張 健，馬德華，陳保富，郭海謝，張 波，朱成楚

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院心胸外科，浙江臨海 317000 )

論著·基礎(chǔ)研究

食管癌血紅素加氧酶-1表達(dá)水平與氟尿嘧啶療效的關(guān)系研究*

張 健，馬德華，陳保富，郭海謝，張 波，朱成楚△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院心胸外科，浙江臨海 317000 )

目的 本實(shí)驗(yàn)旨在探討Eca109食管鱗癌細(xì)胞中血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達(dá)水平與5氟尿嘧啶(5-FU)化療敏感性的關(guān)系。方法 培養(yǎng)Eca109食管鱗癌細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法分別檢測(cè)不同濃度(0、20、80、100 μmol/L)ZnppⅨ處理后細(xì)胞HO-1基因及HO-1蛋白表達(dá)水平，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及藥物抑制率。結(jié)果 隨著培養(yǎng)基ZnppⅨ濃度的增加，細(xì)胞抑制率顯著增高，80 μmol/L ZnppⅨ組顯著高于20 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)。各組間HO-1 mRNA的表達(dá)量依次為0.50±0.17、0.55±0.15、0.58±0.09、0.55±0.16，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組間HO-1的表達(dá)量依次為0.85±0.07、0.63±0.11、0.43±0.12、0.25±0.10，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.01，P<0.01)。結(jié)論 Eca109食管癌細(xì)胞抑制率與ZnppⅨ濃度正相關(guān)，而ZnppⅨ不是從基因水平，而是從蛋白的表達(dá)水平抑制HO-1的表達(dá)。

食管腫瘤;血紅素加氧酶-1;氟尿嘧啶;藥物療法;耐受性

目前在世界范圍內(nèi)，食管癌已成為癌癥死亡的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康和生命[1]。這與食管癌細(xì)胞侵襲性和轉(zhuǎn)移性的生物學(xué)特征密切相關(guān)，然而對(duì)其侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究仍是一大難題。20世紀(jì)80年代中末期，Müller等[2]率先在動(dòng)物和人體的肝、脾、肺、腦和睪丸等組織中分離獲得血紅素加氧酶(HO)及HO的同工酶。HO是體內(nèi)降解血紅素重要的限速酶,其可將血紅素分解為一氧化碳、Fe2+、膽綠素。近年來(lái)相關(guān)研究還表明HO與腫瘤增殖、血管發(fā)生、凋亡、耐藥等生物學(xué)行為密切相關(guān)。本文擬研究HO-1與食管癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)化療敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌ECa109細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Generay BioTech 公司，兔抗人、鼠HO-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，鋅原卟啉(ZnppⅨ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，5-FU(250 mg/10 mL)購(gòu)自上海佳和生物科技有限公司， PT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific Fermentas 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 5-FU濃度梯度分組：細(xì)胞接種6 h待其貼壁后，分別加入正常培養(yǎng)基，含12.5、50.0、100.0 μg/mL 5-FU的培養(yǎng)基，每24小時(shí)檢測(cè)1次，直至第4天；ZnppⅨ實(shí)驗(yàn)分組：正常細(xì)胞接種6 h待其貼壁后，分別加入正常培養(yǎng)基，含20、80、100 μmol/L ZnppⅨ的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，每24小時(shí)檢測(cè)1次，直至第4天。

1.3 MTT法繪制ECa109細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中HO-1 mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，提取總RNA，行RT-PCR檢測(cè)。HO-1基因上游引物為5′-CCA GCA ACA AAG TGC AAG ATT C-3′，下游引物為5′-GGT AAG GAA GCC AGC CAA GAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為240 bp。擴(kuò)增條件為在95 ℃預(yù)變性2 min：94.0 ℃ 45 s，64.5 ℃ 90 s ，72.0 ℃ 60 s，循環(huán)30次；最后在72.0 ℃ 保溫10 min。100 V瓊脂糖凝膠電泳35 min。并用AlphaImager2200凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。以β-actin為內(nèi)參，用軟件Quantity One 行灰度值分析。

1.5 Western blot分析HO-1蛋白表達(dá) 收集各組Ecal09細(xì)胞，提取總蛋白，一抗為1∶100稀釋的HO-1，二抗為1∶200稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG，DAB顯色，將膠片進(jìn)行掃描及拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析。用Quantity one軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行灰度分析，計(jì)算HO-1/GAPDH比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 在不同濃度5-FU作用下的Eca109細(xì)胞生長(zhǎng)情況 在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，隨著5-FU濃度的增加，細(xì)胞抑制率也隨之增加，兩者之間呈正相關(guān)(圖1)。在培養(yǎng)基5-FU濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)2 d(48 h)即出現(xiàn)50%左右的細(xì)胞抑制率。

圖1 不同濃度5-FU作用下的Eca109細(xì)胞 生長(zhǎng)及抑制曲線

圖2 不同濃度ZnppⅨ處理后Eca109細(xì)胞 生長(zhǎng)及抑制曲線

2.2 不同濃度的ZnppⅨ處理后，Eca109細(xì)胞在含100 μg/mL 5-FU的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的細(xì)胞生長(zhǎng)情況 細(xì)胞分正常組、5-Fu組、20 μmol/L ZnppⅨ組、80 μmol/L、ZnppⅨ組。在細(xì)胞接種后的第1、2天，4組間的細(xì)胞存活情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明ZnppⅨ對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性；于接種第2天結(jié)束，向各組細(xì)胞加入100 μg/mL 5-FU(除正常組外)，在接種第3天，正常組、5-FU組、20 μmol/L ZnppⅨ組、80 μmol/L ZnppⅨ組細(xì)胞生長(zhǎng)情況(A值)分別為2.11±0.09,1.42±0.02,1.32±0.11,1.14±0.51，5-FU組與20 μmol/L ZnppⅨ組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，80 μmol/L ZnppⅨ組顯著低于5-FU組及20 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)。在接種第4天，正常組、5-FU組、20 μmol/L ZnppⅨ組、80 μmol/L ZnppⅨ組細(xì)胞生長(zhǎng)情況(A值)分別為2.15±0.19,1.75±0.10,1.35±0.08,0.76±0.06，80 μmol/L ZnppⅨ組顯著低于5-FU組及20 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 不同濃度ZnppⅨ干預(yù)細(xì)胞HO-1基因表達(dá)情況 在正常培養(yǎng)基及含有20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養(yǎng)基培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞中，各組間HO-1 mRNA 的表達(dá)量依次為0.50±0.17、0.55±0.15、0.58±0.09、0.55±0.16，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3。

2.4 Eca109細(xì)胞在不同濃度ZnppⅨ干預(yù)下HO-1蛋白表達(dá)情況 在含有正常培養(yǎng)基、20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養(yǎng)基培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞中，各組間HO-1的表達(dá)量依次為0.85±0.07、0.63±0.11、0.43±0.12、0.25±0.10。各組間HO-1的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.01，P<0.01)，表明在蛋白水平上，ZnppⅨ能有效抑制HO-1的表達(dá)。通過(guò)兩兩之間LSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達(dá)水平顯著高于含20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養(yǎng)基中的細(xì)胞HO-1的表達(dá)水平(P<0.05)。而80 μmol/L ZnppⅨ與100 μmol/L ZnppⅨ之間HO-1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

1:正常培養(yǎng)；2:20 μmol/L ZnppⅨ；3:80 μmol/L ZnppⅨ；4:100 μmol/L ZnppⅨ;5、6：DNA分子標(biāo)記物；7～10：β-actin。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組HO-1基因表達(dá)情況

圖4 各實(shí)驗(yàn)組HO-1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)HO-1在食管癌細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜均有表達(dá)，但在正常組織中以細(xì)胞核表達(dá)為主，而食管組織發(fā)生癌變后，食管細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞膜的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞核的陽(yáng)性率略降低，提示細(xì)胞內(nèi)可能存在HO-1蛋白活化遷移。HO-1的陽(yáng)性表達(dá)程度在食管癌浸潤(rùn)程度(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)中均有顯著的差異性，表明HO-1在食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色[3]。HO-1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中過(guò)度表達(dá)[4]。敲除Nrf-2后，順鉑誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)被顯著抑制，其誘導(dǎo)的氧化損傷顯著提高。提示抑制HO-1的表達(dá)或抑制Nrf-2，可顯著增強(qiáng)順鉑的抗癌效果。在肺黏液表皮樣癌中，應(yīng)用miRNA抑制HO-1的表達(dá)可影響其生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[5]。HO-1通過(guò)影響細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡作用[6]，在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，而且P53蛋白參與其中。在耐藥性方面，Kuroda等[7]研究表明，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的抗順鉑耐藥性與HO-1的表達(dá)呈正相關(guān)，并與包括PI3K/AKT及NF-κB(nuclear factor-κb)信號(hào)系統(tǒng)在內(nèi)的表皮生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)。在使用HO-1抑制劑ZnppⅨ的情況下,可增強(qiáng)結(jié)腸癌、肺癌和胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性,減慢腫瘤生長(zhǎng)速度。Hirai等[8]應(yīng)用ZnppⅨ及HO-1激動(dòng)劑鈷原卟啉(CoPPIX)處理C57BL的LL/2肺癌小鼠后發(fā)現(xiàn)，ZnppⅨ可以有效抑制腫瘤的微血管密度并增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率，且與劑量呈正相關(guān)，CoPPIX的作用則正好相反。HO-1在乳腺癌中過(guò)度表達(dá)[9]，除HO-1可以提高阿奇霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的療效，提示HO-1可能通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡和自噬調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性。缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)可調(diào)節(jié)血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的生成，而HO-1抑制劑ZnPPⅨ可抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，也表明使用ZnPPⅨ后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有較小的腫瘤結(jié)節(jié)和較輕程度的血管生成。提示HO-1的抑制劑ZnPPⅨ具有抗腫瘤的作用，可以顯著減少HIF-1α水平，阻斷VEGF的產(chǎn)生從而影響腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。Ying Yang 1(YY1)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，Luo等[11]發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中，YY1 mRNA表達(dá)量顯著增加，其是通過(guò)抑制HO-1的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)作用。過(guò)度表達(dá)YY1，可以增加食管癌TE1細(xì)胞的放療敏感性。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)5-FU對(duì)食管癌化療敏感性的研究顯示，在Eca109食管癌細(xì)胞接種后的第1天，4組間的細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在用不同濃度ZnppⅨ處理細(xì)胞后，再加入5-FU，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)。第4天時(shí)(100 μg/mL 5-FU作用2 d后)，20 μmol/L ZnppⅨ組及80 μmol/L ZnppⅨ組細(xì)胞存活率顯著低于5-FU組(P<0.05)，且20 μmol/L ZnppⅨ組細(xì)胞存活率顯著高于80 μmol/L ZnppⅨ組(P<0.05)。提示當(dāng)ZnppⅨ濃度增加，細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)水平下降時(shí)，有利于增強(qiáng)Eca109細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，使得同一濃度的5-FU取得更大的細(xì)胞抑制率。

在基因水平的研究顯示，不同濃度的ZnppⅨ處理后的Eca109食管癌細(xì)胞，其HO-1基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示ZnppⅨ并不能從基因水平抑制HO-1的表達(dá)。但在對(duì)HO-1的基因多態(tài)性的研究中，Hu等[12]發(fā)現(xiàn)，飲酒組食管癌患者中L型等位基因(L/L)及L型等位基因攜帶者(S/L)的頻率顯著高于非飲酒組，且HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)-(GT)n的重復(fù)序列可能與男性飲酒者食管癌發(fā)生有關(guān)，減少飲酒量可以有效保護(hù)L型等位基因攜帶者。乙醇可以使得Eca109食管癌細(xì)胞中HO-1表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)伴隨著p38MAPK及mTOR通路的激活[13]。Kim等[14]從水生酸模草中提取出QC，在對(duì)食管上皮細(xì)胞的研究中表明，其可有效增高HO-1的表達(dá)，并且可能與Nrf2、ERK、PI3K-AKt及PKC信號(hào)通路有關(guān)。

在蛋白水平，在含有0、20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養(yǎng)基培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞中，各組間HO-1的表達(dá)量依次為0.85±0.07、0.63±0.11、0.43±0.12、0.25±0.10。各組間HO-1的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明在蛋白水平上，ZnppⅨ能有效抑制HO-1的表達(dá)。通過(guò)兩兩之間LSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)基中細(xì)胞HO-1的表達(dá)水平顯著高于含20、80、100 μmol/L ZnppⅨ培養(yǎng)基中細(xì)胞HO-1的水平(均P<0.05)。而80 μmol/L ZnppⅨ與100 μmol/L ZnppⅨ組之間HO-1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示在一定范圍內(nèi)(本麻驗(yàn)為20～100 μmol/L )，對(duì)比正常培養(yǎng)的細(xì)胞，ZnppⅨ可以顯著抑制細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)水平。但隨著培養(yǎng)基中ZnppⅨ濃度的增加(本實(shí)驗(yàn)為80～100 μmol/L )，并不能進(jìn)一步顯著抑制HO-1的表達(dá)水平。

正常組織細(xì)胞HO-1可起到維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、減低氧化損傷、削弱炎性反應(yīng)的作用。而在腫瘤細(xì)胞中，HO-1的表達(dá)卻與腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、抗凋亡作用有密切聯(lián)系。應(yīng)用HO-1抑制劑可以有效地抑制細(xì)胞生長(zhǎng),而應(yīng)用其誘導(dǎo)劑則使腫瘤細(xì)胞對(duì)于產(chǎn)生ROS的治療方法產(chǎn)生抵抗效應(yīng)[8]。由于HO-1具有在體內(nèi)極易被快速誘導(dǎo)合成的優(yōu)點(diǎn)，HO-1可作為潛在的抗腫瘤治療靶點(diǎn),對(duì)與臨床抗腫瘤治療有重要意義。進(jìn)一步深入探討HO-1在食管癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，及其與各化療藥物敏感性的相關(guān)關(guān)系，探究HO-1表達(dá)水平與個(gè)體化化療間的關(guān)系有重要意義。這為通過(guò)抑制或降低HO-1表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，為臨床尋找有效的治療方案提供新思路。

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Study on HO-1 expression in hunman esophageal carcinoma and correlates with chemotherapy sensitivity of fluorouracil*

ZhangJian,MaDehua,ChenBaofu,GuoHaixie,ZhangBo,ZhuChengchu△

(DepartmentofCardio-ThoracicSurgery,TaiZhouHospitalAffiliatedtoWenzhouMedicalUniversity,TaiZhou,Zhejiang317000,China)

Objective To explore the HO-1 expression levels with 5-FU chemosensitivity in esophageal squamous cell carcinoma.Methods Eca109 cells used in all experiments,MTT assay was used in cell growth curve and inhibit rate.RT-PCR and Western blot was used to detect HO-1 in cells treated with different concentrations of ZnppⅨ(0，20，80，100 μmol/L).Results The inhibitory rate of cells was significantly increased when the concentrition of ZnppⅨ increased.The inhibitory rate of cells in 80 μmol/L ZnppⅨ was higher than 20 μmol/L ZnppⅨ group(P<0.05).The expression of HO-1 mRNA in each group was 0.50±0.17,0.55±0.15,0.58±0.09 and 0.55±0.16,respectively，there was no significant difference between the two groups (P>0.05).The expression of HO-1 was 0.85±0.07,0.63±0.11,0.43±0.12 and 0.25±0.10,respectively.The expression of HO-1 had significant difference (F=20.01,P<0.01).Conclusion Eca109 cells inhibition rate positive correlated with ZnppⅨ concentrations,and ZnppⅨ were inhibited the expression of HO - 1.not from gene level,but after the translation level.

esophageal neoplasms;heme Oxygenase-1;fluorouracil;drug therapy;tolerance

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.003

浙江省重大科技專項(xiàng)和優(yōu)先主題項(xiàng)目(11C13039-2)；浙江省臺(tái)州市科技局項(xiàng)目(11KY11)。

張健(1987-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事心胸外科工作。△

，E-mail:zhucc.tzyy@gmail.com。

R735.1

A

1671-8348(2017)06-0729-03

2016-10-18

2016-11-16)