孫春慶，于勇謀，申穎，董 浩

(1.山東省臨沂市畜牧局，山東臨沂 276000；2.山東省乳山市乳山口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，山東乳山 264500；3.山東省畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261000;4.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

布魯菌外膜小泡研究進(jìn)展

孫春慶1，于勇謀2，申穎3，董 浩4*

(1.山東省臨沂市畜牧局，山東臨沂 276000；2.山東省乳山市乳山口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，山東乳山 264500；3.山東省畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261000;4.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

布魯菌病(布病)是最嚴(yán)重的人畜共患病之一，布魯菌可以導(dǎo)致患病動(dòng)物的流產(chǎn)及人類的馬耳他熱。外膜小泡是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中自發(fā)釋放的一種球形的雙層膜結(jié)構(gòu)。在多種細(xì)菌中，外膜小泡發(fā)揮著運(yùn)輸細(xì)菌物質(zhì)，抵御宿主殺傷作用，參與生物膜形成等多種功能。外膜小泡也可以影響布魯菌的內(nèi)化過(guò)程，并干擾宿主的細(xì)胞因子反應(yīng)，從而使布魯菌建立對(duì)宿主的感染。除此之外，由于布魯菌的外膜小泡具有良好的免疫保護(hù)力，使其在布病的防控具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

布魯菌；外膜小泡；免疫保護(hù)力

多種革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌和古細(xì)菌均可以在生長(zhǎng)過(guò)程中自發(fā)釋放外膜小泡(outer membrane vesicles，OMVs)。OMVs是一種直徑為20 nm～250 nm的球形雙層膜結(jié)構(gòu)。對(duì)革蘭陰性菌的OMVs的研究較多，它們通常是從革蘭陰性菌的外膜分泌的[1]。在某些情況下，OMVs的直徑可以達(dá)到10 nm～500 nm，也會(huì)出現(xiàn)一些不規(guī)則的形狀[2]。

OMVs雙層膜的內(nèi)層膜主要成分是磷脂，外層膜主要成分是脂多糖和磷脂，在雙層膜的不同位置還混合著大量的外膜蛋白，這些外膜蛋白的組成與細(xì)菌外膜很相似[1,3]。在OMVs的內(nèi)部則包含著來(lái)自細(xì)菌周質(zhì)或者細(xì)胞質(zhì)的組分，例如蛋白、RNA/DNA和肽聚糖等[4-5]。OMVs中的蛋白組分會(huì)隨著細(xì)菌處于不同生長(zhǎng)周期、不同類型培養(yǎng)基、不同的應(yīng)激環(huán)境而發(fā)生改變。

1 細(xì)菌外膜小泡簡(jiǎn)介

1.1 外膜小泡的蛋白組分

與OMVs中的脂類、核酸相比，蛋白組分一直是研究者們非常感興趣的問(wèn)題。通過(guò)各種蛋白質(zhì)學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)菌中OMVs中鑒定出的蛋白質(zhì)種類為50種～338種，其中40%～80%被認(rèn)為是細(xì)菌的外膜蛋白[6-7]。這些鑒定出的蛋白可以分為三大類，即外膜基本成分蛋白、OMVs內(nèi)的特定蛋白和未知蛋白或污染蛋白。

外膜基本成分蛋白主要是細(xì)菌外膜中的部分蛋白，如孔道蛋白、黏附素、鞭毛和菌毛蛋白等[5,8]；OMVs內(nèi)的特定蛋白主要是一些毒素(腸毒性大腸埃希菌的溶細(xì)胞素A、霍亂弧菌的霍亂毒素、空腸彎曲菌的細(xì)胞膨脹致死毒素等)和一些酶類(蛋白酶和脲酶)[9]；未知蛋白或污染蛋白主要指那些通常不被認(rèn)為應(yīng)該存在于OMVs中的蛋白，隨著分離技術(shù)的提高，這類蛋白的數(shù)量正在逐漸減少。

1.2 外膜小泡的功能

細(xì)菌OMVs的功能目前有幾類假說(shuō)，其中一種可信度較高的假說(shuō)是OMVs作為細(xì)菌的一種遠(yuǎn)距離運(yùn)輸某些特殊組分的傳送系統(tǒng)，保護(hù)被運(yùn)送的組分免受稀釋與降解[10]。這些被OMVs運(yùn)送組分的功能可能是幫助細(xì)菌獲取營(yíng)養(yǎng)或者營(yíng)造一個(gè)適于生存的宿主內(nèi)環(huán)境。最新的研究表明，牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體可以利用OMVs向宿主細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸msRNAs[11]，而苛養(yǎng)木桿菌則可以利用OMVs轉(zhuǎn)運(yùn)抗毒素蛋白[12]。OMVs還可能作為一種誘餌與抗體等殺菌組分結(jié)合，從而減少宿主對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。在一些細(xì)菌中，還發(fā)現(xiàn)OMVs參與到生物膜的形成過(guò)程，從而使細(xì)菌可以在宿主或者土壤環(huán)境中生存[12]。有報(bào)道還表明由于OMVs可以降低慶大霉素等抗生素的殺菌作用，OMVs可能還與細(xì)菌的耐藥性相關(guān)[13]。除此之外，OMVs還參與到保護(hù)細(xì)菌抵御噬菌體的殺傷作用和在細(xì)菌間轉(zhuǎn)運(yùn)核酸(質(zhì)粒DNA、基因組DNA片段或者噬菌體DNA)等生物過(guò)程[11,14]。

1.3 外膜小泡的形成

細(xì)菌OMVs的形成過(guò)程可以描述為通過(guò)細(xì)菌外膜形成OMVs膜結(jié)構(gòu)的一個(gè)出芽過(guò)程[15]。目前，細(xì)菌OMVs的形成還沒(méi)有一個(gè)通用的機(jī)制，但是這個(gè)過(guò)程通常包括以下幾個(gè)事件：①細(xì)菌外膜和肽聚糖層連接的斷開(kāi)；②細(xì)胞質(zhì)組分的積累；③特定信號(hào)或效應(yīng)因子的活化。

1.4 誘導(dǎo)外膜小泡形成的信號(hào)

誘導(dǎo)OMVs形成的信號(hào)通常與細(xì)菌受到的應(yīng)激環(huán)境密切相關(guān)，如溫度應(yīng)激、氨基酸缺乏應(yīng)激、抗生素及噬菌體的吸附等[16]。除此之外，一些有機(jī)分子與細(xì)菌OMVs的產(chǎn)生也密切相關(guān)，如十六烷可以誘導(dǎo)不動(dòng)桿菌OMVs產(chǎn)生，葡萄糖可促進(jìn)耶爾森菌OMVs的分泌，碳酸鈉可以誘導(dǎo)霍亂弧菌OMVs的形成[17-19]。

細(xì)菌OMVs的產(chǎn)生也與細(xì)菌生長(zhǎng)周期存在一定的聯(lián)系。腦膜炎奈瑟菌和土拉桿菌在在生長(zhǎng)周期的晚期產(chǎn)生更多的OMVs，而鼠傷寒沙門(mén)菌和包柔螺旋體主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分泌OMVs。嗜肺軍團(tuán)菌則是在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的任何生長(zhǎng)周期均可以產(chǎn)生OMVs[9]?？偟膩?lái)說(shuō)，在革蘭陰性菌的各個(gè)生長(zhǎng)階段，OMVs是持續(xù)產(chǎn)生的，但是在出現(xiàn)某些特定的信號(hào)時(shí)，OMVs的產(chǎn)生水平會(huì)增強(qiáng)。

2 布魯菌外膜小泡的研究進(jìn)展

2.1 布魯菌外膜小泡的發(fā)現(xiàn)

1987年，Gamazo C等[20]在研究布魯菌的外膜時(shí)發(fā)現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的羊種布魯菌和粗糙型的羊種布魯菌突變株均可以自發(fā)的分泌含有布魯菌外膜組分而不含有內(nèi)膜組分的膜類物質(zhì)，這種膜類物質(zhì)就是OMVs。對(duì)這些OMVs成分的初步研究表明，其中含有脂多糖、磷脂和多種外膜蛋白，但不含有細(xì)菌內(nèi)膜的標(biāo)志分子。通過(guò)超速離心發(fā)現(xiàn)羊種布魯菌16 M可以產(chǎn)生2種沉降系數(shù)不同的OMVs，經(jīng)過(guò)電子顯微鏡的觀察表明2種OMVs的膜結(jié)構(gòu)和大小均不相同。

2.2 布魯菌外膜小泡的成分

Gamazo C等[21]通過(guò)SDS-PAGE對(duì)羊種布魯菌和綿羊附睪種布魯菌OMVs的蛋白組分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)2種布魯菌的OMVs蛋白成分非常相似，都由4組蛋白組成(A組：25.5 ku～32.0 ku；B組:21.5 ku～22.5 ku；C組：18.0 ku～19.5 ku；D組：13.0 ku～15.5 ku)。Boigegrain R A等發(fā)現(xiàn)豬種布魯菌在中性培養(yǎng)基和pH 4.0的酸性培養(yǎng)基中均可以自發(fā)形成OMVs，而且OMVs中含有豐富的OMP25和OMP31蛋白。通過(guò)電子顯微鏡對(duì)豬種布魯菌的OMVs進(jìn)行觀察，其直徑在大約80 nm。

Avila-Calder′on E D等[22]分離了羊種布魯菌16 M的OMVs并對(duì)其蛋白質(zhì)成分進(jìn)行了分析，共發(fā)現(xiàn)了29個(gè)蛋白。這29個(gè)蛋白中52%屬于細(xì)菌外膜，17%來(lái)自細(xì)菌的周質(zhì)，20.6%來(lái)自細(xì)胞質(zhì)，2個(gè)蛋白來(lái)自內(nèi)膜，還有1個(gè)蛋白可能屬于胞外蛋白。從功能上分類，這些蛋白分別屬于:①結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;②抗原蛋白;③參與代謝過(guò)程的蛋白;④參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白;⑤侵襲蛋白。

2.3 布魯菌外膜小泡與宿主免疫

研究發(fā)現(xiàn)，多種革蘭陰性菌分泌的OMVs具有調(diào)理宿主免疫從而利于建立感染的功能[23]。Pollak C N等[24]對(duì)牛種布魯菌OMVs感染人上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞過(guò)程中所發(fā)揮的功能進(jìn)行了研究，表明布魯菌OMVs可以被兩種細(xì)胞內(nèi)化，而這一過(guò)程與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用存在著一定的關(guān)聯(lián)。用布魯菌OMVs對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，會(huì)抑制一些細(xì)胞因子正常功能的發(fā)揮，如針對(duì)大腸埃希菌的脂多糖和鞭毛蛋白，以及布魯菌的細(xì)胞因子反應(yīng)明顯被抑制，而OMVs也會(huì)抑制布魯菌感染過(guò)程中THP-1細(xì)胞的一些細(xì)胞因子反應(yīng)。用OMVs處理過(guò)的THP-1細(xì)胞，INF-γ誘導(dǎo)MHCⅡ類分子的水平顯著降低。除此之外，用OMVs預(yù)處理THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞吸附和內(nèi)化牛種布魯菌的數(shù)量顯著增加。

Avila-Calder′on E D等[22]發(fā)現(xiàn)用羊種布魯菌16 M和一個(gè)16 M衍生的粗糙型菌株VTRM1的OMVs刺激骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDC),光滑型布魯菌分泌的OMVs和粗糙型布魯菌分泌的OMVs對(duì)BMDC中各種細(xì)胞因子的影響并不相同，其中粗糙型布魯菌的OMVs顯著上調(diào)BMDC中編碼IL-12、TNF-ɑ、INF-γ 3種細(xì)胞因子基因的表達(dá)水平。

2.4 布魯菌外膜小泡的應(yīng)用

Avila-Calder′on E D等[22]檢測(cè)了羊種布魯菌16 M和粗糙型菌株VTRM1的OMVs對(duì)小鼠的免疫保護(hù)力。結(jié)果顯示，Rev1疫苗株免疫的小鼠攻毒后，脾臟菌落數(shù)與對(duì)照組相比降低了2.64個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，16 M的OMVs免疫小鼠攻毒后降低了1.9個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，而VTRM1的OMVs免疫小鼠后降低了3.08個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。說(shuō)明粗糙型布魯菌的OMVs可以對(duì)小鼠產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力。進(jìn)一步的研究表明，使用聚醚P85作為OMVs的佐劑免疫小鼠時(shí)，可以有效的抵御羊種布魯菌的感染。這種免疫方法可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌水平，使宿主產(chǎn)生更高滴度的IgG，而IFN-γ和IL-4等細(xì)胞因子的表達(dá)水平并不發(fā)生顯著改變[25]。Kaur G等[26]對(duì)牛種布魯菌的OMVs也開(kāi)展了相關(guān)研究，其發(fā)現(xiàn)牛種布魯菌99株分離的OMVs，具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物可以產(chǎn)生針對(duì)OMVs的特異性的、高滴度的免疫反應(yīng)。

3 展望

布魯菌作為一種胞內(nèi)寄生菌，其在宿主細(xì)胞內(nèi)生存和免疫逃逸的機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。由于布魯菌的OMVs在分泌細(xì)菌蛋白、調(diào)理宿主免疫和建立感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)布魯菌OMVs的研究無(wú)疑對(duì)闡明布魯菌致病機(jī)制和宿主與布魯菌相互作用都具有重要意義。

鑒于布魯菌病對(duì)公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的嚴(yán)重影響，各國(guó)對(duì)凈化、根除布魯菌病的要求也愈來(lái)愈迫切。目前，國(guó)際上使用的布魯菌疫苗基本都是弱毒活疫苗，這類疫苗對(duì)懷孕動(dòng)物和人類具有一定的感染性。布魯菌OMVs本身并不具有感染性，還具有良好的保護(hù)力，無(wú)疑是布魯菌新型亞單位疫苗的一個(gè)極佳選擇。

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Abstract:Bacteria of the genusBrucellaare responsible for one of the world’s most widespread zoonotic infections,causing infectious abortion in animals and a febrile disease,known as Malta Fever,in haman.Outer membrane vesicles are spherical bi-layered membrane structures，which are released spontaneously during growth by many bacteria.In various bacteria,outer membrane vesicles play important roles in delivering components,resistance to host immune response and formation of biofilms.Outer membrane vesicles affect the internalization process ofBrucellastrains and the cytokine response of the hosts,so thatBrucellaspp.could survive in the hosts.In addition,as outer membrane vesicles ofBrucellahave good immunoprotection,they have important value in the prevention and control of brucellosis.

Keywords:Brucella; outer membrane vesicle; immunoprotection

ProgressonOuterMembraneVesiclesinBrucella

SUN Chun-qing1,YU Yong-mou2,SHEN Ying3，DONG Hao4

(1.AnimalHusbandryBureauofLinyiCity,Linyi,Shandong,276000,China; 2.AnimalHusbandryandVeterinaryStationofRushankou,Rushan,Shandong,264500,China; 3.ShandongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege,Weifang,Shandong, 261000,China; 4.ChinaAnimalDiseaseControlCenter，Beijing，102600,China)

S852.614

A

1007-5038(2017)08-0089-04

2016-12-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31602055)

孫春慶(1982-)，男，山東煙臺(tái)人，學(xué)士，主要從事動(dòng)物疫病防控研究。*