決登偉，桑雪蓮，舒 波，劉麗琴，石勝友

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091）

番木瓜（Carica papayaL.）是一種重要的經(jīng)濟型水果，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。番木瓜的果實不僅具有豐富的營養(yǎng)成分，還有一定的藥用價值［1-2］。FAO數(shù)據(jù)顯示，2016年世界番木瓜總產(chǎn)量排在香蕉、柑橘、芒果和菠蘿之后，居當年熱帶水果的第五位［3］。果實成熟是一個重要且復雜的過程，有關該過程的調控機制研究報道很多。按成熟機制不同，果實分為呼吸躍變型和非呼吸躍變型。其中，呼吸躍變型果實主要包括香蕉、梨、番木瓜、芒果和番茄等，該類型果實成熟過程中會伴隨著呼吸作用及乙烯含量的大幅上升；非呼吸躍變型果實主要包括鳳梨、楊桃和西瓜等，該類型果實成熟過程中不會出現(xiàn)呼吸作用的大幅變化，乙烯含量也維持在一個很低水平［4］。

蛋白質作為細胞內最重要的生物大分子，其合成及降解受到精確的時間及空間調節(jié)，并具有高度選擇性。泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是細胞內蛋白質選擇性降解的重要途徑。泛素分子主要通過泛素活化酶（E1）、泛素結合酶（E2）和泛素-蛋白連接酶（E3）與靶蛋白結合形成一條多泛素鏈，將底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶所識別和降解，從而實現(xiàn)對多種代謝過程的調節(jié)［5］。泛素系統(tǒng)廣泛存在于真核生物中，并且在維持細胞功能以及細胞周期的運轉、抵御環(huán)境脅迫、胚胎發(fā)育、激素響應和衰老等方面發(fā)揮著重要作用［6-8］。擬南芥基因組估計有超過1 400個基因（約占總蛋白質數(shù)量的5%）編碼蛋白泛素化系統(tǒng)的組分。而這其中，編碼E1基因只有兩個，其突變體是致死的。已報道的編碼E2基因有37個，還有8個編碼E2-like基因。而編碼E3的基因超過1 300個，并決定泛素化底物的特異性［9］。

目前對泛素-蛋白酶體途徑關鍵酶的研究主要集中在E2和E3上，對于E1的研究報道很少，且多集中在模式生物中。在酵母（Saccharomyces cerevisiae）［10-11］和擬南芥（Arabidopsis thaliane）［12-13］中都含有 2 個UBA基因；小麥（Triticum aestivum）中有3個UBA基因，其中UBA1和UBA2的同源性很高［14］；Li等［15］和張妮等［16］分別在龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）和香蕉（musa acuminata）中發(fā)現(xiàn)UBA基因的存在。對UBA的功能研究表明，UBA除了具有激活泛素分子的作用外，可能還參與植株對逆境脅迫響應［17］及果實的采后成熟過程［16］。前期研究中［18］，我們對番木瓜的泛素結合酶（Ubiquitin-conjugating enzymes，E2s）家族基因進行了研究，34個CpUBCs中有15個基因在番木瓜果實成熟過程中呈上調或下調表達，說明這些CpUBCs可能參與了果實成熟發(fā)育過程。而關于UBA基因在該進程中的作用目前仍未知。

本研究采用生物信息法從番木瓜基因組中分析得到1條UBA基因序列，對該基因進行序列分析及進化分析，并利用熒光定量PCR技術探討了該基因在番木瓜不同組織及果實成熟進程中的表達模式。研究結果將有助于更好了解UBA基因在果實發(fā)育和成熟過程中的作用，也為豐富UBA在不同作物中的功能研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番木瓜材料品種為“日升”，組織表達分析試驗以其成年樹的根、莖、葉、穗、雌花、雄花和果實為材料，果實成熟過程表達分析以幼果（immature green，IG）、綠熟果（mature green，MG）、轉色果（breaker，Br）和黃熟果（mature fruit，MF）為材料，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所國家熱帶果樹種質資源圃保存。

1.2 CpUBA1基因的獲得及分析

根據(jù)已有報道［10-13］，以擬南芥及酵母的UBA氨基酸序列在C. papayaGenomics Database（CpGDB; http：//www.plantgdb.org/CpGDB/）中搜索番木瓜的UBA同源序列。CpUBA1基因的基本信息，如ORF、氨基酸長度和染色體定位等從Phytozome數(shù)據(jù)庫獲得；CpUBA1基因的外顯子、內含子結構通過在線軟件Gene Structure Display Server （GSDS） （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析獲得。分別利用軟件SMART （http：//smart.emblheidelberg.de/）和 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgibin/ PlantmPLoc.cgi）預測CpUBA1蛋白的結構域等電點和分子量；利用ExPASy （http：//expasy.org/tools/）分析CpUBA1蛋白的等電點和分子量；同時利用Clustal X對來自擬南芥、酵母、人類、小麥等物種的UBA氨基酸序列進行多重序列對比，然后通過MEGA 5軟件進行氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，構建Neighbor-Joining進化樹，1 000 次重復，其他均為默認設置。

1.3 植物總RNA提取及Realtime PCR分析

使用CTAB［18］法從番木瓜的根、莖、葉、穗、雌花、雄花和不同發(fā)育階段的果實中提取總RNA。cDNA第一鏈用TAKARA公司的PrimeScript RT試劑盒反轉錄合成，具體操作步驟參照說明書。根據(jù)番木瓜基因組中CpUBA1基因的CDS序列設計Realtime PCR引物，并以番木瓜的actin（FJ696416）基因作為內參基因，具體引物序列見表1。

表1 定量PCR所用引物序列

通過Roche的LightCycler480熒光定量PCR儀及TAKARA公司的SYBR Green Master Mix試劑進行定量PCR。反應體系為20 mL，其中模板cDNA 40 ng，上、下游引物各250 nmol/L，SYBR Green Master Mix 10 μL，其余用ddH2O 補齊。反應程序：94℃預變性5 min；94℃10 s、59℃ 20 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)后作熔解曲線（95 → 65℃，0.1℃/s）。利用 2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。所有樣品進行3次重復，均設陰性對照。在分析CpUBA1基因的表達時，上調或者下調大于2倍時才認為存在差異。所有試驗3次重復。

2 結果與分析

2.1 CpUBA1基因的獲得及生物信息學分析

利用酵母和擬南芥U B A蛋白序列在PLAZA 3.0和CpGDB進行BLASTP搜索，我們獲得1條番木瓜泛素活化酶基因序列，其在PLAZA 3.0數(shù)據(jù)庫中的登錄號為CP00002G03640。CpUBA1基因全長 5 560 bp，含有5個內含子。其中序列開放閱讀框（ORF）為3 459 bp，編碼的蛋白具有1 152個氨基酸，其分子量為128.93 ku，理論等電點為5.49，染色體定位信息為supercontig_2 ：4307079- 4312638。預測表明CpUBA1定位于細胞核。將獲得的CpUBA1與酵母（Saccharomyces cerevisiae）、人類（Homo sapiens）、擬南芥（Arabidopsis thaliane）、小麥（Triticum aestivum）、葡萄（Vitis vinifera）和可可（Theobroma cacao）中已知UBA的氨基酸序列進行對比，發(fā)現(xiàn)CpUBA1與 AtUBA1、AtUBA2、HsUBA1、ScUBA1、ScUBA2、TaUBA1、TaUBA3、VvUBA1、TcUBA1的同源性分別為76%、84%、41%、40%、13%、70%、68%、84%、83%。同時，番木瓜的CpUBA1含有UBA蛋白特有的保守氨基酸結構域（YRNTFANLALPLFSMAEPVPPKVIKHQDMR WTVWDRWILKNNPTLRELLRWLEDKGLNAYSIS CGSCLLYNSMFPRHRERMDKKLVDLAREVAKV DLPPYRRHLDVVVACEDEEDNDVDIPQI）、5個半胱氨酸殘基及ATP結合位點（圖1）。

2.2 CpUBA1基因的進化分析

采用MEGA 6軟件將番木瓜的CpUBA1蛋白序列與酵母、人類、擬南芥、小麥、葡萄和可可中的UBA蛋白序列進行對比分析并構建進化樹，結果（圖2）顯示，CpUBA1與可可的TcUBA1及葡萄的VvUBA1聚到同一分支上，親緣關系最近，而與人類及酵母的親緣關系最遠。

2.3 CpUBA1基因在番木瓜不同組織中的表達分析

用Realtime PCR技術分析CpUBA1基因在番木瓜的根、莖、葉、穗、雌花、雄花和果實中的表達情況，結果（圖3）顯示，CpUBA1基因在番木瓜的不同組織中都檢測到表達，但表達存在差異。其中，在雌花中檢測到的表達量最低，葉片中的表達量最高，約為雌花的5.48倍。在雄花、果實、根及莖中的表達量約為葉片的3.82、3.18、2.76、1.71倍。該結果說明CpUBA1基因可能參與了番木瓜植株不同組織器官的發(fā)育，特別是葉片及花器官的發(fā)育過程。

2.3 CpUBA1基因在番木瓜果實成熟進程中的表達分析

分別提取幼果、綠熟果、轉色果和黃熟果果肉的RNA，并以反轉錄后cDNA為模板進行表達分析。結果（圖4）顯示，CpUBA1基因的表達在綠熟果期沒有出現(xiàn)變化，但在轉色和成熟期分別上調為幼果期的2.43、2.66倍。該結果表明，CpUBA1基因可能參與了番木瓜實成熟進程。

圖1 CpUBA1氨基酸結構（A）及基因結構（B）

圖2 番木瓜CpUBA1蛋白與其他物種UBA蛋白的進化關系

圖3 CpUBA1基因在番木瓜不同組織中的表達水平

圖4 果實果實進程中CpUBA1基因的表達

3 討論

泛素化途徑在很多生物途徑中起重要作用，泛素活化酶作為泛素化途徑的第一個參與酶，在識別靶蛋白泛素化過程中起關鍵作用［19］。目前關于植物UBA基因研究報道很少，多集中在擬南芥和小麥等模式植物或作物上。本研究首次從番木瓜基因組中得到1個UBA基因（CpUBA1），并對該基因的序列特征、進化關系及表達進行了分析。序列分析表明，CpUBA1含有C末端保守結構域、ATP結合位點及5個半胱氨酸殘基，屬于典型的UBA蛋白。這和擬南芥［12-13］、小麥［14］等植物的研究結果一致。Hatfield等［14］對小麥的5個半胱氨酸殘基進行了點突變研究，大腸桿菌表達分析表明只有第626位的半胱氨酸參與形成硫酯鍵，對應于CpUBA1即為728位的半胱氨酸，但是否只有該位點半胱氨酸殘基參與形成硫酯鍵，還需要進一步驗證。進化分析結果顯示，CpUBA1與擬南芥、小麥、葡萄和可可的UBA蛋白序列聚到同一分支，其中與可可的TcUBA1及葡萄的VvUBA1同源性最高，而與人類及酵母的UBA親緣性較遠。

目前關于植物E1的研究報道顯示，E1參與了植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應［16-17］。張妮等［16］采用酵母雙雜交的方法得到了泛素活化酶E1的基因片段，命名為MuUBA。熒光實時定量PCR結果表明，MuUBA在莖中的表達量很低，在香蕉的花和子房發(fā)育第4個階段的表達量最高。推測MuUBA在香蕉不同組織及果實的采后成熟過程中具有很重要作用。與該研究類似，本研究中，CpUBA1在番木瓜不同組織中的表達呈葉片＞雄花＞果實＞根＞莖＞雌花的趨勢。說明該基因可能在番木瓜植株不同組織器官的發(fā)育中發(fā)揮不同作用，特別是葉片及花器官的發(fā)育過程。同時CpUBA1基因的表達在轉色期出現(xiàn)顯著性上升，也就是番木瓜成熟的決定階段，但在綠熟果期未出現(xiàn)變化。香蕉的UBA表達分別受外源乙烯和1-MCP的強烈誘導和抑制［16］，與香蕉類似，番木瓜也是一種呼吸躍變型果實。雖然本研究結果表明CpUBA1可能參與了番木瓜果實成熟進程，但該基因具體是通過怎樣的通路發(fā)揮該作用，還需要進一步試驗分析。綜上，本研究首次對番木瓜的泛素活化酶基因CpUBA1進行了系統(tǒng)性的生物信息學及表達分析，該結果將為進一步探討泛素-蛋白酶體系在番木瓜果實成熟進程的作用奠定基礎，同時也將豐富植物UBA基因的研究。

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