李強(qiáng)，鄭蘇林，馮瑜菲，楊振國(guó)，張晶晶

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001)

研究報(bào)告

水溫改變對(duì)斑馬魚(yú)脊髓損傷修復(fù)的影響

李強(qiáng)#，鄭蘇林#，馮瑜菲，楊振國(guó)，張晶晶*

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001)

目的 利用斑馬魚(yú)脊髓損傷模型，研究水溫改變對(duì)脊髓損傷修復(fù)的影響，并檢測(cè)在脊髓修復(fù)過(guò)程中，損傷處細(xì)胞數(shù)目以及腦內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的變化情況。方法 利用手術(shù)構(gòu)建斑馬魚(yú)脊髓損傷模型；通過(guò)改變斑馬魚(yú)生活的水溫來(lái)觀察其脊髓損傷后游動(dòng)能力的變化情況；用振動(dòng)切片技術(shù)及免疫組織化學(xué)觀察脊髓損傷處不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)目的改變情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析腦內(nèi)相關(guān)基因gdnf、nos的表達(dá)差異。結(jié)果 28℃、30℃、32℃水溫均不會(huì)導(dǎo)致未手術(shù)組與假手術(shù)組斑馬魚(yú)游動(dòng)能力的改變(P>0.05)；32℃水溫環(huán)境能夠使脊髓損傷組斑馬魚(yú)比28℃、30℃水溫環(huán)境的斑馬魚(yú)恢復(fù)游動(dòng)的能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。脊髓切片染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓損傷后損傷處細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)。相同時(shí)間點(diǎn)，水溫為32℃比28℃、30℃細(xì)胞數(shù)目增多更加明顯(P<0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)，gdnf基因在脊髓損傷術(shù)后與對(duì)照組相比在24 h、7 d、14 d均明顯升高(P<0.05)；nos基因在脊髓損傷術(shù)后24 h明顯升高(P<0.05)，7 d時(shí)與相同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)，而14 d時(shí)與相同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 適當(dāng)提高水環(huán)境溫度可促進(jìn)斑馬魚(yú)脊髓損傷后恢復(fù)。

脊髓損傷；水療；斑馬魚(yú)；gdnf；nos

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指由于外界直接或間接因素?fù)p傷脊髓，造成損傷節(jié)段以下軀體運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)及自主神經(jīng)功能障礙[1-3]。脊髓損傷后，首先是脊髓的連續(xù)性及完整性遭到破壞，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能中斷，損傷后脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)出血、水腫、血管活性物質(zhì)釋放，導(dǎo)致血栓形成和微血管痙攣。同時(shí)，缺氧、炎癥、細(xì)胞內(nèi)外鈣離子失衡、自由基產(chǎn)生過(guò)多、興奮性氨基酸和細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放等繼發(fā)性病理改變進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞壞死[4-7]。脊髓損傷急性期后進(jìn)入修復(fù)期，由于神經(jīng)細(xì)胞不可再生，膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分裂填補(bǔ)死亡的神經(jīng)細(xì)胞，形成膠質(zhì)瘢痕，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能永久喪失。在修復(fù)過(guò)程中，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)和一氧化氮(NO)對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)具有重要影響[8-11]。

脊髓損傷治療主要包括急性期治療和康復(fù)期治療。急性期治療主要應(yīng)用脫水劑、類(lèi)固醇制劑、促進(jìn)神經(jīng)再生藥物、抗氧化藥和自由基清除劑等藥物，減輕或消除脊髓損傷性水腫，改善血供，保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，從而改善脊髓損傷患者的神經(jīng)功能。而康復(fù)期治療主要是促進(jìn)肢體肌力、肌張力恢復(fù)，從而提高患者生活、工作和回歸社會(huì)的能力。水療(aquatic therapy)是康復(fù)治療中的一種新興手段，它是利用水的不同因素(如水溫、水流速度等)作用于機(jī)體全身或局部，促進(jìn)肢體功能恢復(fù)，從而減輕患者脊髓損傷后遺癥。

斑馬魚(yú)(zebrafish)是一種水生魚(yú)類(lèi)，其基因組與人類(lèi)基因同源性高達(dá)87%，是研究人類(lèi)疾病的理想動(dòng)物模型。斑馬魚(yú)具有非凡的組織再生能力，如視網(wǎng)膜、肝臟、心臟及視神經(jīng)等[12-15]。眾多研究顯示斑馬魚(yú)脊髓損傷后顯示出了強(qiáng)大的神經(jīng)修復(fù)能力，使其成為研究脊髓損傷的理想動(dòng)物模型[16,17]。同時(shí)，其生活環(huán)境依賴(lài)于水，因此便于通過(guò)改變水環(huán)境各因素來(lái)觀察脊髓損傷康復(fù)情況。

本文通過(guò)建立斑馬魚(yú)脊髓損傷模型，并應(yīng)用于不同水溫環(huán)境，研究水溫對(duì)斑馬魚(yú)脊髓損傷恢復(fù)的影響。同時(shí)觀察斑馬魚(yú)脊髓損傷處細(xì)胞的變化情況，并檢測(cè)在神經(jīng)恢復(fù)過(guò)程中，腦內(nèi)gdnf和nos基因的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為4～6月齡成年AB系斑馬魚(yú)，體長(zhǎng)2～4 cm，由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心斑馬魚(yú)平臺(tái)提供，斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照《廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的標(biāo)準(zhǔn)及廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批要求進(jìn)行。術(shù)前斑馬魚(yú)集中養(yǎng)殖于28℃水環(huán)境中, 每天給予14 h光照和10 h無(wú)光照。將成年斑馬魚(yú)隨機(jī)分為未損傷組、假手術(shù)組和脊髓損傷組。術(shù)后分別養(yǎng)殖于28℃、30℃、32℃水環(huán)境中，每尾魚(yú)置于單獨(dú)魚(yú)缸中，每日給予14 h光照和10 h無(wú)光照，換水1次，喂食2次。在脊髓切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，觀察各條件組在脊髓損傷后24 h、7 d、14 d時(shí)損傷處細(xì)胞的變化情況。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組與脊髓損傷組分別于術(shù)后24 h、7 d、14 d時(shí)取全腦存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 脊髓損傷動(dòng)物模型制備

參照Schachner研究小組[18]的方法制作斑馬魚(yú)脊髓損傷模型。術(shù)前使用0.033% 3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽 (MS 222, Sigma-Aldrich)麻醉30 s～2 min，待斑馬魚(yú)呼吸停止后，轉(zhuǎn)移至過(guò)濾紙上，并保持頭向左側(cè)的平臥位。在體視顯微鏡(SMZ-161-BLED, Motic, China)視野下，以鰓蓋后緣和背鰭連線(xiàn)的中點(diǎn)為手術(shù)點(diǎn)，去除魚(yú)鱗(約4片)后，用眼科剪沿手術(shù)點(diǎn)縱行剪開(kāi)皮膚(約2 mm)，再用眼科鑷逐層鈍性分離皮下組織及肌肉層，直至暴露脊髓。手術(shù)組用眼科剪切斷脊髓；假手術(shù)組僅暴露而不切斷脊髓。手術(shù)完成后，用組織粘合劑(B. Braun, Melsungen, Germany)封閉傷口。SCI 手術(shù)成功標(biāo)志：手術(shù)時(shí)在顯微鏡下能夠看到脊髓完全橫斷的截面, 并且術(shù)后 3 d 斑馬魚(yú)無(wú)游泳能力, 同時(shí)體型保持直線(xiàn)型。

1.3 脊髓切片及免疫組織化學(xué)染色

手術(shù)取斑馬魚(yú)脊髓手術(shù)截?cái)帱c(diǎn)前、后兩端脊髓各約0.5 mm處組織，用4%多聚甲醛4℃固定6～8 h，再用4%低熔點(diǎn)瓊脂包埋，用振動(dòng)切片機(jī)(Leica VT1000S, Germany)將脊髓組織水平切片，每個(gè)樣本收集5張切片，厚度90 μm，用DAPI(1∶1000；Sigma)和羅丹明(1∶500；Invitrogen)于室溫染色2 h，最后封片并用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SPS II，Germany)觀察拍照。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4.1 基因組總 RNA 的提取及 cDNA的合成

參照Trizol?reagent (Invitrogen，USA)說(shuō)明書(shū)提取斑馬魚(yú)大腦總RNA, -80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將提取RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reageng Kit，TaKaRa，Dalian)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI網(wǎng)站中g(shù)dnf、nos及內(nèi)參基因gapdh的mRNA序列并結(jié)合斑馬魚(yú)全基因組測(cè)序公布的序列(gdnfGenBank 登錄號(hào)：BC150163.1，神經(jīng)系統(tǒng)nosGenBank 登錄號(hào)：AF219519.1，gapdhGenBank登錄號(hào)：NM_213094.2)，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物。引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物合成表

1.4.3 PCR 擴(kuò)增體系和條件

采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各個(gè)基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析。熒光染料為SYBR Green I (SYBR? Premix Ex TaqTMII，TaKaRa，Dalian)，以gapdh作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系總體積為 20 μL, 包括：SYBR 10 μL，ddH2O 6.4 μL，上、下游引物(F、R) (10 μmol/L)各 0.8 μL，模板 2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30 s；95℃變性 5 s, 60℃，退火/延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線(xiàn)95℃ 5 s ,60℃ 1 min,95℃, 1個(gè)循環(huán)。由Roche LightCycler480 II型熒光定量 PCR 儀收集熒光信號(hào)。每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置 3 個(gè)重復(fù), 對(duì)得到的 3 個(gè) Ct 值取平均值, 用2-ΔΔCt[19]法進(jìn)行計(jì)算。1.5 數(shù)據(jù)收集

2 結(jié)果與分析

2.1 行為學(xué)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在水溫28 ℃時(shí)，未手術(shù)組與假手術(shù)組相比較，斑馬魚(yú)在1周時(shí)5 min內(nèi)游動(dòng)距離分別為(1206±84) cm和(1184±83) cm，兩者之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，且在1、2、4、6、8周時(shí)，未手術(shù)組與假手術(shù)組組內(nèi)及組間均無(wú)差異(P>0.05)。在室溫30℃時(shí)，未手術(shù)組與假手術(shù)組斑馬魚(yú)在1周時(shí)其5 min內(nèi)游動(dòng)距離分別為(1185±108) cm和(1155±133) cm，兩者之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。且分別在1、2、4、6、8周比較，組內(nèi)及組間差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。在室溫32℃時(shí)，未手術(shù)組與假手術(shù)組斑馬魚(yú)在1周時(shí)其5 min內(nèi)游動(dòng)距離分別為(1199±85) cm和(1175±106) cm，兩者之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，且分別在1、2、4、6、8周比較，組內(nèi)及組間差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)。同時(shí)，將30℃和32℃的未手術(shù)及假手術(shù)組斑馬魚(yú)同28℃時(shí)的對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比較，各組內(nèi)、組間差異均無(wú)顯著性(P>0.05)(圖1)。

注：水環(huán)境溫度升高至30 ℃、32 ℃時(shí)，不會(huì)對(duì)未手術(shù)組斑馬魚(yú)和假手術(shù)組斑馬魚(yú)游動(dòng)能力產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 ± s )表示，采用單因素方差分析，每組有9尾斑馬魚(yú)。non-injury:未手術(shù)組斑馬魚(yú)；sham:假手術(shù)組斑馬魚(yú)。 圖1 未手術(shù)組及假手術(shù)組斑馬魚(yú)的游動(dòng)能力Note. The water temperature changed from 28℃ to 32℃ did not affect the swimming ability of the zebrafish of the non-injury and sham-injury groups. Data are mean±standard deviation (SD). One-way ANOVA was used for statistical analysis. Fig.1 Swimming ability of the zebrafish in the sham-injury and non-injury groups.

斑馬魚(yú)脊髓損傷后，其游動(dòng)能力明顯減弱。在水溫 28℃、術(shù)后1周時(shí)，其5 min內(nèi)游動(dòng)距離為(83±11) cm，僅相當(dāng)于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組斑馬魚(yú)游泳距離7%。術(shù)后2、4、6、8周游動(dòng)距離分別為(174± 28)、(471±78)、(606±34)、(713±30) cm，至第8周末，手術(shù)組斑馬魚(yú)游動(dòng)能力逐漸恢復(fù)了62 %。在水溫30℃時(shí)，術(shù)后1、2、4、6、8周其5 min內(nèi)游動(dòng)距離分別為(101 ±30)、(188±60)、(480±89)、(724±92)、(801±82) cm。在水溫32℃時(shí)，術(shù)后1、2、4、6、8周其5 min內(nèi)游動(dòng)距離分別為(102±24)、(238±92)、(560±102)、(740±74)、(838±149) cm，第8周末時(shí)，手術(shù)組斑馬魚(yú)游動(dòng)能力恢復(fù)了70 %，與水溫28℃和30℃相同時(shí)間點(diǎn)比較，其恢復(fù)能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖2)。

注：斑馬魚(yú)脊髓損傷后，游動(dòng)能力明顯減弱，隨后逐漸恢復(fù)。水溫32℃比30℃、28℃恢復(fù)能力明顯增加(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 ± s )表示，采用單因素方差分析，每組有9尾斑馬魚(yú)。*(P<0.05)代表與水溫為28℃組差異有顯著性。sham：假手術(shù)組斑馬魚(yú)；SCI：脊髓損傷組斑馬魚(yú)。圖2 脊髓損傷組斑馬魚(yú)的游動(dòng)能力Note. The swimming ability recovers at post spinal cord injury. At 32℃, the swimming ability recovers faster than at 28℃ or at 30℃. Data are mean±standard eviation (SD). One-way ANOVA was used for statistical analysis. n=9.*P< 0.05 means it is significantly different compared with the 28℃ water temperature group. sham: sham-injury; SCI: spinal cord injury.Fig.2 Mean swimming distances for 5 min of the zebrafish at 8 weeks after spinal cord injury.

2.2 斑馬魚(yú)脊髓損傷后細(xì)胞數(shù)量變化情況

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比，脊髓損傷組斑馬魚(yú)在術(shù)后24 h損傷處細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增多，但各條件組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。術(shù)后1周，脊髓損傷處細(xì)胞明顯增多，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比，差異有顯著性(P<0.05)；且水溫32℃時(shí)的細(xì)胞數(shù)較28℃增多明顯(P<0.05)。術(shù)后14 d，損傷處細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比，差異均有顯著性(P<0.05)，且水溫32℃時(shí)的脊髓損傷處細(xì)胞數(shù)與28℃、30℃相比，差異有顯著性(P<0.05)，提示脊髓在修復(fù)期細(xì)胞總數(shù)明顯增多，且適當(dāng)提高水溫對(duì)脊髓修復(fù)具有促進(jìn)作用(圖3、4)。

注：斑馬魚(yú)脊髓損傷后，損傷處細(xì)胞數(shù)目明顯增多。與28℃、30℃相比，32℃時(shí)細(xì)胞數(shù)目增加更加明顯。sham-injury:假手術(shù)組；SCI:脊髓損傷組；紅色：細(xì)胞間質(zhì)；藍(lán)色：細(xì)胞核。圖3 脊髓損傷后細(xì)胞數(shù)量的變化情況(標(biāo)尺=100 μm)Note. The cell proliferation increases obviously following spinal cord injury. The proliferation of cells surrounding the injured spinal cord was stronger in SCI fish incubated in 32℃water than in 28℃ or 30℃ water. SCI: spinal cord injury. Red: rhodamine phalloidin for F-actin staining; Blue: DAPi for nuclear staining.Fig.3 Changes of cell amount following spinal cord injury (Bar=100 μm, ×40).

2.3gdnf、nos基因在脊髓損傷修復(fù)過(guò)程中表達(dá)量的變化

2.3.1gdnf基因的表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)證實(shí), 與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比，脊髓損傷手術(shù)后 24 h, 三組不同水溫條件斑馬魚(yú)gdnf基因在腦中表達(dá)量均升高(P<0.05)；術(shù)后7 d, 在水溫為28℃、30℃時(shí)，gdnf基因在斑馬魚(yú)腦中的表達(dá)量大約是同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組的4.5倍(P<0.05)，而在水溫32℃時(shí)，gdnf基因在斑馬魚(yú)腦中的表達(dá)量大約是同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組的8.5倍(P<0.05)；到手術(shù)后14 d時(shí)，各條件組斑馬魚(yú)gdnf基因的表達(dá)量下降，但仍維持在較高水平上(P<0.05)(圖5)。

2.3.2nos基因的表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)證實(shí), 與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比，nos基因的表達(dá)在術(shù)后 24 h 的斑馬魚(yú)腦中明顯升高(P<0.05)。在術(shù)后7 d，nos基因表達(dá)量呈降低趨勢(shì)，與7 d時(shí)假手術(shù)組相比，nos表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。術(shù)后 14 d時(shí)，nos基因表達(dá)量進(jìn)一步降低，顯著低于 14 d 假手術(shù)組nos表達(dá)量(P<0.05)，提示其在脊髓損傷急性期，腦內(nèi)nos基因高表達(dá)參與炎癥反應(yīng)，而在修復(fù)期低表達(dá)則促進(jìn)脊髓修復(fù)(圖6)。

3 討論

脊髓損傷(SCI)分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷往往是脊髓功能難以恢復(fù)的主要原因，包括脊髓出血、水腫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)外離子失衡、脂質(zhì)過(guò)氧化等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的壞死或凋亡，膠質(zhì)瘢痕形成、阻礙軸突再生。斑馬魚(yú)在脊髓損傷后血-脊髓屏障遭到破壞，炎癥細(xì)胞滲透到損傷部位，導(dǎo)致大量組織喪失，這些過(guò)程發(fā)生在損傷后的早期階段，但持續(xù)時(shí)間很短[20]。且有研究顯示這些早期炎癥反應(yīng)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生具有促進(jìn)作用[21-24]，可能是急性炎癥反應(yīng)提供了一個(gè)有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境。在脊髓損傷修復(fù)過(guò)程中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放許多神經(jīng)因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)等均促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。同時(shí)良好的損傷微環(huán)境對(duì)脊髓損傷后修復(fù)也具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在脊髓損傷后修復(fù)過(guò)程中，斑馬魚(yú)腦內(nèi)gdnf較長(zhǎng)時(shí)間維持較高水平，這表明gdnf基因參與了斑馬魚(yú)脊髓損傷修復(fù)的病理過(guò)程，升高可以促進(jìn)神經(jīng)元的再生與分化，改善了神經(jīng)再生的微環(huán)境，更利于神經(jīng)軸突的修復(fù)。而nos在損傷后24 h明顯升高，之后逐漸降低，到14 d時(shí)則明顯低于對(duì)照組。這表明nos在損傷早期參與炎癥反應(yīng)，但持續(xù)時(shí)間短，且很快降低，從而為損傷局部維持了一個(gè)利于神經(jīng)再生與修復(fù)的微環(huán)境。同時(shí)，這也提示我們, 在脊髓損傷后, 不僅應(yīng)重視損傷處的病理變化, 腦內(nèi)的病理生理變化亦對(duì)神經(jīng)的再生具有重要影響。

注：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差±s )表示，采用單因素方差分析，每組有5個(gè)樣本。*(P<0.05)代表兩組比較差異有顯著性。Sham：假手術(shù)組斑馬魚(yú)；SCI：脊髓損傷組斑馬魚(yú)。圖4 脊髓損傷后細(xì)胞增殖數(shù)量的變化情況Note. Data are mean±standard deviation (SD). One-way ANOVA is used for statistical analysis. n=5. *(P<0.05) means that it is significantly different between the two groups. sham: sham-injury; SCI: spinal cord injury.Fig.4 Changes of cell number during the proliferation after spinal cord injury.

注：實(shí)時(shí)定量 PCR 顯示, 斑馬魚(yú)腦中 gdnf 基因表達(dá)在脊髓損傷后 24 h、 7 d及 14 d, 與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)斑馬魚(yú)組相比, 表達(dá)均出現(xiàn)顯著性升高。采用兩獨(dú)立樣本t-test，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，*(P<0.05)代表兩組比較差異有顯著性。sham:假手術(shù)組斑馬魚(yú)；SCI：脊髓損傷組斑馬魚(yú)。圖5 gdnf 基因在斑馬魚(yú)脊髓損傷后的表達(dá)變化Note. Real-time PCR assay shows that gdnf is up-regulated in all groups post SCI at 24 h, and 7 and 14 days. Student’s t test is used for statistical analysis, each group of experiment is repeated for 3 times.*(P<0.05) means it is significantly different between the two groups. sham: sham-injury; SCI: spinal cord injury.Fig.5 Changes of the expression of gdnf following spinal cord injury

注：實(shí)時(shí)定量 PCR 顯示,與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組樣本相比,斑馬魚(yú)腦中 nos基因表達(dá)在脊髓損傷后24 h 顯著性升高。脊髓損傷后14 d，斑馬魚(yú)腦中 nos 基因表達(dá)與假手術(shù)組相比出現(xiàn)顯著性降低。采用兩獨(dú)立樣本t-test，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，*(P<0.05)代表兩組比較差異有顯著性。sham: 假手術(shù)組斑馬魚(yú)；SCI：脊髓損傷組斑馬魚(yú)。圖6 nos基因在斑馬魚(yú)脊髓損傷后的表達(dá)變化Note. Real-time PCR assay shows that the nos expression is up-regulated in all groups at 24 h and 7 days after SCI. There is no significant difference between the SCI group and sham-injury group. While after 14 days, the expression of nos is reduced in the SCI group compared with the sham-injury group. Student’s t test is used for statistical analysis, each experiment of the groups is repeated for 3 times. *(P <0.05) means it is significantly different between the two groups. sham: sham-injury; SCI: spinal cord injury.Fig.6 Changes of the expression of nos following spinal cord injury.

在斑馬魚(yú)脊髓損傷急性期，各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷處參與炎癥反應(yīng)，局部細(xì)胞數(shù)目明顯增多，此時(shí)以紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞為主。進(jìn)入脊髓損傷修復(fù)期后，細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增多，而此時(shí)則以放射狀膠質(zhì)細(xì)胞增多為主。放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)期逐漸形成膠質(zhì)橋梁，為軸突形成提高支架，對(duì)斑馬魚(yú)脊髓損傷修復(fù)過(guò)程具有非常重要的作用。同時(shí)損傷后中央管背腹側(cè)的祖細(xì)胞區(qū)域被損傷所激活，出現(xiàn)室管膜放射狀膠質(zhì)細(xì)胞增生，產(chǎn)生新的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[25,26]。研究表明，中央管室管膜放射狀膠質(zhì)細(xì)胞可能是脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的祖細(xì)胞，其能在不同部位再生不同類(lèi)型的中間神經(jīng)元[27]。

水療是脊髓損傷后治療的重要手段。其對(duì)感覺(jué)末梢具有良性刺激，改善血管功能，促進(jìn)局部和全身循環(huán)，松弛并緩解肌肉痙攣。臨床研究也顯示[28]，水療對(duì)促進(jìn)患者肢體功能恢復(fù)具有一定效果。但水療促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的具體機(jī)制仍未明確。本實(shí)驗(yàn)利用模式動(dòng)物斑馬魚(yú)研究水溫對(duì)脊髓損傷修復(fù)的影響，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)適當(dāng)提高水溫可促進(jìn)脊髓修復(fù)，為進(jìn)一步研究水療促進(jìn)脊髓修復(fù)的具體機(jī)制提供依據(jù)。

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Effect of water temperature on the recovery of spinal cord injury in zebrafish

LI Qiang#, ZHENG Su-lin#, FENG Yu-fei, YANG Zhen-guo, ZHANG Jing-jing*

(Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, China)

Objective Using zebrafish to analyze the effect of water temperature on the recovery of spinal cord injury. To detect the cell proliferation and changes of gene expression at the injury site during the process of recovery. Methods Surgical operation was performed to induce spinal cord injury (SCI) on adult fish. Water at a series of temperature was applied to culture the fish. Swimming ability was adopted to observe the recovery of spinal cord injury following surgery. Vibration sections and immunohistochemistry were performed to observe the cell number post SCI at different stages. The changes ofgdnfandnosgene expression were determined by real-time PCR. Results The water temperature changes from 28℃ to 32℃ did not affect the swimming ability of non-injured and sham-injured fish (P>0.05). The swimming ability recovered mostly in 8 weeks post spinal cord injury. At 32℃, the swimming ability recovered faster than at 28℃ or at 30℃ (P<0.05). The cell proliferation increased obviously following spinal cord injury (P<0.05). The proliferation of cells surrounding the spinal cord in jury was more extensive in SCI fishes incubated in 32℃ water than in 28℃ or 30℃ water (P<0.05). Real-time PCR assay showed thatgdnfwas up-regulated in all groups post SCI at 24 h, and 7 and 14 days (P<0.05). Thenosexpression was up-regulated in all groups following SCI in 24 h (P<0.05) and 7 days. There was no significant difference between the SCI group and sham-injury group (P<0.05), while after 14 days, the expression ofnoswas reduced in the SCI group compared with the sham-injury group (P<0.05). Conclusions A slight increase of incubating water temperature can accelerate the recovery of spinal cord injury in zebrafish.

Spinal cord injury; Aquatic therapy; Zebrafish;gdnf;nos

ZHANG Jing-jing, E-mail: gdmccrc@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(31370824)；廣東省“培養(yǎng)高層次人才特殊支持計(jì)劃”專(zhuān)項(xiàng)基金(粵人才辦〔2015〕8號(hào))；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃〔YQ2015081〕；湛江市非資助科技攻關(guān)項(xiàng)目。

李強(qiáng)(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)，E-mail: 330938901@qq.com；鄭蘇林(1982-)，男，康復(fù)治療師，研究方向：運(yùn)動(dòng)與康復(fù)醫(yī)學(xué)，E-mail: 39069986@qq.com；#為同等貢獻(xiàn)作者。

張晶晶，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)。E-mail: gdmccrc@163.com。

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0001-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.001

2016-07-28