祝一鳴，劉 易，王 偉，吳奉奇，王 軍，單體江

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

美花紅千層Callistemon citrinus（Curtis）Skeels是桃金娘科Myrtaceae紅千層屬Callistemon植物[1]。桃金娘科植物約有80多屬3 000多種，主要分布在美洲、大洋洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)[2]。紅千層屬植物由于開花時間長、姿態(tài)優(yōu)美、花型奇特、花色艷麗等被廣泛的應(yīng)用在街道、公園、小區(qū)庭院的綠化中[3]。美花紅千層原產(chǎn)澳大利亞，也被稱為硬枝紅千層，在廣州地區(qū)栽培較多[1]。植物揮發(fā)油，又稱為植物精油，是一種從植物中提取的具有揮發(fā)性并且可以被水蒸汽蒸餾出來的油狀液體，大多為無色或淡黃色，難溶于水，易溶于無水乙醇、乙醚、氯仿、石油醚等[4]。植物揮發(fā)油由于其低毒、高效、易分解等特點(diǎn)，可作為天然殺菌劑、殺蟲劑和抗氧化劑，目前已引起人們越來越多的重視[5-6]。紅千層屬植物枝葉含有豐富的揮發(fā)性成分，其主要成分為1，8-桉葉素和α-蒎烯，具有較好的抗菌、殺蟲、消炎、抗腫瘤等活性，極具研究價值和潛力[7-9]。

美花紅千層枝葉揮發(fā)油成分已有報道[10]，但尚未見果實(shí)揮發(fā)油成分分析及其抗菌活性的報道。本研究采用水蒸汽蒸餾法分別提取美花紅千層葉片和果實(shí)中的揮發(fā)油，通過GC-MS分析鑒定其化學(xué)組成，并通過抑菌圈法測定揮發(fā)油對5種供試細(xì)菌的抑制活性，以期為美花紅千層的推廣種植以及揮發(fā)油資源的綜合開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 美花紅千層葉片和果實(shí)于2014年8月5日采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)濕地公園（標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院鄭明軒老師鑒定，植株于2011年春季種植），葉片和果實(shí)采自同一植株，果實(shí)為成熟果實(shí)，將帶有果實(shí)的枝條剪下后立即放入保鮮袋，帶回實(shí)驗(yàn)室后，分別摘取果實(shí)和果實(shí)前端的所有葉片用于揮發(fā)油的提取。

1.1.2 供試細(xì)菌 供試細(xì)菌為根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens，G-）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，G+）、桉樹青枯病菌（Ralstonia solanacearum，G-）、番茄瘡痂病菌（Xanthomonas vesicatoria，G-）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+）共5種細(xì)菌，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。

1.1.3 儀器與試劑 水蒸汽蒸餾裝置（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；6890N-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（美國安捷倫科技有限公司）；硫酸鏈霉素（美國Sigma公司）；C8-C40系列正構(gòu)烷烴（美國Sigma公司）；氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉、二氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純（北京化學(xué)試劑公司）。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取 參照Lou等[11]方法，稱取美花紅千層葉片700 g和果實(shí)1 000 g，分別裝入5 L水蒸汽蒸餾裝置內(nèi)，加入約2.5 L蒸餾水，待溫度升至100℃后連續(xù)蒸餾6 h，收集蒸出的揮發(fā)油，而后向油水混合物中加入一定量的NaCl（分析純，每毫升揮發(fā)油混合物加2 mg的NaCl），用2倍體積的無水乙醚（分析純）萃取3次，萃取液合并，加入1 g無水硫酸鈉（分析純）進(jìn)行干燥，讓乙醚自然揮發(fā)，揮發(fā)后計算其得率，4℃密封保存在棕色藥品瓶中。

1.2.2 揮發(fā)油化學(xué)組分的GC-MS分析 揮發(fā)油化學(xué)組分鑒定在6890 N-5975C GC-MS上進(jìn)行，色譜柱為DB-5（30 m×250 μm×0.25 μm），無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。升溫程序：起始溫度70℃，保持1 min，接著8℃·min-1上升到120℃，保持1 min，然后30℃·min-1上升到150℃，保持1 min，其次5℃·min-1上升到175℃，保持0 min，1℃·min-1上升到180℃，保持0 min，最后5℃·min-1上升到240℃，保持0 min。離子源溫度230℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，載氣為He，流速1 mL·min-1，全掃描采集，質(zhì)譜檢測器（MSD）檢測。通過NIST（2011）譜庫檢索，與標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時間和質(zhì)譜圖作對比，確定待測成分[12]。

1.2.3 揮發(fā)油抗細(xì)菌活性的測定 采用抑菌圈法測定美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油對不同供試細(xì)菌的抑制活性[13]。病原細(xì)菌由于長期保存在-20℃下，在活性測定前，先用LB平板進(jìn)行活化培養(yǎng)（28℃，暗）48 h，然后挑取單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中搖培（28℃，暗，150 rpm）24 h，將菌液濃度稀釋到108cfu·mL-1，備用。倒好平板后，用移液槍分別吸取50 μL菌液，用玻璃棒涂板。用滅菌的鑷子夾取無菌的濾紙片放在培養(yǎng)皿的中央，然后分別在濾紙片上加入5 μL的揮發(fā)油，在黑暗條件下培養(yǎng)24 h后用尺子量取抑菌圈的大小，陽性對照為5 μL 0.2 mg·mL-1的硫酸鏈霉素，每皿放3個濾紙片，每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分分析

采用水蒸汽蒸餾法提取美花紅千層葉片和果實(shí)中的揮發(fā)油，得率為分別為0.16%和0.48%（鮮重），說明美花紅千層果實(shí)揮發(fā)油的含量遠(yuǎn)高于其葉片。采用峰面積歸一化法計算出各組分的相對百分含量，并對相對百分含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表1。

美花紅千層葉片和果實(shí)總離子流圖如圖1、圖2所示。通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油在化學(xué)組成和相對含量上都存在差異。從美花紅千層葉片中共鑒定出29種化合物，占總相對含量的92.84%，其中相對含量大于10%的成分有2種，分別為桉葉油醇（50.67%）、α-蒎烯（19.27%）；相對含量在2%～10%之間的成分有3種，分別為2-莰烯（7.85%）、D-檸檬烯（3.32%）和p-傘花烴（2.26%），其余成分相對含量均小于2%。從果實(shí)揮發(fā)油中共鑒定出27種化合物，占總相對含量的91.71%，其中主要成分為α-蒎烯（40.91%）、桉葉油醇（38.57%）、檸檬烯（3.99%）和間異丙基甲苯（2.21%），其余成分相對含量均小于2%。從表1可以進(jìn)一步看出美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油中化合物種類都超過了25種，但其共有組分只有7種，分別為桉葉油醇、α-蒎烯、α-水芹烯、葑烯、4-蒈烯、葑醇、（-）-4-萜品醇。且同一種組分在相對含量上差異較大。其中，美花紅千層葉片揮發(fā)油中的桉葉油醇的相對含量為50.67%，明顯高于果實(shí)中的38.57%，而葉片揮發(fā)油中的α-蒎烯相對含量為19.27%，則明顯低于果實(shí)中的40.91%。

2.2 美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性

采用濾紙片擴(kuò)散法測定了美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油對5種供試細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，美花紅千層葉片揮發(fā)油對5種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，其活性明顯強(qiáng)于陽性對照硫酸鏈霉素；其中美花紅千層葉片揮發(fā)油對根癌農(nóng)桿菌的抑制活性最強(qiáng)，其次為溶血葡萄球菌，抑菌圈直徑分別為（34.0±0.5）mm和（33.8±2.8）mm；對枯草芽孢桿菌的抑制活性最弱，抑菌圈直徑為（19.3±1.2）mm，但仍強(qiáng)于陽性對照硫酸鏈霉素（18.0±0.2）mm。果實(shí)揮發(fā)油對5種供試細(xì)菌的抑制活性與葉片的差別不大，抑菌圈直徑范圍在21.0～23.0 mm之間，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為（23.0±1.0）mm，明顯強(qiáng)于葉片揮發(fā)油（19.3±1.2）mm和硫酸鏈霉素（18.0±0.2）mm；果實(shí)揮發(fā)油對其他供試細(xì)菌的抑制活性均弱于葉片揮發(fā)油，對其他供試細(xì)菌的抑制活性與陽性對照差別不大。綜上所述，美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油對5種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，且美花紅千層葉片揮發(fā)油的抑菌活性明顯強(qiáng)于果實(shí)揮發(fā)油。

圖3 美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性Figure 3 Antibacterial activity of the volatile oil from the leaves and fruits of C.citrinus

3 結(jié)論與討論

不同的采集時間、樣品產(chǎn)地、采集部位以及提取和分析的方法等都可能影響揮發(fā)油的組成、相對含量以及得率。本研究采用水蒸氣蒸餾法從美花紅千層葉片揮發(fā)油中鑒定出29種化合物，主要成分為桉葉油醇（50.67%）、α-蒎烯（19.27%）、2-莰烯（7.85%）和D-檸檬烯（3.32%）；而李冬妹等[10]采用同樣的方法從美花紅千層葉片中鑒定出21種化合物，主要成分為桉葉油醇（40.36%）、α-蒎烯（33.18%）、α-松油醇（7.37%）和檸檬烯（3.57%），雖然化合物的數(shù)量和相對含量差別較大，但主要成分的種類差別不大，可能與樣品采集的時間、生長環(huán)境以及GC-MS分析條件有關(guān)。目前尚未見關(guān)于美花紅千層果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)組成成分的報道。美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油雖然在化合物的種類以及相對含量上存在差異，但含量較高的成分均為桉葉油醇和α-蒎烯，符合紅千層屬植物揮發(fā)油的特性，與其他人的研究結(jié)果一致[10，14-17]。而美花紅千層果實(shí)揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對含量是否會隨著果實(shí)成熟度的變化而變化還有待于進(jìn)一步的研究。

植物揮發(fā)油具有廣譜的抗菌活性，其成分主要是一些萜烯烴、芳香族化合物以及脂肪族化合物（主要為脂肪族醛和醇）[18]。植物揮發(fā)油抗菌活性的強(qiáng)弱與其化學(xué)組分密切相關(guān)，不同的植物揮發(fā)油化學(xué)成分不同，其抗菌活性也存在差異，植物揮發(fā)油組分抗微生物活性大小排序如下，酚類（活性最高）＞肉桂醛＞醇類＞醛類=酮類＞酯類＞碳?xì)浠衔镱怺19]。本研究的結(jié)果表明美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油對5種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，且美花紅千層葉片揮發(fā)油的抑菌活性明顯強(qiáng)于陽性對照和果實(shí)揮發(fā)油。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油對5種供試細(xì)菌的抑制活性明顯強(qiáng)于池衫葉片和球果的揮發(fā)油[13]，體現(xiàn)出美花紅千層揮發(fā)油在生物農(nóng)藥、醫(yī)藥以及園林綠化等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。美花紅千層葉片揮發(fā)油中桉葉油醇的含量高達(dá)50.67%，其較強(qiáng)的抑菌活性與桉葉油醇是否具有一定聯(lián)系，還有待進(jìn)一步的研究。桉葉油醇已廣泛用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域[20]。α-蒎烯有明顯鎮(zhèn)咳和祛痰功能，并有抗真菌（如白念珠菌）、驅(qū)蟲、殺蟲和除螨的作用[21]。此外，α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯等萜烯類化合物可增強(qiáng)空氣的清新感，同時可以調(diào)節(jié)人體的神經(jīng)系統(tǒng)，對人體具有保健作用[18，22-23]。美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油對桉樹青枯病菌的抑制活性明顯強(qiáng)于陽性對照硫酸鏈霉素，在營林和園林綠化時可以考慮美花紅千層與桉樹林混交或是作為桉樹林的隔離帶，以降低桉樹青枯病的大面積發(fā)生和危害。

綜上所述，美花紅千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油在化學(xué)組成和相對含量上有明顯區(qū)別，葉片揮發(fā)油的抑菌活性明顯強(qiáng)于果實(shí)揮發(fā)油，在今后的研究中還需進(jìn)一步明確化學(xué)組成、相對含量與抗菌活性的關(guān)系；在城市綠化中可以利用美花紅千層花色艷麗、樹形美觀、揮發(fā)性產(chǎn)物具有抗菌保健等功效的特點(diǎn)，合理配植，以構(gòu)建保健型生態(tài)園林城市。

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