程俊文，賀 亮，魏海龍，宋吉玲，胡傳久，鄒景泉，李海波，蔣云鶴

（1.浙江省林業(yè)科學研究院 浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.杭州市農業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024）

桑黃，中藥名，為桑黃纖孔菌Inonotus sanghuang的子實體，屬擔子菌亞門Basidiomycotina[1]銹革孔菌科Hymenochaetaceae纖孔菌屬Inonotus，是中國傳統(tǒng)的名貴藥材。桑黃最早記載于《本草綱目》，具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、增強免疫等藥理活性[2-4]。桑黃子實體中富含多糖、黃酮等多種活性成分。黃酮天然存在于植物中的多酚類化合物，大量研究表明黃酮類物質可以有效清除人體內的各種氧自由基，減少身體各組分的器官損傷和病變，從而延緩衰老。桑黃是少有的富含黃酮類化合物的藥用真菌，是天然、高效的抗衰老制品的重要來源。目前對桑黃的研究較多集中在深層發(fā)酵條件優(yōu)化、多糖分子結構、生物活性等方面，而對桑黃黃酮的研究較少[5]。

黃酮類化合物提取主要有溶劑提取法、大孔吸附樹脂法、微波輔助提取法、超界流體提取法等[6-7]。本試驗通過超聲波輔助提取，利用響應面法分析對桑黃子實體中黃酮提取工藝進行優(yōu)化，以期為桑黃中黃酮類功能成分的分析和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

菌種為桑黃纖孔菌，2015年5月采自浙江省淳安縣，采用液氮法保存；菌種活性后轉接到PDA試管中，菌絲長滿后在4℃冰箱保存。桑黃子實體由浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室人工培育，于2016年7月采收；蘆丁標準品由中國藥品生物制品鑒定所提供；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為國產分析醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

20B型中藥粉碎機，南京邦斯特制藥設備有限公司，JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海?，攲嶒炘O備有限公司；UV-2600紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黃總黃酮的提取 取干燥的桑黃子實體，用20B型中藥粉碎機粉碎成40目，稱取桑黃子實體粉2.00 g，放入250 mL的燒杯中，加入1 mL70%乙醇溶液碾磨成漿，分別加入60%，70%和80%體積分數(shù)的乙醇溶液，并調節(jié)料液比，置于超聲萃取儀內，設定超聲溫度分別為50，60，70℃，水浴時間分別為30，45，60 min，期間進行超聲波（功率120 W）輔助提取，將提取液減壓抽濾，收集濾液，所得濾渣再次用前法提取，合并2次濾液，定容至100 mL，搖勻后測定黃酮的含量。

1.3.2 響應面法分析實驗 選擇乙醇體積分數(shù)、提取溫度、超聲時間3個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面設計，利用Design Expert 8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以－1，0，1進行編碼，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.4 分析方法

1.4.1 桑黃總黃酮含量的測定 以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al（NO3）3比比色法[8]。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 用Design Expert 8.05進行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結果與分析

2.1 響應面分析試驗結果

2.1.1 響應面分析方案及結果 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計3因素3水平的響應面分析試驗，共有17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗用以估計試驗誤差。以總黃酮得率為響應值，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及試驗結果Table 2 Design and results by RSM

2.1.2 回歸模型建立及方差分析 利用Design Expert 8.05軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行分析[9]，獲得總黃酮得率對乙醇體積分數(shù)、超聲時間和超聲溫度的多元二次回歸方程：

Y＝2.54＋0.20 X1＋0.08X2－0.36 X3－0.063 X1X2＋0.27 X1X3－0.25 X2X3－0.3 X1X1－0.52 X2X2－0.39X3X3

由表3可知，以總黃酮得率為目標函數(shù)的回歸方程的回歸效果達到極顯著水平，P值均＜0.000 1；模型的決定系數(shù)R2=0.975 2，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2=0.943 2，說明該模型能解釋97.52%響應值的變化；模型的失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，表3中模型失擬項的P值為0.164 3，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據(jù)表3的顯著性分析結果，各因素的二次項，X3，X1，X1X3，X2X3的交互項對總黃酮得率的影響均為極顯著（P＜0.01）。分析表明這個模型建立的回歸方程能運用于超聲波輔助提取桑黃子實體中總黃酮提取條件優(yōu)化的理論預測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of regression model

2.1.3 響應面圖形分析 分別將模型中的乙醇體積分數(shù)、超聲時間及超聲溫度的其中1個因素固定在0水平，得到另外2個因素的交互影響結果，二次回歸方程的響應面及其等高線如圖1，圖2，圖3所示，各個因素及其交互作用對響應值的影響結果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響桑黃子實體總黃酮提取得率的最顯著的因素為超聲溫度（X3），其次是乙醇體積分數(shù)（X1），表現(xiàn)為響應面變化弧度較大。超聲時間（X2）響應面弧度變化平緩，說明對響應值影響相對較小。此外，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[10]。從圖1至圖3可以看出，X1與X3，X2與X3交互作用顯著。

圖1 乙醇體積分數(shù)和超聲時間交互影響總黃酮得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 1 Surface diagram and contour of flavonoid yield under interaction ofethanol concentration andultrasonic time

圖2 乙醇體積分數(shù)和超聲溫度交互影響總黃酮得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 2 Surface diagram and contour of flavonoid yield under interaction ofethanol concentration andtemperature

圖3 超聲時間和超聲溫度交互影響總黃酮得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 3 Surface diagram and contour of flavonoid yield under interaction ofultrasonic timeand temperature

2.1.4 驗證實驗 根據(jù)Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.05軟件分析，得到最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)70.9%，超聲時間47.8 min，超聲溫度55.2℃，總黃酮得率理論值可達2.63%。

為檢驗模型預測值與實際實驗值之間的相關性，即檢驗響應面優(yōu)化模型的可靠性，對桑黃子實體中總黃酮提取得率進行實驗驗證。實驗中乙醇體積分數(shù)、超聲時間和超聲溫度的優(yōu)化值分別為70.9%，47.8 min，55.2℃，三組平行實驗，測得總黃酮得率分別為2.49%，2.53%，2.50%，實際總黃酮得率平均值為2.51%，達到了回歸模型預測理論值的95.4%，實驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預測桑黃子實體總黃酮得率。

3 結論

本實驗對超聲波輔助提取桑黃子實體總黃酮條件行了優(yōu)化，結合生產實踐，選擇乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲溫度為3個主要參數(shù)，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設計及3因素3水平的響應面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預測了桑黃子實體總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)70.9%，超聲時間47.8 min，超聲溫度55.2℃，總黃酮得率理論值可達2.63%。驗證實驗中總黃酮得率平均為2.51%，與陳曉平[11]等報道的響應面法優(yōu)化微波輔助乙醇提取桑黃黃酮工藝的研究中的總黃酮得率較為接近。采用微波輔助乙醇提取及與本實驗超聲波輔助乙醇提取不同桑黃材料中的黃酮，對黃酮生物活性的影響有待進一步研究。

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