韋瓊，陳錦飛

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210006；2.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

·綜 述·

沙門菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進展

韋瓊1,2，陳錦飛1

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210006；2.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

活細(xì)菌載體在腫瘤治療方面的應(yīng)用是當(dāng)前研究的熱點，其可作為化療藥物的增敏劑、抗腫瘤藥物的投遞結(jié)構(gòu)及基因治療的載體等。沙門菌本身作為兼性厭氧菌可以選擇性地定植在乏氧的實體瘤內(nèi)部，在體內(nèi)引發(fā)高效的細(xì)胞、體液及黏膜免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。同時具有腫瘤靶向性的沙門菌經(jīng)過進一步改造后成為在實體瘤內(nèi)產(chǎn)生和輸送治療性藥物的重要工具。目前減毒沙門菌可通過不同的途徑如細(xì)菌轉(zhuǎn)染、DNA疫苗、細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白及RNAi轉(zhuǎn)運等應(yīng)用于腫瘤治療。作者對沙門菌作為抗腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進展作一綜述。

沙門菌；腫瘤治療；細(xì)菌轉(zhuǎn)染；DNA疫苗；文獻綜述

目前化療、放療仍然是惡性腫瘤治療的主要方法，但存在不能有效地靶向腫瘤組織、副作用大和臨床療效差等缺點。雖然有關(guān)腫瘤發(fā)生演變的分子機制研究取得了相當(dāng)大的進步，新的治療方法也在不斷地發(fā)展，但目前絕大多數(shù)惡性腫瘤的治療效果仍不盡如人意。

19世紀(jì)人們首次觀察到腫瘤患者細(xì)菌感染后腫瘤生長速度減緩的現(xiàn)象，部分腫瘤患者發(fā)生氣性壞疽后，體內(nèi)的腫瘤被抑制甚至消退。這一現(xiàn)象啟發(fā)了人們將細(xì)菌應(yīng)用于腫瘤治療的研究思路。沙門菌屬于侵襲性胞內(nèi)菌，通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)它與宿主之間的反應(yīng)，這種機制使細(xì)菌的毒力因子能直接轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞內(nèi)[1]。沙門菌具有向宿主細(xì)胞投遞多種效應(yīng)基因及治療性蛋白等特性，為將其用作腫瘤藥物投遞系統(tǒng)提供了可能。近年來迅速發(fā)展的基因工程技術(shù)能將沙門菌的致病基因敲除后得到減毒菌株，目前研究較為透徹的減毒菌株如下：(1)VNP20009，源于沙門菌ATCC14028，為msbB和purl基因缺陷菌株[2]；(2)A1-R，由沙門菌ATCC14028改造的另一減毒菌株，為雙重營養(yǎng)缺陷菌株，依賴外源性精氨酸和亮氨酸生存[3]；(3)CRC2631，由野生型沙門菌LT2改造的營養(yǎng)缺陷型菌株，可在室溫條件下存活于瓊脂糖培養(yǎng)基中，同時可產(chǎn)生顯著的遺傳多樣性如基因缺失、復(fù)制及移碼等[4]。目前用于投遞的腫瘤藥物主要有治療性的DNA、RNA及蛋白質(zhì)等。作者就減毒沙門菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進展作一綜述。

1 沙門菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究

將具有治療作用的DNA、RNA或蛋白質(zhì)直接投遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)腫瘤治療，在腫瘤實驗與臨床治療研究中具有重要意義。其中選擇合適的載體一直是腫瘤藥物投遞系統(tǒng)研究的重點。目前大多數(shù)研究著重于有著高轉(zhuǎn)染效率的病毒載體(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)[5]。然而病毒載體存在著安全性低、花費高、生物活性低、DNA負(fù)荷量少及誘發(fā)免疫原性和細(xì)胞毒性困難等問題。因此，應(yīng)運而生許多新的投遞載體，其中包括細(xì)菌載體[6]。20世紀(jì)90年代，人們利用細(xì)菌作為載體成功地將真核表達(dá)質(zhì)粒投遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽胞桿菌、減毒單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌、志賀菌、耶爾森菌、侵襲型大腸桿菌均可用作腫瘤藥物投遞系統(tǒng)。

沙門菌是一類胞內(nèi)侵襲性革蘭陰性兼性厭氧菌，在有氧及乏氧環(huán)境中均可生存，其本身也是一種天然的免疫佐劑，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎性因子來增強機體的先天保護性免疫反應(yīng)。而在細(xì)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，沙門菌有以下幾個潛在的優(yōu)勢：(1)可以靶向多種腫瘤組織；(2)可在乏氧的腫瘤內(nèi)部生存，而在正常組織中少；(3)可以表達(dá)自殺基因如單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes-simplex virus thymidine kinase gene，HSVtk)。野生型沙門菌不能直接用于腫瘤治療目的。小鼠黑色素瘤模型中，荷瘤小鼠在注射治療劑量的野生型沙門菌后盡管發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在腫瘤組織內(nèi)富集，但最終因毒性大導(dǎo)致小鼠死亡。此外，單純使用具有高侵襲性的減毒沙門菌突變株雖然仍具有腫瘤靶向性，但免疫原性大大降低，從而極大地削弱了其腫瘤殺傷作用。而將包含HSK-tk基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至減毒沙門菌后接種荷瘤小鼠，同時給予抗病毒藥物更昔洛韋治療，結(jié)果顯示，沙門菌抑制腫瘤生長和延長小鼠生存期的效果與更昔洛韋的劑量有相關(guān)性[7]。這些結(jié)果證實，沙門菌除了本身的抑瘤作用之外，其還作為抗腫瘤物質(zhì)的投遞系統(tǒng)。

2 減毒沙門菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 腫瘤蛋白表達(dá)放大治療(tumor amplified protein expression therapy，TAPET)

TAPET最早由Vion Pharmaceutical公司提出[8]，即利用減毒沙門菌菌株作為細(xì)菌載體或運載工具將抗腫瘤藥物投遞至實體瘤內(nèi)。經(jīng)證實，減毒沙門菌可富集在腫瘤組織內(nèi)，其濃度至少為正常組織內(nèi)的200倍，甚至可達(dá)1000倍[9]。同時基礎(chǔ)毒理學(xué)研究表明，減毒沙門菌具有良好的安全性，其無法改變感染細(xì)胞基因組，且對普通抗生素十分敏感。利用基因工程技術(shù)改造后的沙門菌可在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)多種抗腫瘤蛋白、基因及基因表達(dá)產(chǎn)物。TAPET另一個重要的特性是減毒沙門菌定植在腫瘤組織內(nèi)，依賴腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA或者蛋白質(zhì)生存。這一特性可使得沙門菌逃避機體免疫監(jiān)測，增強TAPET抑制腫瘤生長的能力，同時又保證其僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)持續(xù)投遞抗腫瘤藥物。

美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)進行的Ⅰ期臨床試驗證實，進展期腫瘤患者可以通過靜脈注射TAPET獲益。同時進一步研究表明，TAPET與放療聯(lián)合使用可以增強療效。在多種小鼠腫瘤模型中聯(lián)合使用VNP20009和其他腫瘤治療方法正是時下研究的熱點。

2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)染

細(xì)菌轉(zhuǎn)染是一種利用細(xì)菌直接將基因傳遞至靶生物、靶器官或靶組織內(nèi)的方法[10]。在腫瘤治療中，構(gòu)建受真核啟動子調(diào)控并且編碼治療基因的質(zhì)粒，利用細(xì)菌將其傳遞至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)菌感染細(xì)胞，該質(zhì)粒被釋放至細(xì)胞質(zhì)中，后轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核隨宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進行表達(dá)。

以沙門菌作為真核表達(dá)質(zhì)粒的載體進行腫瘤免疫治療已經(jīng)得到廣泛的研究，即由沙門菌介導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移抗腫瘤質(zhì)粒[11]。在一項研究中，經(jīng)過基因工程改造后的沙門菌攜帶有編碼人內(nèi)皮抑制素基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。通過沙門菌將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞后，人內(nèi)皮素的表達(dá)特異性地抑制了腫瘤組織侵襲，同時觀察到腫瘤微血管密度降低導(dǎo)致腫瘤生長抑制[12]。相同的方法可以將多種細(xì)胞因子如IL-12、GM-CSF、IL-4 及IL-18等轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，均產(chǎn)生不同程度的抑瘤作用。此外，口服包含編碼CD40配體基因的鼠傷寒沙門菌對B細(xì)胞淋巴瘤有著顯著的治療效果。除了轉(zhuǎn)染特定的抗腫瘤質(zhì)粒外，細(xì)菌轉(zhuǎn)染的方法可通過近似自然感染的黏膜途徑進行免疫，同時沙門菌本身具有多種病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，是天然免疫佐劑，容易誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的固有免疫應(yīng)答。該方法兼?zhèn)漯つっ庖吆虳NA疫苗的雙重優(yōu)點。

2.3 DNA疫苗

DNA疫苗指的是基因疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[13]。

目前，多數(shù)DNA疫苗的抗腫瘤研究是利用減毒鼠傷寒沙門菌作為載體的[14]。在動物惡性黑色素瘤、腸癌、腦膠質(zhì)瘤及肺癌模型中，口服含抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGFR-2)的沙門菌DNA疫苗，可以有效地抑制腫瘤生長。類似的抗腫瘤效應(yīng)同樣產(chǎn)生于含細(xì)胞因子IL-18、凋亡抑制素等DNA疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)DNA疫苗通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性的CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[15]。因此，從腫瘤抗原中篩選出主要的T細(xì)胞抗原表位將是接下來DNA疫苗研發(fā)的重點。

2.4 細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運

細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運即利用轉(zhuǎn)基因細(xì)菌向宿主轉(zhuǎn)運治療性蛋白，是細(xì)菌在腫瘤治療應(yīng)用中的新進展。與細(xì)菌轉(zhuǎn)染和DNA疫苗方法不同，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運最大的優(yōu)勢在于細(xì)菌可以在靶組織內(nèi)持續(xù)存在，并且在原位不斷地產(chǎn)生治療性多肽。因此，在理想情況下，我們可以利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的方法使某種抗腫瘤藥物持續(xù)作用于腫瘤組織。

基因介導(dǎo)酶前體藥物治療(gene directed enzyme prodrug therapy，GDEPT)就是利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運進行抗腫瘤治療的重要手段[16]。GDEPT即向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)運酶基因，可激活特異性前體藥物成為細(xì)胞毒性產(chǎn)物從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用。GDEPT治療腫瘤主要分為兩個步驟：(1)外源性酶基因的投遞和在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶向性表達(dá)；(2)前體藥物的投遞，其可被轉(zhuǎn)運至腫瘤細(xì)胞內(nèi)的外源性基因編碼的酶激活為細(xì)胞毒性藥物。兩類與細(xì)菌相關(guān)的前藥分別為可被細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶活化的5-氟胞嘧啶和可被硝基還原酶激活的CB-1954。

在多項前期臨床模型中，減毒鼠傷寒沙門菌已經(jīng)成功地應(yīng)用于GDEPT，其中部分研究已經(jīng)進入臨床試驗階段。Ⅰ期臨床試驗中[17]，減毒鼠傷寒沙門菌成功地將胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)運至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。這些研究證實，一定劑量的減毒鼠傷寒沙門菌可以安全地定植在腫瘤組織內(nèi)，但在臨床應(yīng)用中傳遞的蛋白似乎缺乏足夠的有效性。因此，蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌表達(dá)治療性蛋白的能力成為GDEPT的關(guān)鍵部分。目前，在鼠傷寒沙門菌中成功地構(gòu)建了阿拉伯糖誘導(dǎo)的細(xì)菌啟動子系統(tǒng)。該菌株通過靜脈注射可選擇性地富集在腫瘤組織內(nèi)，但僅有同時向靶細(xì)胞投遞阿拉伯糖才能誘導(dǎo)酶基因的表達(dá)。此外，利用細(xì)菌攜帶誘導(dǎo)性的自殺基因可以進一步提高治療性基因的外源性調(diào)控。

2.5 細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)運

細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)運是一種新型的抗腫瘤療法，其聯(lián)合了兩種獨立的治療方法即細(xì)菌療法和RNAi[18]。RNAi是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達(dá)的機制。細(xì)菌作為通用的基因投遞載體已被證實可將RNAi成功地轉(zhuǎn)運至哺乳動物細(xì)胞內(nèi)[19]。目前，構(gòu)建包含編碼抗STATA3、MDR1以及凋亡抑制蛋白Bcl-2 shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別在小鼠前列腺癌、舌癌及黑色素瘤模型中，利用鼠傷寒沙門菌將其投遞至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，均產(chǎn)生不同程度的抗腫瘤效果[20]。細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)運為腫瘤的治療提供了新思路，其應(yīng)用需要進行更多的研究。

3 小 結(jié)

利用細(xì)菌作為抗腫瘤藥物投遞系統(tǒng)，將具有治療作用的基因、蛋白或RNA投遞至腫瘤細(xì)胞內(nèi)是新的腫瘤治療途徑。減毒沙門菌作為良好的腫瘤藥物投遞系統(tǒng)已經(jīng)在動物實驗及臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗中取得了較好的效果。但目前細(xì)菌的抗腫瘤治療尚處于摸索階段，許多在動物實驗中觀察到的結(jié)果無法在人體上復(fù)制，其臨床應(yīng)用還存在諸多問題，如沙門菌如何高效地轉(zhuǎn)移至人腫瘤組織內(nèi)部和進入靜止期腫瘤細(xì)胞、如何有效地減輕人體對重組載體的免疫作用，以及如何有效地與其他治療方法聯(lián)合使用等，而這些問題正是接下來需要探究的重點。

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2016-07-24

2016-08-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(81272469)

韋瓊(1992-)，女，安徽蕪湖人，在讀碩士研究生。E-mail:1534602112@qq.com

陳錦飛 E-mail:chenjinfei2016@163.com

韋瓊，陳錦飛.沙門菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進展[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2017，36(1)：113-116.

R34

A

1671-6264(2017)01-0113-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.029