張廣超 周華成

氫氣對(duì)移植肺損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展

張廣超 周華成

肺移植是治療終末期肺疾病的最終方案，但肺移植的成功率和長(zhǎng)期存活率比較低，3月、1年和5年的生存率分別是82%、78%和49%[1]。肺移植過程會(huì)經(jīng)歷缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)、免疫排斥反應(yīng)等一系列病理生理變化，引起肺損傷，造成原發(fā)性移植物功能不全(primary graft dysfunction, PGD)。移植后72h嚴(yán)重PGD的發(fā)生率高達(dá)30%，與受體的病死率緊密相關(guān)[2]。臨床上急需緩解移植肺IRI，改善移植后短、長(zhǎng)期各項(xiàng)指標(biāo)的治療方案。作為一種抗氧化劑，氫氣早已作為治療性氣體應(yīng)用于臨床。以往的文獻(xiàn)已證明氫氣對(duì)多種疾病具有較顯著的治療作用。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明氫氣可減輕多種原因誘發(fā)的肺損傷包括移植肺損傷，發(fā)揮保護(hù)作用。

一、氫氣的物理特性

氫氣是一種化學(xué)性質(zhì)活躍的小分子物質(zhì)，在自然界中廣泛分布，空氣中其濃度為0.00006%[3]。氫氣是無毒性氣體，不溶于水，在濃度小于4%時(shí)，無燃燒和爆炸風(fēng)險(xiǎn)。生理狀態(tài)下，人體腸道菌群可產(chǎn)生大量的氫氣，參與人體部分生理過程，最終由肺臟排出或代謝生成無毒性的水。在人體內(nèi)活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)如羥自由基(·OH)、過氧化硝酸陰離子(ONOO-)、H2O2等不斷產(chǎn)生，可與核質(zhì)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等正常細(xì)胞構(gòu)成物質(zhì)反應(yīng)，破壞正常結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)，部分ROS還可參與人體正常生理生化過程。由于氫氣較強(qiáng)的還原特性，可作為抗氧化劑，在不影響其正常生理功能情況下選擇性消除ROS的毒性作用。作為小分子氣體，氫氣可依靠濃度梯度直接穿過細(xì)胞膜和亞細(xì)胞器膜，彌散至胞漿和細(xì)胞器中，從而快速作用于靶點(diǎn)。目前，氫氣的應(yīng)用方式主要有氫氣吸入、腹腔注射飽和氫氣鹽水、口服富氫水、氫氣浴等。而肺臟獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可使其不經(jīng)過血液循環(huán)直接進(jìn)行氣體交換，這就使氫氣在肺移植供體保存期時(shí)也能發(fā)揮保護(hù)作用。

二、氫氣應(yīng)用于肺損傷保護(hù)的概況

全身性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激或機(jī)械刺激等原因均可誘發(fā)急性肺損傷，氫氣可以通過其抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等生理特性改善肺損傷程度，減緩肺損傷病程進(jìn)展，保護(hù)肺臟功能。

Huang CS和Wu Q等發(fā)現(xiàn)吸入2%氫氣可發(fā)揮抗炎癥、抗凋亡和抗氧化的作用，減輕機(jī)械通氣性肺損傷[4-5]。Sun Q和Kawamura等發(fā)現(xiàn)2%氫氣可以減輕炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，改善高氧肺損傷的肺臟氧合功能[6-7]。Terasaki Y[8]等發(fā)現(xiàn)氫氣通過消除ROS的毒性作用對(duì)放射性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Qiu X、Xie K、Zhang Y[9-11]等人的研究發(fā)現(xiàn)氫氣可通過減輕炎癥應(yīng)激，減少凋亡來治療大鼠內(nèi)毒素引起急性肺功能障礙。Fang Y[12]等研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射富氫水可減輕肺臟炎癥反應(yīng)，改善大面積燙傷大鼠模型肺臟氧化損傷。Zhai Y[13]等人探究發(fā)現(xiàn)氫氣飽和鹽水腹腔注射可抗氧化，抗炎癥，減輕腸道相關(guān)性的肺損傷。Li H[14]等人研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射富氫水可改善氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕缺血再灌注引起的肺損傷。此外，還有研究證明，氫氣對(duì)農(nóng)藥中毒、休克復(fù)蘇、CO中毒引起的肺損傷也具有一定的保護(hù)作用。

三、氫氣應(yīng)用于移植肺損傷保護(hù)

近幾年，關(guān)于氫氣應(yīng)用于肺移植過程肺功能保護(hù)的研究開始興起，氫氣對(duì)肺移植肺損傷的保護(hù)作用被證實(shí)。移植肺在保存期氫氣預(yù)處理或在移植過程中和移植后應(yīng)用均被證明可以減輕肺損傷，改善肺功能。

1. 氫氣對(duì)供體肺損傷的保護(hù)作用

2011年Kawamura[15]等人在肺移植物切取前使用氫氣機(jī)械通氣，冷保存后進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組肺組織前炎性細(xì)胞活素TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)下調(diào)；Bcl-2表達(dá)增多，Bax表達(dá)下降；抗氧化酶血紅素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)的產(chǎn)生增加；肺臟氧合功能，病理評(píng)分顯著改善。結(jié)果證明氫氣可通過減輕炎癥反應(yīng)，抗氧化應(yīng)激，抗凋亡發(fā)揮供體肺保護(hù)作用，其中HO-1分子的產(chǎn)生增多是一個(gè)較為重要的保護(hù)機(jī)制。2012年Tanaka[16]等通過基因水平的研究證明，肺供體切取前2% 氫氣機(jī)械通氣可以使肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)分子、ATP合成酶類和應(yīng)激反應(yīng)分子相關(guān)基因(絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系統(tǒng)等)為主的229個(gè)目標(biāo)基因發(fā)生顯著改變，發(fā)揮抗炎癥，抗凋亡，抗氧化作用，改善氣體交換功能。2015年Haam S[17]等人建造了豬的心臟驟停后肺臟熱缺血模型，并使用氫氣對(duì)離體肺臟供體進(jìn)行機(jī)械通氣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平下降，炎癥反應(yīng)減輕。盡管實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MAPK相關(guān)酶系的表達(dá)沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是相比對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組p38、JNK、ERK相關(guān)的磷酸化作用有所降低。

2. 氫氣對(duì)受體肺損傷的保護(hù)作用

2010年Kawamura等人[18]研究發(fā)現(xiàn)大鼠原位左肺移植過程中及再灌注后吸入2%氫氣，均可以顯著改善氣體交換功能，降低移植肺組織丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)，抑制脂質(zhì)過氧化，減少促炎介質(zhì)如ICAM-1、TNF-α和IL-6等的產(chǎn)生和釋放，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達(dá)水平。說明氫氣通過抗氧化，抗炎癥和抗凋亡作用，減輕移植肺缺血再灌注損傷。2013年周華成[20]課題組發(fā)現(xiàn)供體肺移植前后使用2% 氫氣機(jī)械通氣可以改善移植肺的氧合，降低肺損傷評(píng)分；降低IL-8、ICAM-1、TNF-α的水平；減少M(fèi)DA和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的產(chǎn)生，促使超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)產(chǎn)生增加；降低細(xì)胞凋亡指數(shù)，抑制Caspase-3的表達(dá)。證實(shí)氫氣可以通過抗炎癥，抗氧化，抗凋亡機(jī)制對(duì)腦死亡供體肺移植肺臟功能發(fā)揮保護(hù)作用。2014年Noda K[19]課題組發(fā)現(xiàn)體外肺灌注期間使用氫氣機(jī)械通氣預(yù)處理可使移植后肺組織血紅素加氧酶HO-1水平上調(diào)，移植肺炎癥改變減輕，線粒體生物發(fā)生增強(qiáng)，乳酸鹽的產(chǎn)生減少，低氧誘導(dǎo)因子-1的表達(dá)下降。從而改善移植肺功能，發(fā)揮移植肺的保護(hù)作用。2015年周華成[20]課題組在冷缺血期使用首創(chuàng)的氫氣膨肺方法進(jìn)行供體保護(hù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷缺血期氫氣膨肺可減輕移植肺的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。從而改善肺氧合功能，發(fā)揮移植肺保護(hù)作用。2016年周華成[21]課題組探究了冷缺血期單純使用氫氣或CO，以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)移植肺缺血再灌注損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組移植后氧合功能改善、病理評(píng)分顯著改善，壓力容積曲線升高，MPO和MDA含量降低，SOD產(chǎn)生增多，炎癥因子IL-8、TNF-α產(chǎn)生下降。說明氫氣及CO，或兩者聯(lián)合使用能夠通過抗氧化、抗炎癥、抗凋亡來保護(hù)移植肺功能。

綜上所述，氫氣可通過抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗凋亡效應(yīng)、調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)和一些特殊的分子通路對(duì)移植肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。具體的保護(hù)機(jī)制如下：

四、氫氣對(duì)移植肺損傷的可能保護(hù)機(jī)制

1. 抗氧化作用

·OH和ONOO-是對(duì)肺組織影響最大的氧自由基，氫氣可以選擇性的清除·OH、ONOO-等氧自由基，使其還原成無毒性的水。氫氣可使組織內(nèi)SOD，以及線粒體內(nèi)過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，Gpx)等抗氧化物的表達(dá)水平升高。因此，氫氣可以抑制ROS對(duì)線粒體膜的損傷，減少細(xì)胞色素C的釋放，以免線粒體為中心的細(xì)胞凋亡途徑啟動(dòng)。氫氣可以降低脂質(zhì)過氧化水平，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，減少生物膜的損傷。防止生物膜如細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的通透性過高，保護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[20,22-23]。

2.抗炎癥作用

TNF-α、IL-1β和IL-6在炎癥的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的最重要的炎癥因子。氫氣可顯著抑制損傷肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1的mRNA表達(dá)，同時(shí)可使IL-10的水平上調(diào)，來協(xié)同發(fā)揮抗炎癥作用。氫氣還可以減少M(fèi)PO的活性，說明氫氣可以減少中性粒細(xì)胞的聚集。同時(shí)，病理分析發(fā)現(xiàn)，氫氣處理的損傷肺組織炎癥細(xì)胞的聚集較少，組織水腫程度輕[6,20,24]。

3. 抗凋亡作用

氫氣可使ROS的產(chǎn)生下降，抑制線粒體為中心的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑；還可減少炎癥介質(zhì)如TNF-α的表達(dá)，抑制外源性細(xì)胞凋亡途徑。氫氣可使凋亡基因caspase-3、caspase-8、bax的表達(dá)水平明顯下調(diào)，同時(shí)，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)水平明顯上調(diào)。由此可抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白的產(chǎn)生，從而降低蛋白酶的分泌，保護(hù)細(xì)胞的完整性不受破壞，抑制細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)[9,15,24]。

4. 保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能

氧化應(yīng)激和炎癥應(yīng)激產(chǎn)生的ROS和TNF-α都可以激活線粒體為中心的細(xì)胞凋亡過程。氫氣可降低線粒體內(nèi)MDA的水平，使GSH水平升高，還可增強(qiáng)SOD、CAT、Gpx的活性，減輕線粒體的脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)線粒體抗氧化能力，維持線粒體氧化還原反應(yīng)平衡。氫氣可以選擇性清除ROS，減輕氧化應(yīng)激。下調(diào)炎癥因子表達(dá)和釋放。從而保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制線粒體為中心的凋亡過程。另外，氫氣還可以保護(hù)線粒體的呼吸功能，減少ATP的消耗[22]。

5. 特殊信號(hào)傳導(dǎo)通路

(1) Nrf2/HO-1 2010年Kawamura T[18]等首次提出氫氣可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增多,從而降低肺水腫、炎癥因子的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡等，是氫氣發(fā)揮抗LIRI的機(jī)制之一。2013年，該課題組發(fā)現(xiàn)氫氣通過核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)調(diào)節(jié)肺組織中HO-1基因的表達(dá)[6]。

(2) NF-κB/Bcl-2 2011年Huang[4]等對(duì)機(jī)械肺損傷模型氫氣吸入治療后發(fā)現(xiàn)，NF-κB的表達(dá)在1h時(shí)達(dá)到高峰，與此同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2水平明顯上升，而Bax的水平相應(yīng)下降。給予NF-κB抑制劑后，Bcl-2的水平下降，而Bax的水平上升。因此Huang等人認(rèn)為NF-κB/Bcl-2是氫氣發(fā)揮保護(hù)作用的一個(gè)重要通路。

(3) ROS-JNK-Caspase-3 Qiu[10]等發(fā)現(xiàn)氫氣可以抑制內(nèi)毒素引起肺損傷肺組織ROS的產(chǎn)生，降低MDA和NT的水平，抑制MPO的活性，保護(hù)SOD的功能，抑制p-JNK的激活。氫氣還可逆轉(zhuǎn)下游的Bax和Caspase-3的升高以及Bcl-xl水平的下降。氫氣可能通過ROS-JNK-Caspase-3信號(hào)通路對(duì)肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

(4) TNF-α/NF-κB 2012年Xie[11]等發(fā)現(xiàn)氫氣可抑制NF-κB的活化，抑制Caspase-3的活性，還可下調(diào)促炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6和趨化因子的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡，減輕組織炎癥細(xì)胞聚集和炎癥反應(yīng)。2015年Wu[5]等人對(duì)單肺通氣肺損傷模型進(jìn)行氫氣治療，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)NF-κB的水平明顯下降，TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)下降。

(5) p38 MAPK/TNF-α 2012年Liang C[25]等人應(yīng)用氫氣預(yù)處理來治療內(nèi)毒素引起的急性肺損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫氣吸入可以有效抑制p38MAPK的激活，從而減少其下游TNF-α的釋放，由此減少肺組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕肺組織損傷，保護(hù)肺功能。

總之，氫氣作為小分子氣體，可以穿透生物膜來發(fā)揮抗氧化、抗炎癥、抗凋亡作用，還可通過調(diào)節(jié)一些特殊分子信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)揮移植肺供體保護(hù)作用。現(xiàn)如今，氫氣對(duì)肺移植肺損傷的保護(hù)機(jī)制仍然不甚明了，還需要進(jìn)一步的研究。目前的研究還僅限于移植后短時(shí)間的觀察和分析，尚缺乏長(zhǎng)期的研究。氫氣對(duì)肺移植肺損傷保護(hù)作用的研究還停留在小型動(dòng)物如大鼠、兔試驗(yàn)階段，欲應(yīng)用于大型動(dòng)物和臨床尚有較長(zhǎng)的一段路要走。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.045

150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院疼痛科

周華成,E-mail：zhouhuacheng@163.com

2016-09-28]