李滔，王昌富，梅冰，李琳蕓，姚長江，龔道凱，胡小輝

·論著·

P-選擇素基因S290N和P-選擇素糖蛋白配體-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死臨床關(guān)聯(lián)性研究

李滔，王昌富，梅冰，李琳蕓，姚長江，龔道凱，胡小輝

目的 探討P-選擇素(SELP)基因S290N和P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死的關(guān)系。方法 選取148例缺血性腦梗死患者作為腦梗死組，并分為大動脈粥樣硬化性(LAA)亞組、心源性腦栓塞(CE)亞組和小動脈閉塞性(SAO)亞組；88例正常人群作為正常對照組。運用基因測序方法檢測所有受試者SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I的基因多態(tài)性。結(jié)果 與正常對照組比較，腦梗死組及其亞組S290N基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；腦梗死組M62I基因型和等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；LAA亞組M62I基因型差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.889，P=0.053)，但等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.156，P=0.021)；CE亞組基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=1.693，P=0.429；χ2=1.372，P=0.238)；SAO亞組基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=12.572，P=0.002；χ2=8.736，P=0.004)。S290N與缺血性腦梗死風險無相關(guān)性(均P>0.05)。M62I顯性模型和超顯性模型與缺血性腦梗死風險有相關(guān)性(OR=2.662，95%CI: 1.531～4.630，P=0.000；OR=0.392，95%CI：0.219～0.701，P=0.001)，而隱性模型和加性模型與缺血性腦梗死風險無相關(guān)性(OR=1.428，95%CI：0.528～3.862，P=0.630；OR=2.121，95%CI：0.766～5.872，P=0.156)。結(jié)論 PSGL-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死之間具有相關(guān)性。

P-選擇素；P-選擇素糖蛋白配體-1；缺血性腦梗死；基因多態(tài)性；亞型

缺血性腦梗死是全世界第二個最常見的死亡原因，在亞洲排名第一[1-2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計到2050年，世界上80%的腦梗死病例發(fā)生在低收入和中等收入國家，主要是印度和中國[3]。腦梗死形成的原因復雜，起因于血管、環(huán)境和遺傳因素[4]。大量的研究[5-8]表明，P-選擇素(SELP)和P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)在動脈粥樣硬化和血栓的形成等血管因素中起著重要作用。而單核苷酸多態(tài)性使得基因在轉(zhuǎn)錄翻譯時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能和表達水平發(fā)生變化，從而影響疾病的易感性及臨床表現(xiàn)的多樣性。本研究主要探討SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死及其亞型的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 (1)腦梗死組：選取2015年3月～2015年9月入住我院的148例缺血性腦梗死患者，均為首次發(fā)病且在24 h內(nèi)入院，符合2013年美國心臟協(xié)會卒中委員會(AHA)/美國卒中協(xié)會(ASA)發(fā)布的21世紀腦梗死新定義的診斷標準[9]。男77例，女71例;年齡36～90歲，平均(65.2±11.8)歲。按照TOAST分型標準，將腦梗死組分為大動脈粥樣硬化性腦梗死(LAA)亞組30例，心源性腦栓塞(CE)亞組24例和小動脈閉塞性或腔隙性腦梗死(SAO)亞組94例。(2)正常對照組：系同期我院體檢中心健康體檢者88名，男36名，女52名;年齡49～89歲，平均(68.5±9.7)歲。排除高血壓、冠心病、糖尿病、高血脂等心血管疾病和代謝性疾病。兩組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA的提取 腦梗死組于入院后，正常對照組于體檢當日清晨空腹采集受試者靜脈血2 ml于EDTA-K2抗凝管中，使用Takara Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒提取基因組DNA，于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計和合成 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的Genebank庫中SELP基因S290N (rs6131)和PSGL-1基因M62I (rs2228315)位點附近260 bp序列，在線設(shè)計引物，由Takara寶生物工程(大連)有限公司合成。SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I引物序列和基因型見表1。

表1 SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I引物序列和基因型SNP位點SNP編號引物序列所在外顯子密碼子編碼氨基酸基因型SELPrs6131F:5'-GTGCAGACCAGTGTCCAGAGT-3'7AGT絲氨酸SSSNNNS290NR:5'-CCTGCATTTCAGAGGTGGTT-3'AAT天冬氨酸PSGL-1rs2228315F:5'-CAGCTCCGTGGTCAGCTCT-3'2ATG甲硫氨酸MMMIIIM62IR:5'-TGTGGGACACCTGGGCAGAT-3'ATA異亮氨酸

1.2.3 PCR擴增 反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer (Mg2+free) 2.5 μl，MgCl2(25 mmol)2 μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol)2 μl，TaKaRa Ex Taq 1.0 U，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板DNA 3 μl，補足滅菌蒸餾水至25 μl。反應(yīng)條件：在ABI 7300熒光定量PCR儀上擴增。42℃ 5 min，95℃ 3 min，98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物純化和基因測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料以率表示，基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗。用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗各基因型和等位基因頻率是否已達到遺傳平衡，是否具有群體代表性。顯性、隱形、加性和超顯性遺傳模型評估多態(tài)性與疾病發(fā)生的風險程度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組與正常對照組基因檢測結(jié)果的比較 SELP基因S290N位點具有多態(tài)性，包括SS、SN、NN共3種基因型。M62I位點亦具有多態(tài)性，包括MM、MI、II共3種基因型。SELP和PSGL-1基因型在兩組人群中的分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性。經(jīng)χ2檢驗，S290N基因型和等位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.596，P=0.450;χ2=0.501，P=0.479)(表2)。M62I基因型和等位基因頻率在兩組間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.554，P=0.002;χ2=9.512，P=0.002)(表3)。

表2 各組間SELP基因S290N基因型和等位基因頻率的比較(例,%)組別基因型SSSNNN等位基因SN腦梗死組(n=148)93(63)50(34)5(3)236(80)60(20) LAA亞組 (n=30)21(70)9(30)0(0)51(85)9(15) CE亞組 (n=24)14(58)9(38)1(4)37(77)11(23) SAO亞組 (n=94)58(62)32(34)4(4)148(79)40(21)正常對照組(n=88)61(69)23(26)4(5)145(82)31(18)

表3 各組間PSGL-1基因M62I基因型和等位基因頻率的比較(例,%)組別基因型MMMIII等位基因MI腦梗死組(n=148)66(45)68(46)14(9)200(68)96(32) LAA亞組 (n=30)13(43)13(43)4(14)39(65)21(35) CE亞組 (n=24)13(54)9(38)2(8)35(73)13(27) SAO亞組 (n=94)40(43)46(49)8(8)126(67)62(33)正常對照組(n=88)60(68)22(25)6(7)142(81)34(19)

2.2 不同亞型腦梗死患者與正常對照組SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I的基因型和等位基因頻率的比較 見表2、3。腦梗死組LAA亞組、CE亞組、SAO亞組患者SELP S290N基因型(χ2=1.488，P=0.475;χ2=1.198，P=0.549;χ2=1.352，P=0.509)和等位基因頻率(χ2=0.217，P=0.696;χ2=0.696，P=0.409;χ2=0.777，P=0.428)與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，LAA亞組PSGL-1基因M62I基因型差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.889，P=0.053)，但等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.156，P=0.021);CE亞組基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=1.693，P=0.429;χ2=1.372，P=0.238);SAO亞組基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=12.572，P=0.002;χ2=8.736，P=0.004)。

2.3 SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死風險分析 見表4。S290N與缺血性腦梗死風險無相關(guān)性(均P>0.05)。M62I顯性模型和超顯性模型與缺血性腦梗死風險有相關(guān)性(OR=2.662，95%CI: 1.531～4.630，P=0.000;OR=0.392，95%CI：0.219～0.701，P=0.001)，而隱性模型和加性模型與缺血性腦梗死風險無相關(guān)性(OR=1.428，95%CI：0.528～3.862，P=0.630;OR=2.121，95%CI：0.766～5.872，P=0.156)。

表4 SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死風險分析項目OR值95%CIP值SELPS290N 顯性模型0.7480.426～1.3140.326 隱形模型0.7340.192～2.8100.730 加性模型0.8200.212～3.1751.000 超顯性模型1.4420.803～2.5880.246PSGL-1M62I 顯性模型2.6621.531～4.6300.000 隱形模型1.4280.528～3.8620.630 加性模型2.1210.766～5.8720.156 超顯性模型0.3920.219～0.7010.001

3 討 論

編碼SELP基因定位于人類1號染色體(1q21-24)上一段50 kb的DNA序列，包含17個外顯子和16個內(nèi)含子[10-12]。S290N位點位于外顯子7，此外顯子編碼第三個補體調(diào)節(jié)蛋白樣功能區(qū)。編碼PSGL-1基因定位于人類12號染色體(12q24)上，包含2個外顯子和1個內(nèi)含子[13]。M62I位點靠近PSGL-1與SELP結(jié)合綁定的區(qū)域[14]。這兩個位點的突變可能會影響基因的轉(zhuǎn)錄。由于基因轉(zhuǎn)錄效率不同，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能可能會有所差別，從而影響一些相關(guān)疾病發(fā)生與發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，腦梗死組與正常對照組PSEL基因S290N基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義，與既往研究[15-17]一致。并且，腦梗死組LAA亞組、CE亞組、SAO亞組患者SELP基因S290N基因型和等位基因頻率與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義。S290N與缺血性腦梗死風險無相關(guān)性。提示此多態(tài)性位點不是缺血性腦梗死發(fā)病的危險因素。SELP第三個補體調(diào)節(jié)蛋白樣功能區(qū)可能與缺血性腦梗死無相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，M62I基因型和等位基因頻率在兩組間差異有統(tǒng)計學意義，這與既往研究[16,18]報道的一致。進一步分型發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，LAA亞組PSGL-1基因M62I基因型差異無統(tǒng)計學意義，但等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義;CE亞組基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義;SAO亞組基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義。造成這種差別的原因可能與PSGL-1參與缺血性腦梗死發(fā)病機制有關(guān)。M62I位點靠近PSGL-1與SELP結(jié)合綁定的區(qū)域，目前認為其多態(tài)性可能與SELP和PSGL-1相互作用的能力相關(guān)?；罨难“逋ㄟ^SELP與血管內(nèi)皮細胞上表達的PSGL-1相結(jié)合，刺激血管內(nèi)皮細胞Weibel-Palade小體釋放大量的SELP[19]，并且促使血管內(nèi)皮細胞釋放一系列炎癥因子和趨化因子，募集白細胞，出現(xiàn)炎性表現(xiàn)。由于PSGL-1基因M62I多態(tài)性使得PSGL-1和SELP相互作用的能力不同，黏附在血管內(nèi)皮細胞上的血小板介導白細胞的俘獲和滾動的能力也不同。另一方面，血小板活化后SELP表達增加，其特異的與白細胞上表達的PSGL-1結(jié)合，形成血小板白細胞聚集體(PLA)[20-21]。循環(huán)中的PLA通過白細胞上表達的PSGL-1與血管內(nèi)皮細胞上高表達的SELP結(jié)合，捆綁PLA，抵抗血流的高剪切力，有利于其他細胞黏附分子的共同作用和血小板活化因子對PLA的激活，啟動動脈粥樣硬化的進程，受累的大動脈管壁增厚管腔狹窄，繼而引發(fā)LAA。SAO是由于長期高血壓使血液沖擊血管內(nèi)膜，受損內(nèi)膜易為膽固醇、脂質(zhì)沉積，可導致腦內(nèi)深穿支小動脈的玻璃樣變，受累小動脈管壁增厚管腔狹窄。血壓長期不穩(wěn)定還可造成小動脈痙攣，管壁纖維素樣壞死，進而引起腦組織多發(fā)性小梗死。雖然SELP和PSGL-1在高血壓炎癥中的作用機制目前還不清楚。但越來越多的研究[22-23]表明，高血壓患者的外周血白細胞和血小板處于一定程度的炎癥激活狀態(tài)。而CE主要是由于心房纖顫或感染性心內(nèi)膜炎等心臟基礎(chǔ)性疾病患者左心房或左心室內(nèi)形成血栓，栓子脫落隨血流進入體循環(huán)栓塞到遠端小動脈導致局部供血區(qū)域腦梗死。SELP在血栓的形成中發(fā)揮一定作用，它可介導血小板在受損的血管內(nèi)皮細胞黏附和聚集，參與凝血。而PSGL-1基因M62I主要影響PSGL-1和SELP的綁定，其多態(tài)性與心源性血栓的形成可能并無關(guān)聯(lián)。

本研究風險因素分析顯示，PSGL-1基因M62I顯性模型(MI+II VS MM)和超顯性模型(MM+II VS MI)與缺血性腦梗死風險有相關(guān)性，而隱性模型(II VS MM+MI)和加性模型(MM VS MI VS II)與缺血性腦梗死風險無相關(guān)性。顯性模型分析說明M62I中I等位基因為顯性基因。攜帶I等位基因的患者，發(fā)生缺血性腦梗死的風險是不攜帶I等位基因的患者的2.662倍(95%CI：1.531～4.630，P=0.000)。超顯性模型分析提示與雜合突變型MI相比，野生型MM和純和突變型II患病的風險性降低(OR=0.392，95%CI：0.219～0.701，P=0.001)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，PSEL基因S290N基因多態(tài)性與缺血性腦梗死及其病因?qū)W亞型無相關(guān)性。PSGL-1基因M62I基因多態(tài)性與缺血性腦梗死尤其是SAO有相關(guān)性。PSGL-1 M62I中I等位基因會增加患缺血性腦梗死的風險。由于缺血性腦梗死發(fā)病機制復雜，心腦血管危險因素眾多，基因多態(tài)性存在地域和種族差異，關(guān)于SELP和PSGL-1基因多態(tài)性與缺血性腦梗死的關(guān)系還需進一步研究。

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Clinical relevance research of polymorphism of P-selectin gene S290N and P-selectin glycoprotein ligand-1 gene M62I in ischemic cerebral infarction

LITao,WANGChang-fu,MEIBin,etal.

DepartmentofClinicalLaboratory,JingzhouHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Jingzhou434020,China

Objective To investigate the correlation of P-selectin (SELP) gene S290N polymorphisms and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) gene M62I polymorphisms with ischemic cerebral infarction. Methods One hundred and forty-eight ischemic cerebral infarction patients were in cerebral infarction group, and these patients were divided into large artery atherosclerosis cerebral infarction (LAA) subgroup, cardioembolism (CE) subgroup and small artery occlusion cerebral infarction (SAO) subgroup. Eighty-eight healthy controls were in normal control group. Polymorphisms of SELP gene S290N and PSGL-1 gene M62I of all subjects were detected by gene sequencing.Results Compared with normal control group, there was no significant difference of frequency of S290N genotype and allele in cerebral infarction group and its subgroup (allP>0.05). Compared with normal control group, there was significant differences of frequency of M62I genotype and allele in cerebral infarction group (allP<0.01). Compared with normal control group, there was no significant difference of M62I genotype in LAA subtypes group (χ2=5.889,P=0.053). Compared with normal control group, there was significant difference of M62I allele frequency in LAA subgroup (χ2=6.156,P=0.021). Compared with normal control group, there was no significant difference of M62I genotype and allele frequency in CE subgroup (χ2=1.693,P=0.429;χ2=1.372,P=0.238). Compared with normal control group, there were significant differences of M62I genotype and allele frequency in SAO subgroup (χ2=12.572,P=0.002;χ2=8.736,P=0.004). S290N gene had no correlation with the risk of ischemic cerebral infarction (allP>0.05). However, dominant and over-dominant models of M62I were associated with therisk of ischemic cerebral infarction (OR=2.662, 95%CI: 1.531-4.630,P=0.000;OR=0.392, 95%CI: 0.219-0.701,P=0.001), while recessive and additive models of M62I were not (OR=1.428, 95%CI: 0.528-3.862,P=0.630;OR=2.121, 95%CI: 0.766-5.872,P=0.156).Conclusion PSGL-1 gene M62I polymorphism is correlated with ischemic cerebral infarction.

P-selectin；P-selectin glycoprotein ligand-1；ischemic cerebral infarction；gene polymorphism；subtype

434020荊州，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院檢驗醫(yī)學部(李滔，王昌富，梅冰，李琳蕓)，神經(jīng)內(nèi)科(姚長江，龔道凱，胡小輝)

王昌富

R743

A

1004-1648(2017)01-0024-05

2015-10-20

2016-02-22)