丁 航，李彩虹，馬衛(wèi)列，張志珍

（廣東醫(yī)科大學，廣東 東莞 528000）

小鼠肝組織DNA的提取及鑒定綜合性實驗在生物化學與分子生物學教學中的實施

丁 航，李彩虹，馬衛(wèi)列，張志珍*

（廣東醫(yī)科大學，廣東 東莞 528000）

生物化學與分子生物學是醫(yī)學專業(yè)重要的基礎課程，實驗教學尤其是綜合性實驗教學對學生綜合技能的培養(yǎng)至關重要。從實驗設計思路、組織實施、實施效果、教學體會等方面闡述小鼠肝組織DNA的提取及鑒定綜合性實驗在生物化學與分子生物學教學中的實施，并分析教學中存在的問題，提出相應的對策，為有關院校進行相關的綜合性實驗教學提供參考。

小鼠肝組織DNA；綜合性實驗；生物化學與分子生物學

生物化學與分子生物學是基礎醫(yī)學與臨床醫(yī)學密切聯(lián)系的學科，實驗課是其教學的重要組成部分，是提高學生基本實驗操作技能的主要手段，是培養(yǎng)學生獨立分析問題、解決問題能力的重要教學途徑之一，是學生后續(xù)專業(yè)技能學習與提高的必要基礎。為了幫助學生更好地理解生物化學與分子生物學的理論知識，通過開展小鼠肝組織DNA的提取及鑒定綜合性實驗，幫助學生克服對生物化學與分子生物學的抽象、畏難情緒，認識到生物化學與分子生物學不再神秘，可以自如駕馭[1]。這樣不僅利于提高生物化學與分子生物學的教學質量，而且能鍛煉學生綜合技能的運用能力。

1 實驗設計原理

真核細胞中，DNA以核蛋白形式存在于細胞核中。提取質量較好的DNA產(chǎn)品應該遵循兩個基本原則：一是要將DNA與蛋白質、脂類、糖類和RNA等充分分離；二是在操作過程中盡量避免DNA斷裂，保持其分子的完整性。

在各種動物組織DNA提取方法中，最常用的經(jīng)典方法是酚/氯仿抽提法。本實驗在小鼠肝組織DNA抽提過程中加入十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulphate，SDS），可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分子分離；加入乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），可抑制脫氧核糖核酸酶活性，減少DNA分子降解。釋放出來的DNA用酚/氯仿抽提，除去蛋白質，然后用氯仿抽提，以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用無水乙醇使DNA沉淀析出，得到目的產(chǎn)物。

DNA的特征吸收峰位于260 nm處，測定出A260nm數(shù)值后，利用公式可推算出不同形式DNA樣品的濃度。分離提取DNA時主要的雜質之一是蛋白質，其特征吸收峰位于280 nm，同時測定出DNA樣品的A260nm值及A280nm值后，計算出A260nm/A280nm的值，大致可以判定產(chǎn)品的組成情況。

2 實驗課程的內容

2.1 肝勻漿的制備

斷頸法處死小鼠，立即取出肝臟，用冷生理鹽水洗去表面附著的血液，濾紙吸干多余水分，稍剪碎，放入玻璃勻漿器中，加入10 mL冷TE緩沖液，一手持勻漿管將下端插入待勻漿樣品中，另一手將搗管垂直插入套管中，上下轉動研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，得到組織勻漿液。

2.2 提取DNA

（1）取0.2 mL勻漿液置于1.5 mL離心管中，加入10%SDS溶液0.2 mL，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，溶液變黏稠。（2）取飽和酚0.25 mL，氯仿/異戊醇0.25 mL，加入上述溶液中，顛倒混勻，室溫放置5分鐘（其間不斷搖動離心管以保持溶液呈乳狀），在4℃以12 000 r/min離心10分鐘。（3）取出離心管，小心吸取上層溶液，將其置入一支新的1.5 mL離心管中，加入0.5 mL氯仿/異戊醇，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，在4℃以12 000 r/min離心5分鐘。（4）取出離心管，小心吸取上層溶液（記住溶液體積，可分多次吸取，避免吸到沉淀部分），將其置入一支新的1.5 mL離心管中。加入0.3倍上清液體積的10 mol/L NH4Ac溶液及2.5倍上清液體積的無水乙醇后，顛倒混勻，即可觀察到纖維狀DNA沉淀析出。在4℃以12 000 r/min離心5分鐘，小心倒去上層溶液，將離心管甩干，靜置5分鐘使乙醇揮發(fā)。加入1.0 mL TE緩沖液溶解DNA。

2.3 DNA的測定

將溶解的DNA樣品轉移到干凈試管中，加入3.0 mL TE緩沖液，混勻。以TE緩沖液為空白溶液調零，在紫外分光光度計上分別測定DNA溶液的A260nm值和A280nm值。

3 實施的效果

3.1 鞏固并拓展了所學知識，熟悉了實驗基本原理和操作過程

由于生物化學與分子生物學這門課程的理論知識較為抽象，復雜難懂，學生在預習實驗的過程中，需要查閱書本，上網(wǎng)觀看課程實驗視頻或者在網(wǎng)上查找資料，以便更好地整理、融合、消化、理解實驗原理、操作步驟和注意事項等，使生物化學的理論得到更加形象的驗證。同時，幫助學生更清晰地認識和更好地掌握這個實驗所涉及的知識點。這正是每個綜合性實驗所要達到的目的。

3.2 調動了學生學習的積極性和主動性

本綜合性實驗改變了傳統(tǒng)的“實驗課教師講學生聽，學生再按照實驗指導機械地完成實驗操作”的模式，這次實驗課前，教師已要求學生預習實驗，要對實驗目的、操作程序和要求有所了解，查閱資料，開拓思路，帶著問題在實驗課上動手操作[2]。在實驗過程中或在實驗結束后的專題實驗報告中，學生可以隨時提出自己對實驗過程設計的想法。如此安排，對于調動學生學習的積極性和主動性很有幫助。在實驗中環(huán)環(huán)相扣，往往上一個小實驗的結果就是下一個小實驗開始的前提，肝組織的研磨必須充分，這樣才能得到較高純度的DNA，進而進行后續(xù)實驗。這種實驗安排促使學生必須認真仔細地對待每一步操作，以獲得準確的實驗結果。若沒有獲得理想的結果，就要自己查找原因，促使學生成為整個實驗教學的主體。

3.3 加強了學生動手能力

在以前傳統(tǒng)的實驗教學模式中，學生根據(jù)講義上所寫的實驗步驟和教師課堂講解進行機械性操作，操作較為簡單[3]。就本次綜合性實驗而言，從殺鼠取肝、研磨、提取DNA到DNA含量測定，學生都需要格外小心，要全神貫注地操作，稍不注意就有可能導致實驗失敗，在此過程中，大大提高了學生的動手能力。

3.4 增強了團隊意識

隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，科學研究越來越重視團隊合作，單靠一個人的力量很難事事通曉、面面俱到，因此，教師應該有意識地培養(yǎng)學生與他人合作、交流、溝通的能力。在本次綜合性實驗中，幾乎每一步都需要學生互相合作，這是實驗成功的關鍵。因此，本實驗有效地增強了學生的團隊意識。

DNA的提取是生物化學與分子生物學研究的基礎技術，提取的DNA的純度及結構完整性是進行基因工程各項研究所必需的條件。目前應用較為廣泛的有親子鑒定、法醫(yī)鑒定、基因重組及疾病檢測等。另外，在基因工程研究中，常常需要提取分離基因組DNA，可用于構建基因組文庫、Southern雜交及PCR分離基因等。通過本實驗，可以使學生對DNA的提取有所了解、對DNA的提取研究有一個整體概念，從而提高學生的綜合能力，使他們所學知識更完整并得到升華。

[1]王寧，陳園園，李仲，等.淺談醫(yī)學生物化學實驗教學的改革與探索[J].教育教學論壇，2016（28）：272-273.

[2]徐宋瑤，薛昕，鄧鳳，等.醫(yī)藥類院校生物化學實驗教學改革的探索與研究[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2017，31（2）：20-21.

[3]王輝.病原生物學與免疫學實驗課教學改革及實踐[J].科技文匯，2016（11）：77-78.

G424．31

B

1671－1246（2017）22－0074－02

廣東醫(yī)科大學教學質量與教學改革工程項目（JG1403）

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張志珍）