閆艷娟，李蘊(yùn)玉，李佩國

(河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066600)

白細(xì)胞介素2(interleukine- 2,IL- 2)是一類重要的淋巴因子，主要是由T- 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[1]?？纱龠M(jìn)哺乳類動(dòng)物B細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖、分化，還可以增強(qiáng)單核細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性，在免疫系統(tǒng)具有十分重要的免疫生理調(diào)節(jié)效應(yīng)，甚至可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。1983年，T. Taniguchi 等[3]首次成功克隆人的IL- 2 基因，而后至少有30多個(gè)物種的IL- 2基因被相繼克隆成功。與人類和哺乳動(dòng)物的IL- 2研究相比，雞IL- 2基因的研究比較滯后。一直到1997年，Sundick 等[4]首次獲得了雞IL- 2基因，使雞IL- 2的研究步入分子水平。雞IL- 2基因不僅在雞病防治和免疫方面有重要作用，還可以作為一種天然功能的細(xì)胞因子作用于動(dòng)物，不存在動(dòng)物產(chǎn)品的安全問題[5]。依據(jù)GenBank中的雞IL- 2的mRNA序列(JQ040532.1)，采用RT- PCR 方法擴(kuò)增雞的IL- 2基因，并與GenBank 中所發(fā)表的序列如Leghorn SPF雞[6]、Kestrel來航雞、broiler雞、Obese雞、蕭山雞、貓、牛[7]、山羊[8]、人[9]的序列同源性進(jìn)行比對(duì)，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測。壩上長尾雞距今已有300年的歷史，是唯一被列入中國畜禽遺傳資源志的地方品種，它是肉蛋兼用型的品種雞，具有耐粗飼、抗寒、抗病力強(qiáng)、肉味美等特點(diǎn)[10]，在市場上具有很高的需求，其產(chǎn)品具有非常廣闊的前景，因此對(duì)壩上長尾雞IL- 2基因的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究雞IL- 2基因的生物學(xué)功能、分子生物學(xué)和開展雞IL- 2 基因工程方面的研究提供依據(jù)，以及更好地對(duì)壩上長尾雞進(jìn)行品種保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50日齡壩上長尾雞(BSCW)，由河北科技師范學(xué)院牧場提供。

1.2 主要儀器及試劑

eppendorf AG梯度PCR儀，由德國艾美德公司生產(chǎn)；德國Hettich公司生產(chǎn)的臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)為MIKRO220R；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，pMD18- T Vector，trizol，Tag酶，DL2000 Marker，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅲ，BamH Ⅰ)等試劑，由TaKaRa公司生產(chǎn)；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

1.3 BSCW雞脾臟總RNA 的提取

雞頸部放血致死，無菌采取脾臟組織，用液氮研磨，然后加trizol試劑1 mL，一步法提取雞脾臟總RNA，具體方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.4 BSCW雞IL- 2基因的RT- PCR擴(kuò)增

依據(jù)GenBank中的雞IL- 2的mRNA序列(JQ040532.1)，利用Primer5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物序列P1：5’- CCGAATTCATGATGTGCAAAGTACTG- 3’，P2：5’- ATGCGGCCGCCCGCGGGGATCCACGCGT-TTTTTGCAGATATCTCACAAAG- 3’。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用質(zhì)量濃度10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.5 IL- 2基因的克隆

對(duì)上述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，取4.5 μL與載體pDM18- T Vector 0.5 μL相連接，并加入SolutionⅠ5.0 μL，16 ℃連接4 h。經(jīng)DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選培養(yǎng)，挑取陽性菌落進(jìn)而提取重組質(zhì)粒。

1.6 重組質(zhì)粒的鑒定

用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及PCR鑒定。

1.7 BSCW雞IL- 2基因的序列測序和分析

經(jīng)含有氨芐青霉素的LB平板篩選得到的陽性菌落在液體LB中搖菌后菌液直接送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，應(yīng)用DNAstar，MEGA 5.1，DNAMAN等軟件對(duì)測序的BSCW雞IL- 2基因進(jìn)行同源性比較及進(jìn)化樹分析。

1.8 BSCW雞IL- 2基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam，DNAstar，Swiss Model 等軟件對(duì)BSCW雞IL- 2 基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié) 果

2.1 RT- PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

用質(zhì)量濃度10 g/L的瓊脂糖電泳對(duì)RT- PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，可見一條長度約為432 bp的條帶，與預(yù)期基因片段大小相同(圖1)。

圖1 BSCW雞IL- 2基因RT- PCR擴(kuò)增

2.2 IL- 2 基因的克隆與重組質(zhì)粒的鑒定

對(duì)篩選到的陽性重組質(zhì)粒pMD18- T- IL- 2進(jìn)行PCR鑒定及BamH Ⅰ，Hind Ⅲ雙酶切鑒定。PCR鑒定可見在432 bp的位置有特異性條帶，雙酶切鑒定顯示有2條條帶(圖2，圖3)，一條長度約為432 bp，另一條長度約為2 600 bp的載體片段，說明BSCW雞IL- 2基因成功克隆到pMD18- T載體中。

2.3 BSCW雞IL- 2基因序列測定及分析

雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明，BSCW雞IL- 2基因CDS區(qū)全長432 bp，含有1個(gè)432 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼143個(gè)氨基酸，與GenBank中序列相比有6個(gè)堿基發(fā)生了突變(圖4)。用DNAMAN 軟件將克隆得到的BSCW雞IL- 2氨基酸序列與GenBank中發(fā)表的雞IL- 2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，在28，30，32，120 位有4個(gè)氨基酸的差異(圖5)。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 圖3 pMD18- T- IL- 2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖4 BSCW雞IL- 2基因測序結(jié)果

圖5 BSCW雞IL- 2氨基酸序列與GenBank中雞IL- 2氨基酸序列對(duì)比

2.4 BSCW雞IL- 2基因的同源性比較及進(jìn)化樹分析

克隆得到的BSCW雞IL- 2基因與GenBank中發(fā)表的雞IL- 2的核苷酸序列同源性為95%，氨基酸同源性為97.2%；與Leghorn SPF雞、Kestrel來航雞、broiler雞、Obese雞、蕭山雞、貓、牛、山羊、人的IL- 2核苷酸序列同源性分別為98.1%，95.0%，94.1%，93.9%，94.1%，45.3%，48%，47.5%，41.7%(圖6)，與其氨基酸序列同源性分別為97.2%，96.7%，8.1%，9.6%，94.7%，12.3%，14.1%，17.1%，10.2%(圖7)。從進(jìn)化上看，BSCW雞的IL- 2基因與Leghorn SPF雞、Kestrel來航雞、broiler雞、Obese雞、蕭山雞距離比較近(圖8)，與其他哺乳動(dòng)物的IL- 2基因距離比較遠(yuǎn)(圖9)。

圖6 IL- 2基因的同源性比較

圖7 IL- 2基因推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性比較

圖8 IL- 2基因序列的進(jìn)化樹分析

圖9 IL- 2基因推導(dǎo)的氨基酸序列的進(jìn)化樹分析

2.5 BSCW雞IL- 2基因編碼的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

2.5.1IL-2基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及疏水性預(yù)測 應(yīng)用ProtParam軟件對(duì)IL- 2蛋白分子進(jìn)行分析可知，分子質(zhì)量為37 499.95 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為5.24，分子式為C1 393H2 330N458O570S90。序列中帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)有20個(gè)，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)有19個(gè)。該蛋白的半衰期為4.4 h，不穩(wěn)定系數(shù)為48.23，為不穩(wěn)定蛋白；該蛋白脂溶性為36.03，平均親水指數(shù)為0.89，該蛋白為親水蛋白。

2.5.2IL-2基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過DNAStar對(duì)IL- 2 基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及抗原性分析，結(jié)果顯示，IL- 2基因推導(dǎo)的蛋白的空間結(jié)構(gòu)具有6個(gè)α螺旋，4個(gè)β折疊，10個(gè)轉(zhuǎn)角和3個(gè)無規(guī)則卷曲(圖10)。疏水性分析發(fā)現(xiàn)，IL- 2基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性，只有一個(gè)強(qiáng)疏水位點(diǎn)，在第10，第11位氨基酸處。

2.5.3IL-2基因編碼的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測基本一致，主要由6個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)和4個(gè)β折疊構(gòu)成(圖11)。

圖10 IL- 2基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖11 IL- 2基因編碼的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)BSCW雞IL- 2基因與另外幾種脊椎動(dòng)物的IL- 2核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，測出的BSCW雞的IL- 2基因與GenBank上發(fā)表的IL- 2基因的同源性分別為95.0%和97.2%。從進(jìn)化上分析，二者在進(jìn)化樹上的距離較為接近，說明在系統(tǒng)進(jìn)化過程中在相同的分支上，親緣關(guān)系相對(duì)較近；與其他種屬的同源性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

IL- 2主要是由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及感染性疾病的治療中都有重要作用。依據(jù)GenBank中發(fā)表的雞IL- 2基因的高度保守區(qū)序列，通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，克隆IL- 2基因的開放閱讀框，結(jié)果顯示，由432個(gè)核苷酸組成，編碼143個(gè)氨基酸。測序結(jié)果也證實(shí)成功克隆了IL- 2基因，為進(jìn)一步研究IL- 2基因的生物信息學(xué)功能及作為DNA疫苗的免疫增強(qiáng)劑提供依據(jù)。與GenBank上發(fā)表的IL- 2基因序列相比，克隆得到的序列有6個(gè)堿基發(fā)生變異，這6個(gè)堿基的變異導(dǎo)致編碼的蛋白序列有4個(gè)氨基酸發(fā)生變異。

通過分子生物學(xué)軟件對(duì)BSCW雞IL- 2基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。理化性質(zhì)顯示，編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為37 499.95 ku，等電點(diǎn)為5.24。疏水性結(jié)果顯示，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)具有很好的親水性，有1個(gè)強(qiáng)疏水位點(diǎn)，在第10，第11位氨基酸處。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果分析顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有6個(gè)α螺旋，4個(gè)β折疊，10個(gè)轉(zhuǎn)角和3個(gè)無規(guī)則卷曲的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測得到的結(jié)果和二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。

[1] 謝昆,蔣成硯,胡俊杰,等.雞IL-2基因的克隆、序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(14):5- 11.

[2] Eitan S,Schwartz M.A transglutaminase that converts interleukin- 2 into a factor cytotoxic to oligodendrocytes[J].Science,1993,261:106.

[3] Taniguchi T,Matsui H,Fujita T,et al.Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin- 2[J].Nature,1983,302(5 906):305- 310．

[4] Molloy M J,Zhang W,Usherwood E J.Cutting edge: IL- 2 immune complexes as a therapy for persistent[J].Immunol,2009,182(8):4 512- 4 515.

[5] 于新友,趙蕾,王艷,等.雞白細(xì)胞介素- 2分子生物學(xué)和疾病防治應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(8):81- 84．

[6] 舒秀偉,宣華,衛(wèi)廣森.雞IL- 2基因的克隆與序列分析[J].中國獸醫(yī)科技,2005(7):555- 560.

[7] Reeves R,Spies A G,Nissen M S,et al.Molecular cloning of a functional bovine interleukin- 2 cDNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(10):3 228- 3 232.

[8] Seow H F,Rothel J S,Radford,et al.The molecular cloning of ovine interleukin- 2 gene by the polymerase chain reaction[J].JOURNAL Nucleic Acids Res,1990,18(23):717

[9] Dukovich M,Wano Y,Bryan R,et al.A second human interleukin- 2 binding protein that may be a component of high- affinity interleukin- 2 receptors[J].Nature 327,518- 522.

[10] 王亞男,馮曼,郭建軍,等.影響壩上長尾雞蛋品質(zhì)的相關(guān)因素研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2017(06下):71- 73.

[11] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第3版.金冬雁,黎孟楓，譯.北京:科學(xué)出版社,2002:132- 138.