劉亞東，王慧煜，韓雪清

(中國檢驗檢疫科學(xué)院動物檢疫研究所，北京 100029)

納米標記物新型免疫檢測技術(shù)研究進展

劉亞東，王慧煜，韓雪清*

(中國檢驗檢疫科學(xué)院動物檢疫研究所，北京 100029)

納米標記物新型免疫檢測技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域且發(fā)展迅速的一種簡便、精準的現(xiàn)場檢測技術(shù)，逐步推動著分子生物學(xué)的發(fā)展及人畜疾病的防控，成為了生物分析領(lǐng)域的重要內(nèi)容，與之密切相關(guān)的納米材料標記物在檢測技術(shù)中起著主導(dǎo)作用。由于各種新型的納米材料標記物的不斷研發(fā)與優(yōu)化分析，使得與之相關(guān)的檢測技術(shù)廣泛運用于食品質(zhì)量檢測、檢驗檢疫、疾病防控等方面。隨著生物分析領(lǐng)域的拓展，更多的標記物如納米磁珠、鑭系元素、上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒、納米乳球、量子點等已被制備并應(yīng)用于更多疾病診斷技術(shù)中。論文以結(jié)合近年來成功研究為基礎(chǔ)歸納新型納米材料標記物的特性方面的研究進展，剖析其多元性，以期為相關(guān)研究提供參考。

新免疫檢測技術(shù)；納米標記物；納米磁珠；量子點

近年來，由于納米科學(xué)技術(shù)的巨大發(fā)展，納米科技在環(huán)境保護、生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)工藝等領(lǐng)域中的研究起到了根本性變革作用。新型納米材料標記物的研制也日新月異，其應(yīng)用于納米標志免疫檢測技術(shù)中正朝著高靈敏度、多元化、實現(xiàn)定量或半定量檢測方向發(fā)展，一改往日靈敏度偏低、檢測指標單一等缺點。目前新型的納米材料標志物在研究領(lǐng)域廣為知曉，如納米磁珠、鑭系元素、上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒、納米乳球及量子點等?，F(xiàn)對幾種新型納米標記的免疫檢測技術(shù)的應(yīng)用特性及優(yōu)缺點進行剖析。

1 磁性納米顆粒

磁性納米顆粒是由Senyei A E于1978年開發(fā)出的一種備受科研工作者關(guān)注的新型材料[1]。磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNs)被稱為超順磁顆粒，結(jié)合了納米材料和磁性粒子的優(yōu)點，具有超順磁性、比表面積大及小尺寸效應(yīng)等特點。由于納米磁珠的強磁性和單分散性，應(yīng)用在免疫層析技術(shù)中可大大提高檢測分析的穩(wěn)定性、靈敏度和可重復(fù)性。同時因其固有的納米顆粒表面效應(yīng)及磁性，已廣泛用于藥物載體、影像診斷、磁靶向及熱療等多項領(lǐng)域[2-3]。

磁性免疫層析技術(shù)是將納米磁珠的磁信號與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，使免疫層析技術(shù)向定量化、高靈敏度、多元化檢測等方向發(fā)展，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物檢驗檢疫、食品質(zhì)量監(jiān)測等領(lǐng)域。孫建斌等[4]研發(fā)了用于早孕檢測的人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)納米磁性免疫層析試紙條，檢測快速且靈敏度高。Liu Chunyan等[5]研制出快速半定量檢測對氧磷農(nóng)藥殘留免疫層析試紙條，最低限度檢測為1.7 ng/mL。呂品雷等[6]選用熒光磁性納米粒子作為標記物，體外標記人脂肪間充質(zhì)干細胞，結(jié)果顯示被標記的人脂肪間充質(zhì)干細胞具有很好的成像效果，為脂肪間充質(zhì)干細胞的移植轉(zhuǎn)化研究提供新方法。梁龍輝等[7]基于相思子毒素磁性納米顆粒免疫捕獲法的建立，與建立的雙夾心ELISA相比較，靈敏度得到了顯著的提高，于此適用于微量相思子毒素的檢測分析。由于可應(yīng)用的高純度MNs的制備還處于困難時期，磁性號的檢測靈敏不及光信號，且檢測儀器無法小型化不便攜帶操作，若將該因素有效規(guī)避，那么該方面的研究將大放異彩。

2 斕系元素

Soini E等[8]在1983年首次將鑭系離子標記為示蹤螯合物引入到免疫分析領(lǐng)域，使鑭系元素(Lanthanide,Ln)和其螯合物在免疫層析檢測技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。Ln是一種具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性的金屬稀土元素，并有高化學(xué)穩(wěn)定性、發(fā)光強度高且穩(wěn)定及毒性低等優(yōu)點，是一類擁有廣闊應(yīng)用前景的新型發(fā)光生物標記納米材料[9]。鑭系元素與普通熒光相比其具有熒光衰變時間長、Stokes位移大和發(fā)射光譜窄等優(yōu)點。以鑭系元素及其螯合物為標記物應(yīng)用到免疫分析技術(shù)中，成為目前超微量物質(zhì)分析中最有發(fā)展前途的技術(shù)之一[10]。

目前，應(yīng)用最廣泛的解離增強鑭系熒光免疫分析(dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay,DELFIA)技術(shù)就是基于鑭系元素的優(yōu)點研發(fā)而來的。相關(guān)的研究如辛甜甜等[11]基于納米粒子的時間分辨熒光免疫法檢測日本鰻鱺的嗜水氣單胞菌的研究中，證明了基于納米粒子時間分辨免疫熒光法在顆粒性抗原檢測中的可行性。Juntunen E等[12]使用一種包埋銪的聚苯乙烯納米微球作為標記物的免疫層析技術(shù)進行生物親和性分析研究，在前列腺特異性抗原試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)銪納米微球的熒光檢測的靈敏度高于膠體金法300倍。但現(xiàn)在斕系摻雜發(fā)光納米微粒的研究仍處于初級階段，對其表面功能化和生物相容性的研究較少，且其合成工藝尚未成熟，因此其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用中仍存在一定的局限。

3 上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒

上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒(up-converting phosphor,UCP)于20世紀90年代開始用于生物分子標志物，是由兩種不同斕系元素離子摻雜于晶體中構(gòu)成的一類可將紅外光上轉(zhuǎn)換為可見光的特殊納米材料[13]。UCP具有“低能光激發(fā)、高能光發(fā)射”的上轉(zhuǎn)發(fā)光特征，并具備高穩(wěn)定性、高敏感性、簡便及安全等優(yōu)點，可適用于定量和多重分析，在實驗室或野外現(xiàn)場均可使用[14]。

上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析(up-converting phosphor technology based lateral-flow assay,UPT-LF)是近年來新興的將上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)(up-converting phosphor technology，UPT)與傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合的一種快速檢測技術(shù)，可以實現(xiàn)穩(wěn)定、靈敏、定量和無背景干擾的檢測[15]，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥品檢測等多種領(lǐng)域。與此同時，近年來以上轉(zhuǎn)發(fā)光納米顆粒作為生物示蹤物的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)的興起，使得傳統(tǒng)免疫層析的靈敏性、定量能力有了顯著提升[16-17]。李春鳳等[18]基于上轉(zhuǎn)發(fā)光轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)對于常見的4種食源性致病菌建立了快速檢測的方法，結(jié)果表明建立的快速檢測方法簡便快速，具有良好的敏感性、特異性和線性定量能力，操作性能可滿足食品安全檢測的要求。雷皖秋[19]利用該法定量檢測血液中的HBsAg，結(jié)果顯示其靈敏度為0.5 IU/mL，特異性為100%，但敏感性只有76.92%。UCP顆粒自問世及發(fā)展以來，應(yīng)用研究進展迅速，是目前免疫層析中應(yīng)用的標記物的熱點，但UCP顆粒需修飾活化后才能用于標記，且成本高，仍需要繼續(xù)探索和研究。

4 納米微球

Armes S P等[20]在20世紀80年代末初次合成了導(dǎo)電的CPANi水基乳膠溶液，通過采用新的聚合工藝技術(shù)制備納米導(dǎo)電聚苯胺乳膠微球。乳膠納米顆粒作為第一個被用于層析試紙條標記的探針，在免疫層析試紙技術(shù)中得到了有效的應(yīng)用。楊煌建等[21]通過采用聚合物納米微球分離純化放線菌素D的研究發(fā)現(xiàn)，納米微球作為層析填料的分離純化工藝，其純度與收率都較高，流程簡單、可行，為該產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。趙京偉等[22]研發(fā)了以熒光納米顆粒為標記物用于檢測O139群霍亂弧菌的免疫層析試紙條，檢測靈敏度為3.5×104CFU/mL。雖然納米微球在ICTSs標記中處于與膠體金相媲美的地位，但仍存在靈敏度不高等問題，還需進一步研究和改進。

5 量子點

量子點(quantum dots,QDs)也稱熒光半導(dǎo)體納米顆粒，其研究始于上世紀80年代，作為新興的熒光探針當前已廣泛應(yīng)用生物領(lǐng)域。如近年來的量子點免疫層析試紙條、免疫磁珠分離量子點多重免疫熒光分析、量子點熒光能量共振轉(zhuǎn)移、量子點標記生物傳感等[23]。Bruno J G[24]建立了高親和性的DNA適配體偶聯(lián)量子點側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l方法，用于單增生李斯特菌、沙門菌和大腸埃希菌的檢測，其靈敏度高于膠體金試紙條。Liu J等[25]通過EDC/NHS方法將CdTe量子點與氰戊菊酯單克隆抗體偶聯(lián)，建立檢測水及蔬菜中氰戊菊酯殘留的dcFLSA，該方法LOD達到25 ng/mL。雖然量子點用于生物標記中具有很多優(yōu)勢，但仍存在如量子點與生物分子的連接工藝不成熟、標記的QDs種類較少及檢測設(shè)備要求高等問題。

6 其他

近年來，碳納米顆粒(carbon nanoparticles，CNPs)已成為繼膠體金、乳膠顆粒等之后的重要 ICTSs 標記物[26]，其原理與膠體金相似，在應(yīng)用方面取得了很大的進展，研究重點正轉(zhuǎn)向大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域。研究表明，CNPs比傳統(tǒng)的膠體金及乳膠顆粒更靈敏。但CNPs在免疫標記中仍存在標記時間長、無法進行多元檢測等不足，此問題若得以解決，必使碳納米顆粒的應(yīng)用大放異彩。

熒光素衍生物是一種已廣泛應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中的標志物，如異硫氰酸酯熒光素(luoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)[27]。目前，由于有機納米粒子的熒光發(fā)射依靠于本身的化學(xué)發(fā)光集團，不具備可調(diào)控的尺寸效應(yīng)，該不足使它們在應(yīng)用上存在一些如靈敏度低、化學(xué)穩(wěn)定性差等問題，故正在被新型的標志物所替代。

7 結(jié)語

近年來，各種新型納米標記物的不斷出現(xiàn)，有效地促進了層析試紙條技術(shù)的快速發(fā)展。但這些新型納米標記物仍存在一些不足，需繼續(xù)研究探索，為新型納米材料試紙條的研發(fā)提供新的思路，相關(guān)的研究逐步深入并積極開展?？傊庖邔游鲈嚰垪l檢測技術(shù)已滲透進入生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)等各領(lǐng)域。相信通過免疫層析試紙條檢測技術(shù)的原理及條件的不斷優(yōu)化和改進，使之在生物檢測中有更廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

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Abstract:The new nano marker immunoassay technology is one of the point-of-care test technology rapidly developed and has widely applied in various fields in recent years,which gradually promotes the development of molecular biology and prevention and control of human and animal diseases,and has become the important contents in the field of bio-analysis.And the closely related nanomaterial markers are playing a leading role in the tests.With the development and optimization analysis of various new nano material markers, the detection technology is widely used in food quality inspection, inspection and quarantine, disease prevention and control so on. With the expansion of the field of bioanalysis, more markers such as magnetic nanoparticles, lanthanide, up-converting phosphor, nanospheres, quantum dots and so on have been prepared for use in more disease detection techniques.Based on the recent successful research, the principle and the development of several nano-bio-markers, and analysis of its diversity were briefly reviewed to provide effective reference for the related research.

Keywords:new immunoassay technology; nano-material biomarker; magnetic nanoparticle;quantum dot

ProgressonNewNanoMarkerImmunoassayTechnology

LIU Ya-dong,WANG Hui-yu,HAN Xue-qing

(AnimalQuarantineInstituteofChineseAcademyofInspectionandQuarantine，Beijing,100029，China)

S852.4

A

1007-5038(2017)08-0093-04

2017-01-18

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0500908)；公益性行業(yè)科研專項(201510017)

劉亞東(1991-)，女，河南周口人，碩士研究生，主要從事動物疫病防治與獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)研究。*