吳子健　吳桂玲　陳達(dá)婷　蘇瀾　陳春蓉　葉錦霞　洪振強(qiáng)

【摘 要】目的：探究巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）對(duì)體外培養(yǎng)的SD大鼠軟骨細(xì)胞G1/S周期蛋白與mRNA含量表達(dá)的影響，為其防治骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：①用乙醇加熱回流法獲得其醇提物成分；采用機(jī)械-酶消化法分離SD大鼠膝關(guān)節(jié)處的關(guān)節(jié)軟骨，建立體外培養(yǎng)細(xì)胞模型并進(jìn)行鑒定；②MTT法檢測(cè)M-AAE對(duì)軟骨細(xì)胞增殖特性的影響，使用倒置相差顯微鏡鏡下觀察軟骨細(xì)胞狀態(tài)；③PCR、Western blot法分別檢測(cè)體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞經(jīng)M-AAE的0，75，150，300 μg·mL-1 DMEM溶液干預(yù)48 h后的mRNA、蛋白含量的表達(dá)。結(jié)果：①軟骨細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原法染色后，陽性對(duì)照組胞漿區(qū)域浸染為棕黃色；②經(jīng)MTT檢測(cè)M-AAE對(duì)軟骨細(xì)胞增殖具有一定的時(shí)效-量效關(guān)系，其最佳干預(yù)時(shí)間和濃度分別為48 h和150 μg·mL-1；③M-AAE干預(yù)軟骨細(xì)胞后，各加藥組細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-4（CDK4）、細(xì)胞周期蛋白D1 （Cyclin D1）的mRNA與蛋白含量的表達(dá)量均明顯高于0 μg·mL-1組，其中以150 μg·mL-1組的表達(dá)量最高（P < 0.01），75 μg·mL-1組和300 μg·mL-1組在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比較，其表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：M-AEE可上調(diào)CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)，對(duì)SD大鼠軟骨細(xì)胞具有一定的促增殖作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；巴戟天；牛膝；醇提物；軟骨細(xì)胞；增殖；大鼠

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種臨床常見的骨科退行性疾病，由于生物力學(xué)作用異常等疊加因素的影響，引起關(guān)節(jié)軟骨代謝及修復(fù)功能失衡，進(jìn)而加劇關(guān)節(jié)軟骨退變，造成關(guān)節(jié)損害。臨床表現(xiàn)常以關(guān)節(jié)反復(fù)性疼痛、腫脹、活動(dòng)障礙為主。鑒于其發(fā)病周期長(zhǎng)、致殘率高等特點(diǎn)，對(duì)其防治具有重要現(xiàn)實(shí)意義[1-2]。目前，治療OA的方法眾多，大致可分保守治療和手術(shù)治療兩大類。其中，保守治療以藥物為主，西醫(yī)主要有口服和局部給藥兩種方式，前者因非甾體抗炎藥等產(chǎn)生的胃腸道不良反應(yīng)而使用受限，而后者可有感染危險(xiǎn)且效果也非常有限；手術(shù)方法作為一種補(bǔ)救措施，因其并發(fā)癥較多，影響因素復(fù)雜，且術(shù)后需要長(zhǎng)時(shí)間康復(fù)，遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步考證。中醫(yī)藥療法治療具有多靶點(diǎn)、療效顯著、副作用小、適合長(zhǎng)期治療等優(yōu)勢(shì)[3]。

當(dāng)前，在中醫(yī)藥領(lǐng)域，補(bǔ)肝腎祛風(fēng)濕法在防治OA上應(yīng)用廣泛，并成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)[4]。巴戟天、牛膝均具有補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨功效，是臨床治療OA常用配伍藥。巴戟天、牛膝的聯(lián)用可追溯到《備急千金要方》記載的巴戟天酒，其合用可增強(qiáng)補(bǔ)腎強(qiáng)筋、祛風(fēng)除痹之效用，治療肝腎虧虛型骨痹具有良性作用；另外源自《太平圣惠方》的巴戟丸亦由巴戟天和牛膝組方。因此，本研究旨在觀察藥對(duì)巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）對(duì)體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞周期蛋白與基因的影響，進(jìn)而為其闡明防治OA的治療機(jī)制及臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠16只，體質(zhì)量90～100 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2012-0001（閩）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥材巴戟天和牛膝，均由福州回春中藥飲片有限公司提供。

1.3 主要試劑 磷酸鹽緩沖液（HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；RT-PCR引物合成、CyclinD1、CDK4、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；TRIZOL（美國(guó)life）；異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司）；無水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司）；瓊脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；WB玻板（美國(guó)BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制劑）；RISF（裂解液）、蛋白上樣緩沖液、1-StepTM Transfer Buffer、ECL高效顯影液（Thermo）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8與pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸鈉）、10×電泳液、AP（過硫酸銨）、TEMED、50×TAE（碧云天生物技術(shù)研究所）；10×TBST（Solarbio）；高效封閉液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；一抗（兔抗）、CyclinD1 Antibody、Cdk4 Antibody（C-22，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology）；二抗（羊抗兔，美國(guó)CST）等。

1.4 主要儀器 DNA擴(kuò)增儀（9600型，美國(guó)PE）；低溫高速離心機(jī)（64R型，美國(guó)BECKMAN）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；超純水裝置（MILLI-Q型，美國(guó)MILIPORE）；熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，日本TKO）；無菌操作臺(tái)（AIRTECH型）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F型）（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000型，美國(guó)BIO-RAD）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BIO-TEK ELX800型，美國(guó)BIO-Tek）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型，德國(guó)Heraus）等。

2 方 法

2.1 M-AAE的提取 稱取巴戟天、牛膝各100 g，依次經(jīng)粉碎、篩檢后移入裝有500 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%乙醇的燒瓶中浸漬7 d，收集上清液；再加入500 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%乙醇，依法浸漬7 d，再次收集上清液；第3次加入500 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%乙醇，繼續(xù)浸漬7 d后收集上清液，最后合并3次浸出液，靜置24 h，過濾，濃縮，回旋蒸發(fā)乙醇，97 ℃水浴鍋持續(xù)蒸干水分，即得M-AEE提物浸膏。后置于烘干箱繼續(xù)蒸干，待低溫下研磨成粉末狀。實(shí)驗(yàn)用時(shí)進(jìn)行精確稱量，并使用DMEM在低頻超聲下溶解，再經(jīng)0.22 μL無菌濾嘴濾過后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?

2.2 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行脫頸椎處死SD大鼠，每次3只，分離膝關(guān)節(jié)處關(guān)節(jié)軟骨。收集并剪碎至1 mm3/單位體積，PBS緩沖液沖洗至少3次后移至無菌小培養(yǎng)皿中，按每個(gè)器皿2.5 mL的體積加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶進(jìn)行消化，15 mL離心管收集消化后的上清液（每次2 h），1500 r·min-1離心機(jī)離心后棄上清液，移液器代液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清DMEM）狀態(tài)緩慢吹勻沉淀。經(jīng)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（2×105·mL-1）后種植原代軟骨細(xì)胞于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后初次換液。鏡下觀察細(xì)胞鋪滿80%瓶底面積時(shí)，經(jīng)胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代。本實(shí)驗(yàn)使用第2代軟骨細(xì)胞[5]。

Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色：軟骨細(xì)胞（經(jīng)計(jì)數(shù)每毫升2500個(gè)）待爬片后，經(jīng)PBS沖洗3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定30 min。再經(jīng)沖洗、裂解（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的破膜劑50 μL）20 min，沖洗后加入50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2反應(yīng)

20 min。再次沖洗后經(jīng)5% BSA封閉30 min，設(shè)置陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組。陽性對(duì)照組加入含Ⅱ型膠原1∶200的一抗反應(yīng)過夜，陰性對(duì)照組加入PBS作為對(duì)照。后經(jīng)PBS沖洗3遍后加入50 μL二抗（1∶200）反應(yīng)30 min，再次沖洗后以每張玻片50 μL DAB進(jìn)行浸潤(rùn)10 min。再依次經(jīng)過漂洗、蘇木素復(fù)染、沖洗（PBS）、返藍(lán)2 s、常溫晾干、梯度酒精、二甲苯進(jìn)行脫水與透明后封片觀察[6]。

2.3 MTT測(cè)定M-AAE干預(yù)后軟骨細(xì)胞增殖活性

以96孔板為載體培育經(jīng)計(jì)數(shù)為每孔2×103的第

2代軟骨細(xì)胞24 h后，再饑餓細(xì)胞同步培養(yǎng)24 h，

棄去舊液更換含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)，標(biāo)記分組后依次加入0，75，150，300，600 μg·mL-1濃度的M-AEE分別培養(yǎng)24，48，72 h。后續(xù)操作依次為：棄凈每孔舊液、

37 ?C溫箱MTT（每孔100 μL）反應(yīng)5 h、二甲基亞砜（DMSO）振蕩條件下反應(yīng)10 min（每孔100 μL）、

酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔OD值、記錄與分析。

2.4 M-AEE干預(yù)軟骨細(xì)胞活性鏡下觀察 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，選取實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞，經(jīng)0，75，150，300 μg·mL-1濃度的總醇提物DMEM溶液干預(yù)48 h后，使用光鏡觀察。

2.5 RT-PCR法檢測(cè)CDK4、Cyclin D1 mRNA表達(dá)

2.5.1 CDK4、Cyclin D1 mRNA引物設(shè)計(jì)與合成見表1。

2.5.2 RT-PCR方法 使用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)所提Total RNA濃度，當(dāng)A260/A280比值在1.8～

2.0時(shí)，表明本實(shí)驗(yàn)所提取的軟骨細(xì)胞Total RNA純度較高。然后進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠。成膠后取出浸入電泳槽，加TAE（1×）電泳緩沖液，排除氣泡。取上述各組RNA 每孔5 μL、Marker 每孔4.5 μL，電泳條件為100 V、70 mA、15 min，使用BIO-RAD Fluor-S TM Multi Imager圖象分析儀下掃描，經(jīng)分析后拍照存檔。

2.6 Western Blot檢測(cè)CDK4、Cyclin D1蛋白含量 設(shè)置分組（0，75，150，300 μg·mL-1組），經(jīng)M-AAE干預(yù)48 h后，依次經(jīng)PBS沖洗后吸凈、加入裂解液（含100∶1蛋白酶抑制劑PMSF）、收集經(jīng)刮刀刮取的細(xì)胞后離心取上清進(jìn)行蛋白提取，參照碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行定量；制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%分離膠與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%濃縮膠進(jìn)行灌板，按每孔50 μg量計(jì)算上樣體積后依次加入，蛋白Marker加入每孔5 μL，在恒流下以20 V電壓先跑10 min，再調(diào)整到100 V電壓跑至分離膠底部進(jìn)行電泳；調(diào)整電流為1.3 A、電壓25 V，本實(shí)驗(yàn)中以β-actin耗時(shí)為7 min、CDK4為5 min、Cyclin D1為5 min進(jìn)行半干式轉(zhuǎn)膜，再經(jīng)TBST中漂洗、封閉、洗膜、一抗過夜（1∶1000濃度的β-actin、CDK4、Cyclin D1）、TBST漂洗、二抗（1∶5000）封閉后洗膜進(jìn)行顯影。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞觀察與鑒定 第2代軟骨細(xì)胞鏡下觀察：分布均勻，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，呈明顯的鋪路石狀外觀；經(jīng)Ⅱ型膠原免疫組化染色后，陽性對(duì)照組胞漿區(qū)為棕黃色，陰性對(duì)照組胞漿區(qū)顏色透明。以上可鑒定本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。見圖1。

3.2 M-AEE對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的時(shí)效與量效關(guān)系 用MTT法檢測(cè)M-AAE在不同濃度（0，75，150，300，600 μg·mL-1）及不同時(shí)間（24，48，72 h）對(duì)軟骨細(xì)胞增殖特性的影響。與0 μg·mL-1組比較，24，48，72 h的OD值均有升高，其中以48 h與150 μg·mL-1條件下軟骨細(xì)胞增殖明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。進(jìn)而推測(cè)M-AAE干預(yù)軟骨細(xì)胞后，對(duì)其增殖具有一定的時(shí)效-量效關(guān)系。其最佳干預(yù)時(shí)間和濃度分別為48 h和

150 μg·mL-1。見表2。

3.3 M-AEE干預(yù)軟骨細(xì)胞活性鏡下觀察 經(jīng)0，75，150，300 μg·mL-1濃度的總醇提物DMEM溶液干預(yù)48 h后，行光鏡下觀察：0 μg·mL-1濃度下觀察細(xì)胞外觀形似扁平狀，胞漿豐富，胞核清晰，具有1～2個(gè)核仁，細(xì)胞數(shù)目較少，見圖2（1）；經(jīng)75 μg·mL-1濃度干預(yù)后，細(xì)胞分布均勻，大部為扁平狀、細(xì)胞狀態(tài)較好且細(xì)胞數(shù)量較多，見圖2（2）；經(jīng)150 μg·mL-1濃度干預(yù)后，軟骨細(xì)胞緊貼聚集生長(zhǎng)，外觀以扁平狀為主，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，細(xì)胞核清晰、飽滿，細(xì)胞狀態(tài)佳，細(xì)胞數(shù)目最多，見圖2（3）；經(jīng)300 μg·mL-1濃度干預(yù)后，細(xì)胞數(shù)目較多但細(xì)胞核不規(guī)則，培養(yǎng)基中漂浮細(xì)胞較多，細(xì)胞狀態(tài)欠佳，見圖2（4）。

3.4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 M-AAE干預(yù)軟骨細(xì)胞后，各加藥組CDK4、ClinD1的mRNA的表達(dá)量均明顯高于0 μg·mL-1組，其中以150 μg·mL-1組的表達(dá)量最高（P < 0.01）。75 μg·mL-1組和300 μg·mL-1

組在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比較，其表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

3.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果 M-AAE干預(yù)軟骨細(xì)胞后，各加藥組CDK4、ClinD1蛋白表達(dá)量明顯高于0 μg·mL-1組，其中以150 μg·mL-1組的表達(dá)量最高（P < 0.01）。75 μg·mL-1組和300 μg·mL-1

組相比，在Cyclin D1和CDK4指標(biāo)上，其蛋白含量的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

4 討 論

OA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，其病機(jī)主要在于“天癸竭，形體衰”導(dǎo)致肝腎虧虛，進(jìn)而加劇筋骨失養(yǎng)，最終表現(xiàn)為關(guān)節(jié)不利、疼痛纏綿?；凇澳I主骨、肝主筋”“肝腎同源”理論，腎精充足則肝血充盈，肝血得到濡養(yǎng)則能化精，腎精方可充滿，由此可見，腎中精氣的氣化與肝血的化生存在互生互利的密切聯(lián)系。鑒于OA的病位在“肝腎”而外現(xiàn)于“筋骨”，故通過補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕法使經(jīng)絡(luò)通達(dá)，則肝腎精華得以濡養(yǎng)筋骨，從而驅(qū)逐滯留關(guān)節(jié)外邪，以達(dá)通利關(guān)節(jié)之效[7]。巴戟天、牛膝則以其補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕的作用整體切合OA的病機(jī)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天主要化學(xué)成分有糖類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜苷類、有機(jī)酸類、微量元素、氨基酸和甾醇類等，具有改善機(jī)體免疫功能、抗氧化、強(qiáng)壯骨骼、抗炎鎮(zhèn)痛補(bǔ)血及促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖和分化等作用[8-10]。牛膝作為臨床治療OA常用藥物，可引經(jīng)下行，治療OA發(fā)揮重要作用，研究表明，其主要成分有皂苷、脫皮甾酮、牛膝甾酮及糖類物質(zhì)，并具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凝血等作用[11-13]。

鑒于細(xì)胞活力與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)狗脊多糖在不同濃度下對(duì)體外培養(yǎng)SD大鼠軟骨細(xì)胞活性作用的影響，結(jié)果顯示，M-AAE對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響與其藥物濃度和時(shí)間有關(guān)，其最佳時(shí)效-量效關(guān)系為48 h和150 μg·mL-1；軟骨細(xì)胞可發(fā)生有絲分裂，產(chǎn)生子代軟骨細(xì)胞，以此維持關(guān)節(jié)功能趨于穩(wěn)定。鑒于細(xì)胞有絲分裂的表現(xiàn)形式類似圓周循環(huán)，即具有周期性，通常稱之為細(xì)胞周期，而對(duì)其調(diào)控發(fā)揮主要作用的內(nèi)源性途徑主要由細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）等組成，兩者的協(xié)同作用可直接推動(dòng)骨細(xì)胞跨越位于DNA合成起始部的G1/S

周期，進(jìn)而決定細(xì)胞分裂，從而影響細(xì)胞增殖結(jié)果[14-15]。故本研究基于G1/S周期的CDK4、Cyclin D1的正性調(diào)節(jié)作用，初步探討M-AAE對(duì)體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 μg·mL-1組相比，M-AAE在一定條件下可上調(diào)CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。進(jìn)而提示M-AAE可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞分裂，對(duì)軟骨細(xì)胞增殖具有正性調(diào)控作用，從而為其在臨床應(yīng)用于OA提供相關(guān)依據(jù)。

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收稿日期：2016-10-10；修回日期：2016-11-30