謝 輝，劉 山，曾 輝，李友偉，許 進(jìn)，丁 雄，劉長(zhǎng)安，李 峰△

(1.四川省德陽(yáng)市人民醫(yī)院肝膽外科 618000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科 400010)

·論 著·

HIFU聯(lián)合載HSV-TK基因的納米級(jí)超聲分子探針治療對(duì)裸鼠肝移植瘤血管生成的影響*

謝 輝1，劉 山1，曾 輝1，李友偉1，許 進(jìn)1，丁 雄2，劉長(zhǎng)安2，李 峰1△

(1.四川省德陽(yáng)市人民醫(yī)院肝膽外科 618000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科 400010)

目的 觀察高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)治療裸鼠肝移植瘤后，再注入載單純皰疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-TK)的納米級(jí)超聲分子探針治療效果，并探討其治療機(jī)制。方法 用人肝癌HepG2細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型60只，采用CZF型HIFU機(jī)治療后，分別經(jīng)鼠尾靜脈注射200 μL的微泡+HSV-TK+磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)(A組)、微泡+HSV-TK(B組)、HSV-TK+GPC3(C組)、HSV-TK(D組)、微泡+GPC3(E組)、PBS液 (F組)，每3天1次，共注射3次。每次注射后，根據(jù)超聲監(jiān)測(cè)微泡到達(dá)靶組織的情況，對(duì)A、B、D、E組用DZC型超聲轉(zhuǎn)染儀給予2 W/cm2、1 MHz、 5 min超聲輻照。首次注射48 h后，各組經(jīng)腹腔注射0.2 mL更昔洛韋(GCV，100 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)注射14 d。治療結(jié)束后，用免疫組織化學(xué)法測(cè)殘瘤中微血管密度(MVD)水平，用Western blot和免疫組織化學(xué)法測(cè)量殘癌中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的變化情況，用Q-PCR 檢測(cè)腫瘤中HIF-1α、VEGF基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果 治療14 d后，B、C、D、E、F組腫瘤組織中 HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)量，VEGF及HIF-1α mRNA水平，MVD均明顯高于A 組(P<0.05)。結(jié)論 載HSV-TK的納米級(jí)超聲分子探針治療可降低HIFU治療后殘瘤組織中的VEGF、HIF-1α及MVD水平，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，提高HIFU的治療效果。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A；高強(qiáng)度聚焦超聲；缺氧誘導(dǎo)因子1；分子探針；微血管密度

高強(qiáng)度聚焦超聲(high-intensity focused ultrasound，HIFU)已成為手術(shù)難以切除的中晚期肝癌的一種重要治療方法。但由于各種因素的影響，HIFU治療難以完全殺滅病灶組織，因此存在治療后腫瘤的殘存和復(fù)發(fā)[1-2]。所以，研究提高和鞏固HIFU療效的方法，對(duì)于提高患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間具有重要意義。

隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，腫瘤的基因治療逐漸成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[3]。其中，單純皰疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韋(HSV-TK/GCV)自殺基因系統(tǒng)已顯示出了良好的應(yīng)用前景[4]。Zhou等[5]使用超聲擊碎攜帶自殺基因的微泡，從而使自殺基因定向釋放的技術(shù)，提高了靶基因在癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。但是該方法是一種被動(dòng)尋靶作用，缺乏主動(dòng)靶向性，這有可能降低該方法的轉(zhuǎn)染效率，其療效仍有待提高。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC3)在胎兒的肝臟中高度表達(dá)，在成人正常肝組織中無(wú)表達(dá)，但肝癌發(fā)生時(shí)會(huì)再度高表達(dá)。有研究提示，在原發(fā)性肝癌中，GPC3的陽(yáng)性率約為80%、特異性為90%，這表明GPC3有望成為原發(fā)性肝癌靶向治療的靶點(diǎn)[6-7]。本課題組前期已成功制備靶向超聲分子探針，即已完成了載基因微泡與GPC3單克隆抗體的連接。同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該方法成功地提高了自殺基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而靶向殺傷肝癌細(xì)胞，提高HIFU療效。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)用HIFU聯(lián)合載基因納米級(jí)超聲分子探針治療裸鼠肝移植瘤，以觀察肝癌移植瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、微血管密度(MVD)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的變化，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人肝癌HepG2細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院劉長(zhǎng)安教授贈(zèng)送。SPF級(jí)BABL/C 4～6周齡雄性裸鼠共60只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑及儀器 疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、鏈霉親和素(SA)、生物素化二硬脂酰磷脂酰乙醇(Bio-DSPE)、甘油、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；全氟丙烷氣體(C3F8)由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像研究所惠贈(zèng)；DMEM/高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；生物素化GPC單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗人CD34多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人HIF-1α多克隆抗體為碧云天進(jìn)口分裝；注射用GCV購(gòu)自宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)公司，DZC型低頻超聲轉(zhuǎn)染儀由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研制。

1.3 微泡的合成、質(zhì)粒的提取及載HSV-TK基因的超聲分子探針的構(gòu)建 首先提取質(zhì)粒。HSV-TK質(zhì)粒由課題組前期構(gòu)建完成，該質(zhì)粒以pIRES2-EGFP為載體，用其克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)卡那霉素篩選克隆成功菌體后，在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增大腸桿菌；用Omega質(zhì)粒大抽試劑盒抽提、純化質(zhì)粒；紫外分光光度計(jì)調(diào)整質(zhì)粒純度為A260/A280=1.91，濃度為1 mg/mL。參照李?yuàn)W等[8]方法合成納米級(jí)超聲微泡后，通過(guò)生物素-親和素連接法，參照景周宏等[9]方法實(shí)現(xiàn)GPC3單克隆抗體與微泡的結(jié)合，構(gòu)建成肝癌特異性超聲分子探針，再通過(guò)靜電吸附作用，加入多聚賴氨酸連接質(zhì)粒與微泡，進(jìn)而制備成載HSV-TK基因的納米級(jí)超聲分子探針。

1.4 HIFU治療后裸鼠移植瘤殘瘤模型的建立 取培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的HepG2細(xì)胞，用DMEM/High Glucose培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，錐蟲藍(lán)拒試驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞活力大于90%。取0.2 mL在裸鼠背部皮下接種，15 d后觀察見成瘤率為100%，腫瘤直徑達(dá)1.0～1.5 cm。經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉裸鼠后，用CZF型HIFU治療儀消融治療80%裸鼠皮下移植瘤，消融治療完成后無(wú)裸鼠死亡現(xiàn)象。

1.5 動(dòng)物分組及處理 將HIFU治療后裸鼠分成6組，每組10只，消融后立即經(jīng)鼠尾靜脈各注射200 μL(0.1 μg/μL)微泡或PBS液，微泡+HSV-TK+磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)記為A組、微泡+HSV-TK記為B組、HSV-TK+GPC3記為C組、HSV-TK記為D組、微泡+GPC3記為E組、PBS液記為F組。每3天注射1次，共注射3次。對(duì)于A、B、D、E組超聲輻照，在每次注射探針后根據(jù)超聲監(jiān)測(cè)其到達(dá)腫瘤中的情況，調(diào)整超聲頻率為1 MHz、聲強(qiáng)為2 W/cm2進(jìn)行照射，持續(xù)時(shí)間為5 min。所有裸鼠在首次輻照后48 h，經(jīng)腹腔注射0.2 mL GCV(100 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)注射14 d。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及判定標(biāo)準(zhǔn) 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)各組殘瘤組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)及MVD。所用一抗分別為兔抗人HIF-1α和VEGF多克隆抗體(工作濃度1∶100)，及兔抗人CD34多克隆抗體(工作濃度1∶100)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：在細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色和棕黃色顆粒的細(xì)胞為VEGF和HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片在400倍光鏡下取5個(gè)視野，用IPP圖像分析系統(tǒng)掃描，取5個(gè)視野積分光密度值(IOD)。MVD計(jì)數(shù)測(cè)定按照Weidner等[10]的方法：先在100倍視野下確定MVD最高區(qū)域，然后在400倍光鏡下計(jì)數(shù)微血管數(shù)目。微血管判定標(biāo)準(zhǔn)為：呈棕黃色且有管腔(管腔小于8個(gè)紅細(xì)胞大小)的內(nèi)皮細(xì)胞形成的條索間隙狀結(jié)構(gòu)；黃染的細(xì)胞或者細(xì)胞簇未顯示管狀結(jié)構(gòu)，但與周圍的腫瘤細(xì)胞、微血管及其他結(jié)締組織分開者；管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞和可見平滑肌的管壁不計(jì)算在內(nèi)。

1.7 腫瘤組織中VEGF和HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè) 采用Q-PCR法。治療完成后，取各殘瘤組織，用Trizol法提取液取總RNA，依步驟行熒光定量PCR。其反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)35次；72 ℃檢測(cè)信號(hào)。

1.8 Western blot檢測(cè)HIF-1α，VEGF蛋白表達(dá) 治療結(jié)束后，取各組腫瘤組織，以GAPDH為內(nèi)參照，Western blot法檢測(cè)各組殘瘤組織中HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)，并采用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labworks4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組殘瘤中VEGF和HIF-1α蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示，各組殘瘤中HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于A組(P<0.05)，同時(shí)C、D、E及F組也明顯高于B組(P<0.05)，見圖1～4。

A：A組；B:B組；C：C組；D：D組；E：E組；F：F組。

圖1 各組腫瘤組織中VEGF表達(dá)(免疫組織化學(xué)×400)

A：A組；B:B組；C：C組；D：D組；E：E組；F：F組。

圖2 各組腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)(免疫組織化學(xué)分析×400)

a:P<0.05，與B、C、D、E、F組同指標(biāo)比較；b：P<0.05，與C、D、E、F組同指標(biāo)比較。

圖3 各組腫瘤組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)的IOD

a:P<0.05，與B、C、D、E、F組同指標(biāo)比較；b：P<0.05，與C、D、E、F組同指標(biāo)比較。

圖4 Western blot檢測(cè)各組腫瘤中VEGF、HIF-1α的表達(dá)

A：VEGF;B:HIF-1α；a:P<0.05，與B、C、D、E、F組比較；b:P<0.05，與C、D、E、F組比較。

圖5 各組腫瘤組織中HIF-1α和VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平

2.2 各組腫瘤組織中VEGF、HIF-1α mRNA的水平 Q-PCR結(jié)果顯示，B、C、D、E、F組殘癌組織中HIF-1α和VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于A組(P<0.05)，同時(shí)C、D、E及F組也明顯高于B組(P<0.05)。見圖5。

2.3 各組腫瘤組織中MVD的水平 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與A組比較，其余各組腫瘤組織中MVD的水平均明顯偏高(P<0.05)，見圖6、7。

A：A組；B:B組；C：C組；D：D組；E：E組；F：F組。

圖6 各組腫瘤組織中MVD測(cè)定(免疫組織化學(xué)×400)

a:P<0.05,與B、C、D、E、F組同指標(biāo)比較；b:P<0.05,與C、D、E、F組同指標(biāo)比較。

圖7 各組腫瘤組織中MVD水平

3 討 論

腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移與新生毛細(xì)血管的形成密切相關(guān)，而新生血管的形成又與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等血管生成因子有關(guān)。大量研究已表明，VEGF是目前已知的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成刺激因子。HIF-1是一種核轉(zhuǎn)錄因子，它由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成，主要在組織缺氧時(shí)出現(xiàn)。其中HIF-1α作為氧分子調(diào)節(jié)單位，對(duì)HIF-1的功能和活性起著決定性作用。大多數(shù)腫瘤組織中均存在著HIF-1α，包括早期癌變甚至癌前病變[11]，這表明腫瘤細(xì)胞缺氧發(fā)生于微血管生成之前，并對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化起促進(jìn)作用[12]。因VEGF是HIF-1最重要的靶基因，HIF-1α也被認(rèn)為是腫瘤新生血管生成的核心啟動(dòng)子[13]。研究證明，HIF-1α不僅能增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性，還可以增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性[14-15]。Tsuzuki等[16]發(fā)現(xiàn)，VEGF主要表達(dá)于缺氧的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。同時(shí)，將缺失HIF-1的腫瘤細(xì)胞移植，其生成的腫瘤組織中VEGF的表達(dá)明顯降低，這再次證明了VEGF的高表達(dá)與HIF-1α的激活有關(guān)。

HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)是目前腫瘤基因治療的新熱點(diǎn)。HSV-TK基因可磷酸化無(wú)毒的GCV，將其轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性藥物，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞起殺傷作用。既往使用超聲輻照破壞攜帶目的基因的微泡，該方法提高了自殺基因在腫瘤組織中的表達(dá)，但是該方法是一種被動(dòng)尋靶作用，缺乏主動(dòng)靶向性。本研究采用的載HSV-TK基因的納米級(jí)超聲分子探針，采用納米級(jí)微泡作為載體，同時(shí)連接上GPC3抗體，解決了傳統(tǒng)微泡不能主動(dòng)尋靶的問題，進(jìn)而提高了自殺基因的轉(zhuǎn)染率、表達(dá)率，增強(qiáng)了基因治療的腫瘤殺傷效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIFU治療裸鼠肝移植瘤后，再注入載HSV-TK的納米級(jí)超聲分子探針治療，在殘瘤中MVD、 VEGF及HIF-1α的表達(dá)均低于HIFU聯(lián)合包裹HSV-TK基因的超聲微泡組及其他對(duì)照組。這表明HIFU聯(lián)合載HSV-TK基因的納米級(jí)超聲分子探針治療可以更有效地抑制腫瘤組織中血管的生成，使得腫瘤生長(zhǎng)的血供條件受限，造成腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)缺血壞死，從而提高腫瘤的治療效果。分析其機(jī)制，可能是由于載HSV-TK基因的納米級(jí)超聲分子探針，改善了腫瘤組織中的缺氧環(huán)境，進(jìn)而使HIF-1α的表達(dá)降低，使得VEGF的表達(dá)下調(diào)來(lái)降低殘瘤中的MVD。但HIFU聯(lián)合載HSV-TK基因的納米級(jí)超聲分子探針治療裸鼠肝移植瘤，其導(dǎo)致缺氧環(huán)境改善的具體機(jī)制目前尚不明確，可能與治療過(guò)程中自由基的產(chǎn)生有關(guān)，這有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，HIFU聯(lián)合載HSV-TK基因的納米級(jí)超聲分子探針治療肝癌，可降低肝癌組織中VEGF和HIF-1α的表達(dá)，使腫瘤新生血管減少，破壞腫瘤生長(zhǎng)的血供條件，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，提高并鞏固了HIFU治療肝癌的療效，這為肝癌治療手段的改善提供了理論依據(jù)。

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The effect of HIFU combined with nanoscale ultrasound molecular probes with simple virus thymidine kinase gene on angiogenesis in the nude mouse tumor*

XieHui1，LiuShan1，ZengHui1，LiYouwei1，XuJin1，DingXiong2,LiuChangan2，LiFeng1△

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,People′sHospitalofDeyang,Deyang,Sichuan618000,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Objective To observe the change of the protein and gene expression of hypoxia inducing factor-1α(HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the nude mouse tumor,which has been treated by HIFU combined with nanoscale ultrasound molecular probes with HSV1-TK gene microvascular density.Methods Sixty nude mice were implanted with HepG2 Cells to establish subcutaneous transplanted tumor.Divided this mice into six groups at random after treated by HIFU:MB+HSV-TK+GPC3 (group A),MB+HSV-TK (group B),HSV-TK+GPC3 (group C),HSV-TK (group D),MB+GPC3 (group E),PBS (group F).They were injected into the tail vein every after 3 days.Mice in group A,B,D and E were exposed to ultrasound by 2 W/cm2,1 MHz,5 mintues and 0.2 mL ganciclovi(GCV) was intraperitoneally injected at the first 48 hours after injection.After the treatment,immunohistoche were used to detect the microvascular density(MVD),Western blot and immunohistoche was employed to test the protein change of the VEGF and HIF-1α,Q-PCR was used to test the mRNA gene transcription of VEGF and HIF-1α in the tumor tissues.Results After 14 days,the protein expression of HIF-1α and VEGF in group A was significantly lower than that in group B,C,D,E and F (P<0.05),the MVD level in the tumor is also like this,and the difference is statistically significant.Conclusion Anoscale ultrasound molecular probes with HSV1-TK can reduce the the level of VEGF,MVD and HIF-1α in the tumor which has been treated by HIFU,so it can inhibit tumor growth and improve the therapeutic efficacy after HIFU treatment.

vascular endothelial growth factor A;high-intensity focused ultrasound;hypoxia-inducible factor 1;molecular probe;microvascular density

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272570)。

謝輝(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事肝硬化，膽道結(jié)石等肝膽疾病的臨床診治和研究。△

，E-mail:1340482261@qq.com。

R735.7

A

1671-8348(2017)06-0725-04

2016-10-23

2016-11-16)