林龍鎮(zhèn)+萬云鳳+洪文榮

摘要為檢測(cè)ctcK基因的功能，利用基因工程技術(shù)在金色鏈霉菌J13（Streptomyces aureofaciens J13）上構(gòu)建ctcK基因缺失工程菌SK12（ΔctcK），并分析了其次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化.經(jīng)質(zhì)譜分析顯示，工程菌SK12代謝物中檢測(cè)到去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的分子離子峰，但未檢測(cè)到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的分子離子峰，這與出發(fā)菌J13代謝物的檢測(cè)結(jié)果相反.結(jié)果表明，ctcK基因的失活阻斷了金霉素的生物合成代謝流，使工程菌SK12主要積累去甲基金霉素，顯示ctcK基因參與金霉素C6位甲基化.本研究初步闡明了ctcK基因的功能，同時(shí)獲得了一株主產(chǎn)去甲基金霉素的工程菌.

關(guān)鍵詞ctcK基因；去甲基金霉素；甲基化；生物合成；金色鏈霉菌

中圖分類號(hào)Q935文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537（2017）01003707

金霉素（CTC）是一類臨床上主要用于治療革蘭氏陽性球菌，特別是葡萄球菌（Staphylococcus）、肺炎球菌（Streptococus pneumoniae）的四環(huán)類廣譜抗生素.除了抗生和抗炎功效之外[13]，自20世紀(jì)80年代以來，科學(xué)家還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)金霉素具有抗腫瘤活性[4]、非抗菌作用[5]及非抗感染用途[6].去甲基金霉素（DMCTC），亦屬于四環(huán)類抗生素，與金霉素相比在C6位少了一個(gè)甲基.去甲基金霉素不僅對(duì)革蘭氏陽性和陰性菌有抑菌活性，對(duì)衣原體（Chlamydia）、立克次體（Rickettsia）、肺炎支原體（Mycoplasma pneumonia）等致病性病毒亦有很好的抑制效果.與金霉素相比，去甲基金霉素不僅抗菌活力更強(qiáng)、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、還因具有易被人體吸收、排泄快、長效性和高效性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用.此外，它還是合成米諾環(huán)素和替加環(huán)素的重要母體[7].

金霉素生物合成途徑和生物合成基因的相關(guān)研究不多[810].2013年，鄧子新團(tuán)隊(duì)報(bào)道了金霉素生物合成基因簇并確定了鹵化酶基因，同時(shí)還推測(cè)ctcK基因可能是金霉素C6位甲基化酶基因，但至今仍未經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明（GenBank：HM627755）[11].基于本實(shí)驗(yàn)室已建立的大腸桿菌（Escherichia coli）與金色鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移體系[1213]，本研究采用基因框內(nèi)敲除方法，特異性滅活ctcK基因，分析ctcK基因失活突變株代謝產(chǎn)物的變化，旨在闡明ctcK基因在金霉素pretetramid到6methylpretetramid生物轉(zhuǎn)化中的作用，進(jìn)而驗(yàn)證ctcK基因是否為金霉素C6位甲基化酶基因.研究結(jié)果可間接獲得主產(chǎn)去甲基金霉素的工程菌，為開發(fā)去甲基金霉素等系列藥物奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒金色鏈霉菌J13，大腸桿菌top10，大腸桿菌ET12567（pUZ8002），大腸桿菌鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pKC1139及pJTU412均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆載體pMD19T購自TaKaRa公司.

1.1.2培養(yǎng)基與抗生素金色鏈霉菌斜面培養(yǎng)基及預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基見文獻(xiàn)[13]，種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基見文獻(xiàn)[14]；大腸桿菌生長培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基[15].本研究中使用的抗生素及其終濃度分別為：氨芐青霉素 100 mg/L，安普霉素 50 mg/L，氯霉素 25 mg/L，卡那霉素 50 mg/L，萘啶酮酸 25 mg/L.

1.1.3主要試劑限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；溶菌酶，RNase A酶，Proteinase K和DNA凝膠回收試劑盒均購自上海生工公司；其他常規(guī)試劑見文獻(xiàn)[16].

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)以金霉素生物合成基因簇（GenBank：HM627755）為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物K1/K2和K3/K4，分別用于擴(kuò)增ctcK基因上游交換臂KB1和下游交換臂KB2；再根據(jù)同源重組原理，設(shè)計(jì)兩對(duì)篩選單交換和雙交換的鑒定引物K5/K6和K7/K8；引物序列及其限制酶見表1.

1.2.2分子克隆PCR、酶切、酶連、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及其轉(zhuǎn)化、小量質(zhì)粒DNA提取，方法參見實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[17]；金色鏈霉菌染色體DNA提取參見鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)[16]；DNA測(cè)序委托上海生工公司.

1.2.3單交換突變株篩選將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567（pUZ8002），再通過接合轉(zhuǎn)移方法將其導(dǎo)入金色鏈霉菌J13. 35 ℃培養(yǎng)16～20 h后，覆蓋30 mg/L安普霉素和25 mg/L萘啶酮酸，繼續(xù)在35 ℃培養(yǎng)，4 d后長出接合子.挑取其中一株命名為金色鏈霉菌SK11，簡稱SK11，提取其基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證.接合轉(zhuǎn)移具體方法見文獻(xiàn)[14].

1.2.4雙交換突變株篩選將單交換工程菌在斜面培養(yǎng)基上松弛培養(yǎng)5代，然后分離單菌落，將單菌落影印至含安普霉素的抗性平板和不含抗生素的普通平板上.培養(yǎng)5 d后，從887株菌中篩選得到1株安普霉素敏感菌株，命名為金色鏈霉菌SK12，簡稱SK12，提取其基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證.

1.2.5發(fā)酵及代謝產(chǎn)物組分檢測(cè)對(duì)菌株進(jìn)行分離純化，獲得長勢(shì)較好的單菌落，轉(zhuǎn)接斜面35 ℃培養(yǎng)5～7 d，待斜面孢子豐滿.刮取適量的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，32 ℃，280 r/min振蕩培養(yǎng)18～22 h，使菌體處于對(duì)數(shù)生長期.再按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，29 ℃，265 r/min，發(fā)酵72 h.放瓶后，將發(fā)酵液用草酸酸化至pH 1.2～1.5，并于4 ℃靜置30 min，以釋放效價(jià).再依次加入0.1%～0.2%的黃血鹽及0.1%～0.2%的硫酸鋅，不斷攪拌10 min，以除去蛋白.然后4 ℃，12 000 r/min，離心5 min，取上清，經(jīng)甲醇稀釋5倍，過0.22 μm濾膜，所得樣品直接用于高效液相色譜分析.樣品經(jīng)甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，再過0.22 μm濾膜，用于質(zhì)譜分析.

1.2.6高效液相色譜條件及質(zhì)譜方法液相色譜條件：采用島津液相色譜儀LC20A和SinoChrom ODSBP色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）進(jìn)行分析；流動(dòng)相中V（甲醇）∶V（10 mol/L甲酸）=20∶80；流速：1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長360 nm；進(jìn)樣量：10 μL.

質(zhì)譜掃描條件：采用Exactive Plus高分辨質(zhì)譜儀和電噴霧離子化源（ESI源）進(jìn)行測(cè)定；極性檢出模式：正模式（MS+）；毛細(xì)管電壓：3 800 V；干燥氣：N2；流速：6 L/min；干燥氣溫度：320 ℃；檢測(cè)方式：一級(jí)全掃描.

2結(jié)果與分析

2.1CtcK蛋白序列基本性質(zhì)分析

通過生物信息學(xué)軟件Vector.NTI 11.5查找已公布的金霉素生物合成基因簇（GenBank： HM627755）并將ctcK基因序列翻譯成CtcK蛋白氨基酸序列.使用瑞士生物信息中心引擎（http：//web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析此蛋白氨基酸的親疏水性和跨膜區(qū)，可知CtcK蛋白以疏水性氨基酸為主，且CtcK蛋白不具有跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外.

2.2CtcK蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能分析

將CtcK蛋白氨基酸序列通過SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，經(jīng)Rasmol軟件進(jìn)行顯示和分析，結(jié)果如圖1（彩圖見封三）.該蛋白含有兩條肽鏈，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主.再經(jīng)蛋白保守結(jié)構(gòu)域在線分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）表明CtcK中76 aa～317 aa組成SAM依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域.因此推測(cè)ctcK基因可能是負(fù)責(zé)催化金霉素C6位甲基化酶的基因.

2.3重組質(zhì)粒pJTK2的構(gòu)建

以J13的染色體DNA為模板，用兩對(duì)引物K1/K2和K3/K4分別擴(kuò)增上游交換臂KB1（2 033 bp）和下游交換臂KB2（2 051 bp）.PCR樣品經(jīng)電泳檢測(cè)后，回收目標(biāo)條帶并進(jìn)行TA克隆，得到中間質(zhì)粒pTK1和pTK2.質(zhì)粒pTK1和pTK2分別經(jīng)XbaⅠ/EcoRⅤ和EcoRⅤ/EcoRⅠ雙酶切后，回收KB1和KB2片段；質(zhì)粒pJTU412經(jīng)XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，回收7 879 bp的片段并與KB1和KB2片段進(jìn)行酶連，構(gòu)建質(zhì)粒pJTK1；最后，用EcoR Ⅰ對(duì)質(zhì)粒pJTK1和puc30apr分別進(jìn)行單酶切，分別回收11 951 bp和1 168 bp的片段，再次酶連，經(jīng)篩選得到最終質(zhì)粒pJTK2（pJTU412∶∶KB1∶∶KB2∶∶apr），其酶切驗(yàn)證見圖2B.該質(zhì)粒以Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ雙酶切，得到5 234，3 766，2 978和1 141 bp四條帶；用EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ雙酶切，得到7 879，4 072，1 141和27 bp四條帶；用EcoR Ⅴ/Hind Ⅲ雙酶切，得到9 289，2 855和975 bp三條帶；pJTK2經(jīng)以上3種方式酶切，電泳條帶大小均與理論預(yù)測(cè)一致，克隆系列經(jīng)測(cè)序與預(yù)測(cè)吻合.由此，重組質(zhì)粒pJTK2構(gòu)建完畢.

2.4金色鏈霉菌SK12重組菌株的構(gòu)建

接合轉(zhuǎn)移得到的突變株SK11，用引物K5/K6擴(kuò)增到1 559 bp和2 300 bp片段，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)大小一致，初步確定為單交換菌株，電泳結(jié)果見圖3B泳道2.

影印篩選得到的突變株SK12，用引物K5/K6和K7/K8分別擴(kuò)增到1 559 bp和2 454 bp片段，與親株相比均缺失了741 bp片段，〖JP3〗電泳結(jié)果見圖3B泳道3和6.經(jīng)測(cè)序分析，證明SK12確實(shí)為ctcK基因框內(nèi)缺失工程菌.

2.5工程菌SK12的菌落形態(tài)及代謝產(chǎn)物分析

ctcK基因缺失工程菌SK12的基內(nèi)菌絲體為棕紅色，而親株J13為棕黃色.除此之外，工程菌SK12與親株J13的孢子顏色均為棕灰色，且生長周期相同，這與程惠芳所報(bào)道的去甲基金霉素突變株的菌落形態(tài)相符[18].繼續(xù)用傳代方法將SK12傳5代后，其菌落形態(tài)依舊保持穩(wěn)定.將SK12和J13按1.2.5方法進(jìn)行發(fā)酵及代謝產(chǎn)物組分分析，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，結(jié)果如圖4.J13樣品（圖4，c）與金霉素標(biāo)準(zhǔn)品（圖4，a）主峰保留時(shí)間基本相近，分別為31.193 min和32.184 min，因此認(rèn)為31.193 min的峰為金霉素峰.SK12樣品（圖4，d）與去甲基金霉素標(biāo)準(zhǔn)品（圖4，b）主峰保留時(shí)間也基本相近，分別為20.260 min和19.712 min，因此認(rèn)為20.260 min的峰為去甲基金霉素峰.據(jù)此可知，與親株J13（圖4，c）相比，工程菌SK12（圖4，d）不再合成金〖HJ1.75mm〗霉素，而主產(chǎn)去甲基金霉素，說明ctcK基因的缺失阻斷了金霉素的合成，使金霉素合成代謝積累在去甲基金霉素，顯示ctcK基因參與C6位甲基化.

由于金霉素及去甲基金霉素含有氯原子，因此有典型的[A+2]同位素峰，且[A]∶[A+2]≈3∶1.而四環(huán)素不含氯原子，所以沒有[A+2]同位素峰.質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，出發(fā)菌J13代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=481.12 [M+H]+，且兩者豐度比約為3∶1，與理論相符，檢測(cè)結(jié)果見圖5.此外，J13代謝產(chǎn)物中還檢測(cè)到四環(huán)素的準(zhǔn)分子離子峰m/z=445.16 [M+H]+，但未檢測(cè)到去甲基金霉素的離子峰，這可能是由于去甲基金霉素相對(duì)含量較低，因此未能檢測(cè)出來.另外，質(zhì)譜圖中的離子峰m/z=146.08 [M+H]+，m/z=161.09 [M+H]+，m/z=282.28 [M+H]+，m/z=338.34 [M+H]+，m/z=381.08 [M+H]+，m/z=527.16 [M+H]+可能是碎片峰或雜質(zhì)峰，因?yàn)樵诮鹈顾厣锖铣赏緩街芯鶝]有相應(yīng)質(zhì)量數(shù)的中間代謝產(chǎn)物.與親株J13相反，工程菌SK12代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到了去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=467.10 [M+H]+，但未檢測(cè)到金霉素和四環(huán)素的離子峰.質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步說明ctcK基因的缺失阻斷了金霉素的合成，使金霉素合成代謝積累在去甲基金霉素，初步闡明了ctcK基因負(fù)責(zé)參與催化C6位甲基化.此外，SK12代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到m/z=365.10 [M+H]+（6Pretetramid）的離子峰，但未檢測(cè)到m/z=351 [M+H]+（Pretetramid）的離子峰，這可能是因?yàn)閏tcK基因的缺失不能完全阻斷Pretetramid到6Pretetramid 的代謝流.當(dāng)然，也有可能是因?yàn)閙/z=365.10 [M+H]+不是6Pretetramid的離子峰，而是碎片峰或雜質(zhì)峰.

2.6ctcK基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

以金色鏈霉菌J13的基因組DNA為模板，通過K1/K4引物PCR擴(kuò)增KB3片段（4 811 bp），將其克隆到pMD19T載體，得到陽性克隆子，提取其質(zhì)粒，并命名為質(zhì)粒pKB11.質(zhì)粒pKB11和質(zhì)粒pKC1139分別用XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，再經(jīng)回收、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆子，獲得ctcK基因回補(bǔ)同源重組質(zhì)粒pKB12（pKC1139∶∶KB3），其酶切驗(yàn)證見圖6B.將pKB12轉(zhuǎn)入ET12567（pUZ8002），并通過接合轉(zhuǎn)移方法將其導(dǎo)入工程菌SK12中，篩選獲得一株pKB12質(zhì)粒整合到SK12染色體上的重組菌株，命名為金色鏈霉菌SK13.由于該重組菌株存在同源片段，容易發(fā)生二次重組.因此可通過影印篩選獲得ctcK基因回復(fù)突變株SK14（簡稱SK14），PCR電泳檢測(cè)結(jié)果見圖7B.將SK14按照1.2.5中的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并用高效液相色譜對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析.結(jié)果表明，SK14（圖8，b）重新主產(chǎn)金霉素，與親株J13（圖8，a）相比沒有明顯差異，進(jìn)而再次證明ctcK基因是負(fù)責(zé)參與催化C6位甲基化的基因.

3結(jié)論與討論

四環(huán)類抗生素生物合成過程中，C6甲基化酶基因一直是研究熱點(diǎn)，但至今仍未完全闡明.2007年，Zhang等將龜裂鏈霉菌（Streptomyces rimosus）oxyF基因進(jìn)行異源表達(dá)，證實(shí)了OxyF為土霉素C6位甲基化酶，負(fù)責(zé)pretetramid 到6methylpretetramid的生物轉(zhuǎn)化過程，且表明OxyF對(duì)pretetramid底物具有高度特異性[19].本研究在此基礎(chǔ)上，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)ctcK基因與oxyF基因序列同源性高達(dá)74.4%，且經(jīng)生物信息學(xué)分析再次發(fā)現(xiàn)CtcK蛋白中亦存在SAM依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，因此推測(cè)ctcK基因可能參與金霉素C6位甲基化.據(jù)此，本研究利用基因敲除技術(shù)滅活ctcK基因，獲得ctcK基因失活突變菌SK12（ΔctcK）.經(jīng)HPLC及MS分析顯示，工程菌SK12不再合成金霉素，主要積累去甲基金霉素，與出發(fā)菌J13主要積累金霉素明顯不同，說明ctcK基因的失活阻斷了金霉素的生物合成代謝流，使工程菌積累去甲基金霉素，初步闡明了ctcK基因參與C6位甲基化.此外，ctcK基因的缺失并沒有使代謝積累pretetramid，而是繼續(xù)合成去甲基金霉素，這可能是由于后續(xù)的下游修飾酶對(duì)底物的特異性要求不高，使得pretetramid可以進(jìn)行后續(xù)的一系列氧化、鹵化、轉(zhuǎn)氨及氨二甲基化等修飾作用，最終合成去甲基金霉素.

通過基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，將ctcK基因重新導(dǎo)入工程菌SK12（ΔctcK）中，獲得回復(fù)突變株SK14，其代謝產(chǎn)物主要積累金霉素，與出發(fā)菌J13相同.這與Ryan等將ctc09基因（與ctcK基因序列同源性高達(dá)99.4%）克隆至pLP212281表達(dá)載體，并導(dǎo)入產(chǎn)6去甲基四環(huán)素的金色鏈霉菌A377中，得到突變株主產(chǎn)四環(huán)素的研究結(jié)果相符[9].這兩個(gè)研究結(jié)果不僅表明ctcK基因可能是金霉素C6位甲基化酶基因，還顯示CtcK可以催化四環(huán)類抗生素pretetramid到6methylpretetramid的甲基化反應(yīng)，催化途徑如圖9.然而，基因功能的最終確定還須對(duì)該基因進(jìn)行體外表達(dá)等一系列研究工作.

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