM-actin,SM-MHC,SM-22α,osteopontin (OPN)and KLF-4 in VSMCs. After KLF-4 was transfected into VSMCs,the metheods were used again to test the phonotype changes of the VSMCs.ResultsCompared with the control group,the migration and proliferation ability of the VSMCs were decreased in the Rosuvastatin group.The expressions of SM-actin,SM-22α and SM-MHC in the Rosuvastatin group were significantly increased(P＜0.05),and the expression of OPN also increased(P＜0.05).IHC showed the VSMCs in the Rosuvastatin group became thinner and longer than those of the control group.After KLF-4 was transfected into VSMCs,the proliferation and migration ability of the VSMCs increased (P＜0.05).Over-expression of KLF-4 reversed the effect of Rosuvsatatin on VSMCs phonotype transformation.ConclusionsRosuvastatin inhibits VSMCs phonotype switch by down-regulation of KLF-4.

atherosclerosis;Rosuvastatin;VSMCs;phonotype switch

1005-8982（2017）03-0027-07

R 543.31

A

2016-01-26