李佳娟 李雯 馬彥

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，太原 030001)

·論著·

含PxIxIT模序煙曲霉KpsF基因作用初探

李佳娟1李雯1馬彥2

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，太原 030001)

目的 構(gòu)建煙曲霉KpsF 基因缺陷株，初步了解KpsF基因在煙曲霉生長及與鈣調(diào)磷酸酶相互作用關(guān)系。方法 PCR擴(kuò)增煙曲霉KpsF基因及其上、下游各約1.0 kb的DNA片段，以pyrG為篩選標(biāo)記，原生質(zhì)體法構(gòu)建KpsF基因缺陷株ΔKpsF；觀察ΔKpsF一般生長狀況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Ku80 (對(duì)照組)和ΔKpsF (實(shí)驗(yàn)組)在含有不同濃度CaCl2的液體GMM培養(yǎng)基中鈣調(diào)磷酸酶催化亞基 (CnaA)相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果 煙曲霉ΔKpsF和Ku80徑向生長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；表型未見明顯差別；ΔKpsF在10 mmol/L CaCl2GMM液體培養(yǎng)基的CnaA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組Ku80 (P<0.01)，而100 mmol/L CaCl2的CnaA相對(duì)表達(dá)量卻沒有明顯變化 (P>0.05)。結(jié)論 KpsF基因缺陷對(duì)煙曲霉的徑向和表型生長沒有明顯影響，對(duì)CnaA表達(dá)量的影響與Ca2+濃度有關(guān)。在低濃度Ca2+條件下，KpsF可能參與對(duì)鈣調(diào)磷酸酶的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，而在高濃度的Ca2+條件下，這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用受到抑制。

煙曲霉；鈣調(diào)磷酸酶；KpsF基因；PxIxIT模序

近年來侵襲性曲霉病 (invasive aspergillosis,IA)感染發(fā)生率呈上升趨勢(shì),其最常見的感染者為實(shí)體器官、造血干細(xì)胞移植及惡性血液病患者[1]。IA最主要病原真菌是煙曲霉，目前其對(duì)人體的致病機(jī)制仍在研究中[2]。鈣調(diào)磷酸酶 (Calcineurin，CaN)是Ca2+/鈣調(diào)蛋白 (CaM)依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，由催化亞基CnaA和調(diào)節(jié)亞基CnaB組成，其在所有真核生物中均存在，且在進(jìn)化上相對(duì)保守。Aramburu等[3]總結(jié)表明CnaA由5部分組成：氨基末端，一個(gè)催化區(qū)域和三個(gè)調(diào)節(jié)域 (CnaB結(jié)合區(qū)域，CaM結(jié)合區(qū)域和自抑制區(qū)域 (auto-inhibitory，AI))。當(dāng)不存在Ca2+時(shí)，AI區(qū)域會(huì)阻斷CnaA活性位點(diǎn)，此時(shí)CaN 是沒有活性的；當(dāng)存在有Ca2+時(shí)，CaN與Ca2+/CaM結(jié)合形成復(fù)合物，引起構(gòu)象的改變，使AI發(fā)生移位暴露出活性位點(diǎn)，從而激活CaN[3]。研究表明，CaN通過CnaA同底物的PxIxIT模序相互作用，其下游底物Crz1、Slm1、Slm2、Hph1等基因中均發(fā)現(xiàn)有類似模序[4-6]，該模序內(nèi)氨基酸的精細(xì)變動(dòng)同各底物對(duì)應(yīng)的生理信號(hào)傳導(dǎo)相對(duì)應(yīng)[7]。煙曲霉基因組中是否存在含有類似PxIxIT模序而我們尚未發(fā)現(xiàn)的基因？該基因同CaN如何作用？也許能幫助我們進(jìn)一步了解煙曲霉鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)傳導(dǎo)路徑，以及為IA的治療提供更多的科學(xué)思路。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒來源

Ku80為煙曲霉對(duì)照菌株 (wt)，煙曲霉轉(zhuǎn)化用宿主菌為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷株Ku80 pyrG-，該菌株在沒有尿嘧啶和尿苷的培養(yǎng)基上不能生長。篩選標(biāo)記pyrG來源于質(zhì)粒pJW24 (由杜克大學(xué)William J.Steinbach教授贈(zèng)送)。

1.2 主要試劑

溶壁酶購自Sigma公司，GMM培養(yǎng)基，等滲培養(yǎng)基，Trapping緩沖液，聚乙二醇氯化鈣溶液，STC溶液等均由本實(shí)驗(yàn)室配置；RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT Master Mix，SYBR○RPremix Ex TaqTMII均購自寶生物 (大連)工程有限公司。

1.3 生物信息學(xué)分析

在煙曲霉基因組 (www.aspergillusgenome.org)查找發(fā)現(xiàn)KpsF基因包含有PxIxIT模序，并對(duì)常見的模式真菌進(jìn)行同源序列比對(duì)分析。

1.4 構(gòu)建KpsF基因敲除株

KpsF基因克隆及敲除載體的構(gòu)建 煙曲霉Ku80 pyrG-在GMM+YG+UU液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，過濾收集菌絲；提取基因組DNA。設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增KpsF基因5′和3′側(cè)翼序列各約1.0 kb的DNA序列：首先將3′側(cè)翼序列擴(kuò)增后，使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和SalI將其克隆連接進(jìn)入質(zhì)粒pJW24；其次擴(kuò)增5′側(cè)翼序列，使用限制性內(nèi)切酶NotI和BamH I將5′側(cè)翼序列克隆連接進(jìn)入上一步產(chǎn)生的質(zhì)粒中構(gòu)建成功敲除質(zhì)粒；最后使用限制性內(nèi)切酶NotI和SalI將敲除質(zhì)粒進(jìn)行酶切，然后使用煙曲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)中用到的引物見表1。

表1 構(gòu)建煙曲霉KpsF基因缺陷株使用到的引物

煙曲霉原生質(zhì)體法構(gòu)建KpsF基因缺陷株 具體實(shí)驗(yàn)方法見文獻(xiàn)[8]。

1.5 Southern blot驗(yàn)證KpsF基因缺陷株

設(shè)計(jì)上下游引物命名為KpsF-probe-F，KpsF-probe-R (見表1)。對(duì)照組 (wt)和四個(gè)轉(zhuǎn)化子 (1、2、3、4)的基因組DNA均用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI進(jìn)行消化酶切，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，余步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 ΔKpsF和Ku80生長速度和表型觀察比較

在固體GMM培養(yǎng)基上，接種1×106cells/mL的ΔKpsF和Ku80菌懸液10 μL，37℃恒溫下培養(yǎng)5 d，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h觀察記錄菌落直徑；表型觀察采用小培養(yǎng)方法，具體步驟詳見參考文獻(xiàn)[9]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 RT-PCR比較在不同濃度Ca2+液體培養(yǎng)基條件下ΔKpsF和Ku80兩菌株的CnaA相對(duì)表達(dá)量

從煙曲霉基因庫中查詢CnaA基因，設(shè)計(jì)特異性引物，以β-tubulin作為內(nèi)參 (見表2)。分別加ΔKpsF和Ku80菌懸液500 μL于5 mL配好的含有不同濃度CaCl2的液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h，過濾收集菌絲，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。使用Trizol法的提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA (20 μL體系所需mRNA不超過為1 000 ng)。RT-PCR擴(kuò)增體系：cDNA 1 μL，正、反向引物各1μL，SYBR○RPremix Ex TaqTMII 12.5 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)充至25 μL。擴(kuò)增條件如下：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s變性，56℃ 30 s退火延伸，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。CnaA表達(dá)量的計(jì)算采用ΔΔCt方法，ΔΔCt=(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)實(shí)驗(yàn)組-(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)對(duì)照組。

表2 RT-PCR引物列表

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩菌株徑向生長采用重復(fù)測(cè)量方差分析，不同濃度CaCl2處理采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)，取P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 煙曲霉KpsF基因生物信息學(xué)分析

通過生物信息學(xué)方法，從煙曲霉基因組找出KpsF基因，編號(hào)為Afu6g08860,序列分析發(fā)現(xiàn)KpsF基因含有1 404個(gè)堿基，編碼443個(gè)氨基酸，蛋白序列發(fā)現(xiàn)KpsF基因具有類似PxIxIT模序-PVIAIT (見圖1中黃色標(biāo)記部分)。煙曲霉 (Aspergillusfumigatus)、粗糙脈胞菌霉 (Neurosporacrassa)、新生隱球菌 (Cryptococcusneoformans)和白色念珠菌 (Candidaalbicans)四種常見模式真菌的KpsF基因的同源序列比對(duì)結(jié)果見圖1。

2.2 煙曲霉KpsF基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建

詳見圖2。由圖可見煙曲霉KpsF基因使用篩選標(biāo)記pyrG替代。

2.3 Southern blot驗(yàn)證結(jié)果

wt為對(duì)照株Ku80，M為DNA marker，在約809 bp處，泳道1、4處有一清晰條帶 (見圖3)，而對(duì)照組Ku80未見明顯條帶，說明1、4為成功轉(zhuǎn)化的煙曲霉缺陷株ΔKpsF。

2.4 ΔKpsF和Ku80生長速度和表型觀察結(jié)果

詳見圖4和圖5。經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析顯示兩菌株徑向生長P>0.05，結(jié)果未見明顯差異，說明KpsF基因缺陷對(duì)于煙曲霉徑向生長沒有明顯影響，圖a和b兩菌株徑向生長結(jié)果 (37℃，培養(yǎng)72 h)；乳酸酚棉蘭染色對(duì)ΔKpsF和Ku80進(jìn)行表型觀察：圖c和d中可見兩菌株菌絲細(xì)長，分枝多呈45°，排列整齊 (棉蘭，×200)，圖e和f中的紅色箭頭為菌絲隔膜，清晰明顯 (棉蘭，×400)，圖g和h可見分生孢子頭呈短柱狀，孢子梗壁光滑 (棉蘭，×400)；兩菌株表型觀察結(jié)果未見明顯差異。

2.5 RT-PCR方法檢測(cè)CnaA基因相對(duì)表達(dá)結(jié)果

對(duì)照組GMM液體培養(yǎng)基的ΔKpsF的CnaA表達(dá)量是Ku80的2.81倍，ΔKpsF的CnaA表達(dá)量略高于Ku80；在10 mmol/L Ca2+濃度下，ΔKpsF的CnaA基因表達(dá)量是Ku80的29.94倍 (見圖6)；而在100 mmol/L Ca2+濃度下，ΔKpsF和Ku80的CnaA相對(duì)表達(dá)量沒有差異；單因素方差分析表明ΔKpsF在不同Ca2+濃度條件下相對(duì)于Ku80的CnaA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，并且在低濃度Ca2+條件下差異顯著 (P<0.01)。

3 討 論

鈣調(diào)磷酸酶 (CaN)包括CnaA和CnaB兩個(gè)亞基，能識(shí)別多種底物，并且影響真核細(xì)胞的發(fā)育和生理功能，是臨床常用的免疫抑制劑環(huán)孢素A (cyclosporineA，CsA)和他克莫司 (tacrolimus,FK506)的靶蛋白，然而由于FK506和CsA免疫抑制作用，使其在治療侵襲性曲霉菌感染患者中的應(yīng)用受到限制。因此，研究煙曲霉鈣調(diào)磷酸酶相關(guān)的底物或者靶蛋白，識(shí)別內(nèi)源性鈣調(diào)磷酸酶抑制劑是一個(gè)重要的策略[10]。Steinbach等[8]通過構(gòu)建△CnaA，證實(shí)CaN在煙曲霉菌絲生長和毒力方面的關(guān)鍵作用。Juvvadi等[10]通過構(gòu)建△CnaA和CnaA+GFP等菌株，發(fā)現(xiàn)CnaA定位于煙曲霉菌絲的尖端和分隔處，從而證實(shí)了CaN在隔膜形成中的作用。PxIxIT模序首先在NFAT中被發(fā)現(xiàn)且其高度保守[11]，CaN通過CnaA同底物的PxIxIT模序相互作用，發(fā)揮其生理作用。Pinchai等[12]研究證明CbpA是鈣調(diào)磷酸酶內(nèi)源性的抑制劑成員之一，并且參與菌絲的生長和鈣離子體內(nèi)平衡。Juvvadi等[13]發(fā)現(xiàn)CbpA基因中存在PxIxIT類似模序 (PVDPGT)，且該模序在與鈣調(diào)磷酸酶相互作用中起到重要作用。通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)煙曲霉KpsF基因蛋白序列中有類似PxIxIT模序 (PVIAIT)存在，所以推測(cè)KpsF基因可能為煙曲霉鈣調(diào)磷酸酶新的底物或者靶蛋白，其如何同鈣調(diào)磷酸酶相互作用，對(duì)煙曲霉的致病性有何影響有待進(jìn)一步研究。

圖1 常見真菌中KpsF同源序列比對(duì)結(jié)果 圖2 構(gòu)建KpsF基因敲除載體示意圖,煙曲霉KpsF基因用篩選標(biāo)記pyrG替代 圖3 Southern blot驗(yàn)證煙曲霉KpsF基因缺陷株，wt為對(duì)照株Ku80，M為DNA marker (bp) 圖4 ΔKpsF和Ku80兩種菌株在GMM培養(yǎng)基上不同時(shí)間點(diǎn)的徑向生長結(jié)果 圖5 ΔKpsF和Ku80兩菌株徑向生長和乳酸酚棉蘭染色觀察表型生長：a,b.兩菌株徑向生長結(jié)果 (37℃，培養(yǎng)72 h)；c,d.兩菌株菌絲細(xì)長，分枝多呈45°，排列整齊 (棉蘭，×200)；e,f.紅色箭頭為菌絲隔膜，清晰明顯 (棉蘭，×400)；g,h.分生孢子頭呈短柱狀，孢子梗壁光滑 (棉蘭，×400) 圖6 在不同濃度CaCl2處理?xiàng)l件下的CnaA基因相對(duì)表達(dá)量 (*.P<0.05，**.P<0.01，1 mM=1 mmol/L)

Fig.1 The homologous sequence alignment results of KpsF gene in common fungi Fig.2 Sketch map of KpsF gene deletion,KpsF gene replaced by selection marker pyrG Fig.3 The verification of ΔKpsF strains by Southern blot (wt.The control strains Ku80,M.DNA marker) Fig.4 The radial growth results of ΔKpsF and Ku80 on the GMM medium at 37℃ for 24 h,48 h,72 h,96 h,120 h Fig.5 Radial growth and phenotypic growth of ΔKpsF and Ku80:a,b.Radial growth of two strains (cultured at 37℃,72 h)；c,d.Microculture:Hyphae branch with 45°(Lactophenol Cotton Blue,×200)；e,f.Septum was clear (marked with red arrow,Lactophenol Cotton Blue,×400)；g,h.Conidium and Conidiophore of two strains (Lactophenol Cotton Blue,×400)Fig.6The relative expression of CnaA of two strains under the treatment of different concentration of CaCl2,1 mM=1 mmol/L

本研究通過在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)ΔKpsF與Ku80菌落直徑進(jìn)行重復(fù)測(cè)量，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ΔKpsF與Ku80徑向生長沒有明顯差異，說明KpsF基因缺陷對(duì)煙曲霉徑向生長沒有影響；高倍顯微鏡下觀察小培養(yǎng)結(jié)果：ΔKpsF和Ku80菌絲細(xì)長，分枝多呈45°，排列整齊 (棉蘭，×200)；菌絲分隔清晰，分生孢子頭呈短柱狀，孢子梗壁光滑 (棉蘭，×400)，表明兩菌株形態(tài)表現(xiàn)無明顯差別。而Pinchai等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ΔCbpA與野生株相比徑向生長下降約30%。Juvvadi等[10]在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生株，ΔCnaA菌絲高度分枝。由此可見，煙曲霉CbpA與KpsF基因雖然都含有類似PxIxIT模序，但是兩基因功能是有差別的，也就是說KpsF基因缺陷對(duì)煙曲霉的徑向和表型生長影響不明顯。

既往研究表明CbpA和CnaA對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)有重要影響，Pinchai等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在200 mmol/L CaCl2存在的條件下，ΔCbpA菌株的CnaA基因的表達(dá)量是對(duì)照組Ku80的3.2倍，表明CbpA可能參與的鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié),與先前研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)照GMM液體培養(yǎng)基上，ΔKpsF的CnaA表達(dá)量是Ku80的2.81倍 (P<0.01)，在10 mmol/L Ca2+條件下，ΔKpsF表達(dá)量是Ku80的29.76倍 (P<0.01)。在100 mmol/L Ca2+條件下，ΔKpsF與Ku80的CnaA表達(dá)量無差別 (P>0.05)。說明在低濃度Ca2+條件下，KpsF基因可能參與鈣調(diào)磷酸酶的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，并且在10 mmol/L Ca2+條件下負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用明顯，但是在高濃度Ca2+條件下該負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用卻受到抑制，說明CbpA與KpsF與鈣調(diào)磷酸酶相互作用機(jī)制有明顯不同。

KpsF作為新發(fā)現(xiàn)的基因，其具體功能仍在初步探索中，本研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉KpsF基因?qū)naA表達(dá)水平的影響與Ca2+濃度高低有關(guān)。條件允許的情況下我們可以通過蛋白印記的方法檢測(cè)鈣調(diào)磷酸酶的表達(dá)情況，或者通過構(gòu)建ΔKpsFΔCnaA菌株進(jìn)一步探究KpsF與CaN的關(guān)系，對(duì)KpsF基因做更全面的研究。

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The study of KpsF gene which contains PxIxIT motif inAspergillusfumigatus

LI Jia-juan1，LI Wen1,MA Yan2

(1.ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China；2.DepartmentofDermatology，TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Objective To construct the KpsF gene defect strains ΔKpsF and to explore the interaction between KpsF gene and calcineurin.Methods Amplificated the upstream and downstream of KpsF about 1.0 kb DNA fragments，the pyrG of plasmid pJW 24 was used as a biomarker when constructting the knockout plasmid.Recombinant plasmid was transformed intoA.fumigatusKu80pyrGand got ΔKpsF.To observer the radial and phenotypic growth of Ku80 and ΔKpsF,Real-time PCR was used to determine the relative expression of calcineurin catalytic subunit (CnaA) of Ku80 (control group)and ΔKpsF (experimental group) in GMM liquid medium containing different concentration of CaCl2.Results Compared with Ku80,the radial growth of ΔKpsF had no obvious change (P>0.05)，and the phenotypic growth had no obvious difference.In GMM Liquid medium containing 10 mmol/L CaCl2,the relative expression of CnaA of ΔKpsF strain was significantly higher than Ku80 (P<0.01).However,the relative expression of CnaA did not obviously changed (P>0.05) in GMM Liquid medium containing 100 mmol/L CaCl2.Conclusions The KpsF had no effect in radial and phenotypic growth ofA.fumigatus.Under the condition of different concentrations of Ca2+,the relative expression levels of CnaA gene were different between ΔKpsF and Ku80,suggesting that the KpsF might be involved in the feedback regulation of calcineurin under the condition of low concentration of CaCl2.

Aspergillusfumigatus；Calcineurin；KpsF gene；PxIxIT motif

8-12]

國家青年科學(xué)基金 (81101233)，山西省青年科技研究基金 (2010021036-2)，山西省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題 (2015043)，山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目 (2016-052)

李佳娟，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:642322732@qq.com

馬彥,E-mail:mayan197522@163.com

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0008-05

2016-10-20 [本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮