王銳+熊汝琴

摘 要： 通過(guò)正交試驗(yàn)研究天麻多糖的水提條件，并采用蒽酮-硫酸法對(duì)4種天麻變型（紅天麻、烏天麻、黃天麻、綠天麻）多糖含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：水提最佳條件為浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間3 h，料水比1∶30；含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在相同產(chǎn)地、不同天麻變型中的多糖含量不同，其中紅天麻的多糖含量顯著高于其他3種天麻變型，而在不同產(chǎn)地、同一天麻變型中，云南昭通紅天麻的多糖含量遠(yuǎn)高于陜西寧強(qiáng)和湖北宜昌的紅天麻，這說(shuō)明昭通紅天麻具有優(yōu)良的內(nèi)在品質(zhì)。蒽酮-硫酸法為科學(xué)評(píng)價(jià)天麻質(zhì)量提供了簡(jiǎn)便快捷、穩(wěn)定可行的方法，為昭通天麻資源的開(kāi)發(fā)利用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：天麻；4種變型； 多糖； 正交試驗(yàn)；蒽酮-硫酸法

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.02.003

Abstract： The paper studied the water extraction conditions of polysaccharide of Gastrodia elata Bl. by orthogonal experiment， and determination the content of polysaccharide in four forma of Gastrodia elata Bl. （G. elata Bl. f. elata Bl.， G. elata Bl. f. glauca S. Chow， G. elata Bl. f. flavida S. Chow， G. elata Bl. f. viridis Mak） by the method of anthrone-sulfuric. The results showed that the water extraction optimum conditions were extraction temperature 80 ℃， extraction time 3 h， and the ratio of material to water 1∶30. In the same region， the polysaccharide content in different forma of Gastrodia elata Bl. was different. Among them， the content of G. elata Bl. f. elata Bl. was significantly higher than the other three forma. In different regions， the same forma， the polysaccharide content of G. elata Bl. f. elata Bl. from Zhaotong， Yunnan was much higher than Ningqiang ，Shanxi and Yichang， Hubei. It showed that G. elata Bl. f. elata Bl. from Zhaotong had excellent internal quality. The method of anthrone-sulfuric provides a simple， quick， stable， viable method to scientific evaluation of the quality of Gastrodia elata Bl.，and also offers experimental basis for the development and utilization of Gastrodia elata Bl. from Zhaotong.

Key words： Gastrodia elata Bl.； four forma； polysaccharide； orthogonal experiment； the method of anthrone-sulfuric

天麻（Gastrodia elata Bl.）為蘭科（Orchidaceae）天麻屬（Gastrodia）多年生食菌植物，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、陜西、湖北等地，其地下塊莖被歷代本草列為上品，在我國(guó)已有兩千多年的應(yīng)用歷史，具有平肝息風(fēng)止痙的功效，主治頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、破傷風(fēng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)天麻的化學(xué)成分及藥理作用已進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。其中天麻素（對(duì)羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）是天麻的主要有效成分，其藥理作用與天麻的藥理作用呈正相關(guān)，所以多年來(lái)把它作為天麻質(zhì)量?jī)?yōu)劣的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[1-3]。近年，有研究發(fā)現(xiàn)天麻多糖具有清除自由基、降血壓、抗眩暈、免疫調(diào)節(jié)、抑菌和抑制腫瘤等多種作用[4-5]。植物多糖具有多種生物活性，且毒副作用小，安全性強(qiáng)，常被作為藥材質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)[6]。

昭通地處云南省東北部，因其得天獨(dú)厚的地理、氣候環(huán)境所產(chǎn)的天麻享譽(yù)國(guó)內(nèi)外，為我國(guó)公認(rèn)的天麻地道產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量約占全國(guó)1/4，擁有紅天麻（G. elata Bl. f. elata Bl.）、烏天麻（G. elata Bl. f. glauca S. Chow）、黃天麻（G. elata Bl. f. flavida S. Chow）、綠天麻（G. elata Bl. f. viridis Mak）4種天麻變型。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)篩選天麻多糖的最佳提取條件，并通過(guò)蒽酮-硫酸法測(cè)定分析4種天麻變型多糖含量，為天麻不同類(lèi)型的質(zhì)量作出科學(xué)評(píng)價(jià)，進(jìn)一步建全、完善天麻的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為昭通天麻資源的全面開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用4種天麻變型即紅天麻、烏天麻、綠天麻、黃天麻，主產(chǎn)于云南昭通，另有兩種為分別產(chǎn)自湖北宜昌和陜西寧強(qiáng)的外省紅天麻。上述樣品均由昭通市天麻研究所提供鑒定。

蒽酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡萄糖、石油醚（60～90 ℃）、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸等，以上均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為去離子水（ 18.2 MΩ）。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；UV/VIS2802PCS紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；SK5200LHC超聲波洗滌器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；HH-S601型超級(jí)恒溫水浴鍋（金壇市岸頭良友實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司）等。

1.3 方 法

1.3.1 樣品的預(yù)處理 分別將4種天麻變型干燥塊莖粉碎，過(guò)孔徑0.19 mm的篩，各精確稱(chēng)取2 g天麻粉末置于具塞錐形瓶中，加入30倍體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，超聲（53 kHz，250 W）浸提，除去天麻中的脂類(lèi)、色素、單糖等成分至提取液無(wú)色，抽濾、晾干回收天麻粉末。

1.3.2 天麻多糖水提條件的優(yōu)化 參考文獻(xiàn)[7-8]，確定浸提溫度（A）、料水比（B）、浸提時(shí)間（C）為影響因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平（表1），以預(yù)處理后的烏天麻做正交試驗(yàn)提取天麻多糖。將所提物于70 ℃烘干，得天麻粗多糖，稱(chēng)重計(jì)算得率，確定天麻多糖的最佳水提條件。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 采用蒽酮-硫酸比色法，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[9-10]。精確稱(chēng)取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品9.6 mg，加水溶解，定容至100 mL，得到0.096 0 mg·mL-1對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確量取對(duì)照品溶液0.0，0.2，0.4， 0.6，0.8，1.0，1.2 mL，并補(bǔ)充去離子水至溶液體積為2.0 mL，充分搖勻。浸入冰水浴中，分別加入2.016 0 mg·mL-1濃硫酸配制的蒽酮顯色劑6.0 mL，搖勻，放入沸水浴，反應(yīng)15 min后取出，冷卻至室溫。以第一份未加對(duì)照品的空白溶液作參比，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.4 樣品中多糖含量的測(cè)定 將最佳水提條件提取的天麻粗多糖用Sevag試劑（體積比1∶4氯仿正丁醇混合液）除去蛋白，然后加入無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，充分?jǐn)嚢瑁湃氡潇o置過(guò)夜沉淀。沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇洗滌，加水稀釋作供試樣品溶液。精確量取供試樣品溶液0.5 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立方法測(cè)定吸光度值，通過(guò)以下公式計(jì)算樣品中多糖含量。

多糖含量=CVD/W×100%

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算出的多糖質(zhì)量濃度（mg·L-1）；V為測(cè)定時(shí)反應(yīng)體系總體積（mL）；D為稀釋倍數(shù)；W為天麻樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻多糖的最佳水提取條件

從表1中的R值（A>C>B）可看出，浸提溫度對(duì)得率的影響最大，其次是浸提時(shí)間，料水比的影響最小。通過(guò)正交試驗(yàn)得出最優(yōu)水平組合為A2B2C3，即天麻多糖的最佳水提條件為浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間3 h，料水比1∶30，提取天麻多糖得率最高。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程

以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一元線(xiàn)性回歸，得回歸方程A = 0.032 45C + 0.028 81，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r = 0.999 5。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在2.4 ～14.4 mg·L-1時(shí)，濃度與吸光度值線(xiàn)性關(guān)系良好，該方程可用于天麻多糖的含量測(cè)定。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確量取烏天麻多糖供試樣品溶液0.5 mL，以“1.3.3節(jié)”試驗(yàn)條件操作，每隔30 min測(cè)1次吸光度值，結(jié)果RSD = 1.78%（n=5），表明溶液顯色后在2.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 精密度試驗(yàn)

取試驗(yàn)制備烏天麻多糖供試樣品溶液0.5 mL，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作試驗(yàn)方法下連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得供試樣品吸光度值的RSD = 1.04%（n=5），表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取5 份同批烏天麻粉末0.1 g，按最佳水提條件提取多糖，并將其溶解定容至100 mL。平行量取5份多糖溶液0.5 mL，按前測(cè)試方法分別測(cè)定吸光度值，結(jié)果RSD = 2.01%（n=5），表明該試驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取5 份供試烏天麻多糖溶液0.5 mL，分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL葡萄糖對(duì)照品溶液，補(bǔ)充去離子水至2.0 mL，按“1.3.3”試驗(yàn)條件操作測(cè)試，計(jì)算回收率（表2），得平均回收率為97.73%，RSD為2.06%。結(jié)果表明，該試驗(yàn)方法回收率較高，能夠準(zhǔn)確測(cè)定天麻多糖含量。

2.7 天麻多糖含量

分別取試驗(yàn)制備的烏天麻、黃天麻、綠天麻、紅天麻的多糖供試樣品溶液，加入蒽酮試劑顯色反應(yīng)后測(cè)定吸光度值，并計(jì)算樣品中天麻多糖含量。表3表明，同一產(chǎn)地，不同天麻變型多糖含量不同。昭通產(chǎn)的4種天麻變型中，紅天麻的多糖含量遠(yuǎn)高于烏天麻、黃天麻和綠天麻的多糖含量。同一天麻變型，不同產(chǎn)地的天麻多糖含量亦不同。云南昭通的紅天麻多糖含量顯著高于陜西寧強(qiáng)與湖北宜昌所產(chǎn)的紅天麻。試驗(yàn)說(shuō)明，天麻中多糖含量與天麻類(lèi)型及產(chǎn)地因素有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

（1） 天麻多糖提取的方法各不相同，本試驗(yàn)在確定影響天麻多糖提取的單因素：溫度、料水比、時(shí)間的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)得出最優(yōu)水平組合為A2B2C3。多糖含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，操作便捷，可以作為天麻多糖含量的測(cè)定方法。

（2） 通過(guò)多糖含量測(cè)試發(fā)現(xiàn)，同一天麻變型，昭通所產(chǎn)的紅天麻多糖含量最高，約是陜西寧強(qiáng)和湖北宜昌的5倍。綜合王韜等[11]對(duì)不同省份烏天麻多糖含量測(cè)定的數(shù)據(jù)，昭通烏天麻多糖平均含量為13.97%，貴州為9.18%，廣西為10.6%，河南為13.0%。這表明，昭通所產(chǎn)天麻的多糖含量普遍高于其他地區(qū)。由此，進(jìn)一步說(shuō)明了昭通之所以是全國(guó)天麻的主要產(chǎn)地，與其天麻多糖含量高有一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

（3） 對(duì)云南昭通4種天麻變型的多糖含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，相同產(chǎn)地，不同變型多糖含量不同。紅天麻多糖含量顯著高于烏天麻、黃天麻和綠天麻。結(jié)合李德勛等[12]對(duì)昭通4種天麻變型天麻素含量測(cè)定結(jié)果，紅天麻中天麻素含量較高，為1.519%，僅低于綠天麻，而高于烏天麻和黃天麻。這表明，紅天麻含有較高的天麻素和天麻多糖，具有較高的內(nèi)在品質(zhì)，藥用價(jià)值高。

（4）紅天麻是馴化后的優(yōu)良高產(chǎn)品種，生長(zhǎng)快，適應(yīng)廣，分生力強(qiáng)，但形態(tài)較烏天麻差。目前，此變型在我國(guó)栽培面積廣。烏天麻形態(tài)好，社會(huì)聲譽(yù)高，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)，分生力差，云南昭通是其主產(chǎn)地[13]。為了提高昭通天麻產(chǎn)量，加強(qiáng)天麻品質(zhì)，應(yīng)進(jìn)一步研究天麻的有性繁殖，對(duì)紅天麻與烏天麻兩個(gè)優(yōu)良品種進(jìn)行雜交，以培育出具有較高藥效，又有優(yōu)良外形的天麻品種。同時(shí)，從天麻多糖、天麻素等指標(biāo)出發(fā)建立完善天麻質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，促進(jìn)昭通天麻產(chǎn)業(yè)全面科學(xué)的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2005年版一部） [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：44.

[2]楊世林，蘭進(jìn)，徐錦堂.天麻的研究進(jìn)展[J].中草藥， 2000，31（1）：66-69.

[3]范玉奇，李文蘭，王艷萍，等.天麻化學(xué)成分及藥理性質(zhì)研究的進(jìn)展[J].藥品評(píng)價(jià)，2005，2（4）：309-312.

[4]陳維紅，羅棟.天麻素、天麻多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物評(píng)價(jià)，2013，30（3）：132-134， 141.

[5]劉現(xiàn)輝，郭曉娜，展俊平，等.天麻多糖對(duì)H22荷瘤小鼠細(xì)胞周期及caspase蛋白活性的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2015，35（20）：5681-5682.

[6]張曉靜，劉會(huì)東.植物多糖提取分離及藥理作用的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003，14（8）：495-496， 497.

[7]任守利，劉塔斯，劉宇婧，等.天麻多糖提取工藝的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（1）：37-40.

[8]劉玉潭，梁華，蔡永萍，等.天麻多糖提取純化方法及性質(zhì)的初步研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2007，16（4）：495-500.

[9]王宏軍，鄧旭明，蔣紅，等.蒽酮-硫酸比色法檢測(cè)多糖條件的優(yōu)化[J].中國(guó)飼料，2011（4）：39-41.

[10]張紅，王騰，李翠清.響應(yīng)面分析優(yōu)化蒽酮-硫酸法測(cè)定桑葉中多糖的含量[J].食品工業(yè)科技，2012，33（24）：62-65.

[11]王韜，仇全雷，杜艷倉(cāng)，等.云南昭通天麻多糖含量測(cè)定[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（1）：31-33.

[12]李德勛，陳桂，李輔碧，等.天麻不同變異類(lèi)型藥材中天麻素含量比較[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2007，21（3）：23-24.

[13]余昌俊，王紹柏，劉雪梅.天麻6個(gè)品種重要性狀比較分析[J].生物學(xué)通報(bào)，2010，45（3）：12-14.