于 浩, 李 曄, 程全國(沈陽大學 環(huán)境學院, 遼寧 沈陽 110044)

土霉素降解菌的篩選及其降解條件優(yōu)化

于 浩, 李 曄, 程全國
(沈陽大學 環(huán)境學院, 遼寧 沈陽 110044)

利用富集培養(yǎng)的方法,將采自葫蘆島市某畜禽養(yǎng)殖堆肥場周邊土壤樣品進行分離純化并篩選出土霉素優(yōu)勢降解菌株(命名為YH1),通過形態(tài)觀察,菌落邊緣不整呈灰白色中心凸起似草帽狀,采用16S rDNA 基因序列分析該菌株為短波單胞菌屬(Brevundimonassp.),并對培養(yǎng)條件與降解特性進行優(yōu)化,該菌株在溫度30 ℃、pH值為6.0、土霉素質(zhì)量濃度300 mg/L、裝液量80 mL時,降解率最高可達到70.34%.此外,添加不同的碳源或氮源和金屬離子對菌株降解能力均有影響,其中加入2 g/L可溶性淀粉,麥芽糖時可提高菌株的降解率,添加1 g/L的Fe3+和Cu2+時可提高菌株的降解率;而Cd2+、Mn2+可明顯抑制其降解率.

土霉素; 微生物降解; 條件優(yōu)化; 16S rDNA

隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展過快,并且由于其養(yǎng)殖過程中所產(chǎn)生的糞便污染問題日趨嚴重,已經(jīng)威脅到農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展.四環(huán)素類抗生素結(jié)構(gòu)復雜,特別難降解,容易在水環(huán)境中積蓄,由于其廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中,對人類生存環(huán)境以及生態(tài)可持續(xù)發(fā)展影響深遠,世界許多國家已將抗生素污染列為重要的環(huán)境問題展開了相關(guān)的基礎(chǔ)研究[1].我國是抗生素使用和生產(chǎn)大國,每年抗生素的使用超過8 000 t用于動物養(yǎng)殖業(yè)[2].而作為畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用的一種廣譜抗生素土霉素,它作為四環(huán)素類抗生素,是全球銷量最大的抗生素類藥物之一,大量的應(yīng)用已導致藥品在環(huán)境中的大量殘留.根據(jù)藥物管理局和美國食品統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,美國在2011年用于國內(nèi)動物食品生產(chǎn)的抗菌劑超過1.35萬t[3],其中占美國畜禽養(yǎng)殖業(yè)使用總量42%的是四環(huán)素類抗生素,使用量達0.56萬t.在肯尼亞畜禽養(yǎng)殖業(yè)中四環(huán)素類抗生素使用總量占56%,使用量達14.6 t[4].四環(huán)素類抗生素是我國畜禽糞便中經(jīng)常檢出的抗生素類群,不同學者在北京、山東、上海、浙江、江蘇、吉林、陜西、寧夏等地的畜禽養(yǎng)殖場糞便中檢出四環(huán)素類抗生素殘留[5].本研究在葫蘆島市畜禽養(yǎng)殖場周邊土壤中分離出1株能對土霉素高效降解的菌株,本試驗對該菌株對土霉素的降解活性及生長條件等進行了研究.旨在為進一步消除環(huán)境中的土霉素殘留問題,畜禽糞便快速無害化處理技術(shù)提供一定的技術(shù)支撐,為后續(xù)的深入研究提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[6].

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品:葫蘆島市畜禽養(yǎng)殖堆肥場周邊土壤樣品用自封袋分裝后-20 ℃保存.基本理化性質(zhì)的測定:將樣品風干后,過篩,并準確稱取一定量過篩后的樣品,加入試劑消煮完畢冷后,移取消煮液至三角瓶中,采用常規(guī)方法進行測定.

表1 樣品的基本理化性質(zhì)測定Table 1 Determination of basic physical and chemical properties of samples

1.2 試 劑

土霉素原粉(100 mg/瓶),土霉素檢測試劑盒.三氯甲烷和正己烷均為國產(chǎn)分析純試劑.EDTA-Mcllvaine緩沖液(無水Na2HPO42.84 g,定容于100 mL,檸檬酸2.1 g,定容于100 mL,取上述檸檬酸溶液100 mL和Na2HPO462.5 mL混合后,調(diào)pH值至4.0,再加入6.05 g EDTA-二鈉,混勻,超聲溶解.)

滅菌無機鹽培養(yǎng)基:MgSO40.1 g,K2HPO41.79 g,KH2PO40.45 g,超純水1 L,pH7.4,121 ℃濕熱滅菌30 min.

富集培養(yǎng):土霉素母液加入滅菌后的無機鹽培養(yǎng)基中,使土霉素質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200 mg/L每7 d為一個馴化周期.將取回的土樣于37 ℃、165 r/min震蕩培養(yǎng),分別加入上述不同土霉素質(zhì)量濃度的富集培養(yǎng)其中,共馴化28 d.

1.3 菌株的初步篩選與分離純化

將上述富集培養(yǎng)后的菌液,取上清液0.2 mL涂布于含一定量土霉素的固體篩選培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),不斷地進行純化,直至得到單一穩(wěn)定的純菌株,之后將菌種進行編號保存.

1.4 形態(tài)觀察及菌株鑒定

將分離純化后得到的降解菌涂布于固體平板培養(yǎng)基上,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,通過菌落形狀、大小、顏色、表面特征觀察菌體形態(tài).

將培養(yǎng)后的純菌株采用Ezup柱式細菌基因組抽提試劑盒(SK8255)進行菌株DNA抽提,并將其作為模板,進行16S rDNA-PCR擴增,通用引物為27F/1492R,25 μL反應(yīng)體系,其擴增產(chǎn)物采用SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒回收.測序由上海生物工程有限公司進行,擴增片段全長1 323 bp,將所測的數(shù)據(jù)在Genebank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對.

1.5 菌株降解條件的優(yōu)化

分別采用不同培養(yǎng)條件初始pH值、溫度、接種量、通氣量、底物濃度、外加碳源、氮源、金屬離子等對檢測菌株生長情況以及土霉素降解速率的影響因素進行分析.以上每個處理均設(shè)3次重復.

1.6 土霉素降解能力的測定

將上述分離純化后的菌株分別加入配制好的土霉素不同質(zhì)量濃度的無機鹽培養(yǎng)基中,37 ℃、165 r/min震蕩培養(yǎng),取2 mL培養(yǎng)液,加入6 mL EDTA-Mcllvaine緩沖液,然后分別加入1 mL三氯甲烷,1 mL正己烷,搖晃2 min,超聲1 min使均質(zhì),5 000 r/min離心10 min,取上清液經(jīng)0.45 μm水系微孔濾膜過濾,濾液裝于2 mL離心管中,用于分析土霉素降解檢測.篩選出降解能力強的高活性優(yōu)勢菌株并進行菌種鑒定.

1.7 菌株生長情況檢測

采用微量紫外分光光度儀OD600 nm測定菌株含量.首先取處于對數(shù)期的菌株液體培養(yǎng)基于離心管中,離心棄上清,沉淀采用無菌生理鹽水洗滌,無菌水稀釋后上機測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

經(jīng)初篩與菌株的分離純化后,共篩選出5株能在較高質(zhì)量濃度土霉素富集培養(yǎng)基上生長的菌株,經(jīng)降解能力復篩后得到1株對土霉素降解能力最優(yōu)的菌株,命名為:YH1.對YH1菌株進行形態(tài)學觀察,菌落邊緣不整呈灰白色中心凸起似草帽狀,經(jīng)16S rDNA 基因序列分析后,根據(jù)其分類地位確定為短波單胞菌屬(Brevundimonassp.)(見圖1、圖2).

圖1 YH1菌株DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agrose gel electrophoresis of total DNA from YH1 strain

圖2 YH1菌株16S rFDNA PCR的擴增結(jié)果Fig.2 16S rDNA amplification fragment of YH1 strain

2.2 菌株的生長和土霉素降解條件優(yōu)化

2.2.1 溫度、pH值、通氣量、接種量、底物濃度和不同碳源、氮源

在不同的溫度和pH值下將菌株接種于篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)振蕩72 h后.結(jié)果表明,菌株的生長狀況良好并且最強降解率達69.34%和69.98%時培養(yǎng)溫度為30 ℃,pH值為6.0(見圖3、圖4).

圖3 溫度對YH1菌株降解土霉素能力的影響Fig.3 Effect of temperature on the degradation of oxytetracycline by YH1 strain

圖4 pH值對YH1菌株降解土霉素能力的影響Fig.4 Effect of pH value on the degradation of oxytetracycline by YH1 strains

好氧微生物生長的重要條件就是通氣量.本研究中采取裝液量的不同來改變250 mL三角瓶中的空氣量.以達到檢測不同通氣量影響的目的.結(jié)果表明,土霉素的降解速率最快可達70.34%;菌株生長質(zhì)量濃度為0.29 mg/mL時裝液量為80 mL(見圖5).所以,考慮和設(shè)計好最佳裝液量在實際降解應(yīng)用中是有意義的.

菌株的接種量也可以影響土霉素的降解效率,當細菌接種量為10 mL/L時,土霉素的降解速率最快達69.56%,隨著細菌接種量的增加,土霉素的降解速率逐漸降低(見圖6).本試驗選定10 mL/L為最佳接種量.菌株接種在不同質(zhì)量濃度土霉素的無機鹽培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h后,測定菌株的生長和對土霉素的降解情況.結(jié)果表明,當培養(yǎng)基中土霉素質(zhì)量濃度為300 mg/L時,土霉素降解率達67.71%;細菌生長質(zhì)量濃度達到最大為0.06 mg/mL(見圖7).

圖5 通氣量對菌株降解土霉素能力的影響Fig.5 Effect of ventilation rate on the degradation of oxytetracycline by strain

圖6 細菌接種量對菌株降解土霉素能力的影響Fig.6 Effect of bacterial inoculation amount on the degradation of oxytetracycline by strain

圖7 土霉素濃度對菌株降解土霉素能力的影響Fig.7 Effect of oxytetracycline concentration on the degradation of oxytetracycline by strain

在含土霉素300 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中,分別添加2 g/L的(葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖或蔗糖)作為唯一碳源,或2 g/L的(酵母浸液、牛肉膏或蛋白胨)作為唯一氮源;將接種后的菌株培養(yǎng)72 h后,測定每一處理后的菌株生長性況及其對土霉素的降解能力分析.結(jié)果表明,添加不同的碳源、氮源均有利于該菌株對土霉素的降解能力,其中加入蔗糖和麥芽糖可以明顯提高降解率,添加麥芽糖后降解率提高至71.89%,添加酵母浸液后降解率提高至64.91%;同時,添加可溶性淀粉和蛋白胨后,細菌生長質(zhì)量濃度也明顯增加,分別達到0.84和0.87 mg/mL(圖8).

2.2.2 金屬離子

環(huán)境中通常會含有一些金屬離子,它們會對微生物生長提供所需要的元素也可能對微生物降解底物產(chǎn)生抑制作用.本試驗在含土霉素300 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中分別添加1 g/L的金屬離子(Cu2+,Mn2+,Fe3+,Cd2+,Zn2+和Pb2+),在接種菌株,30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h后,測定菌株的生長和對土霉素的降解情況.結(jié)果表明,添加1 g/L的Cu2+和Fe3+可促進菌株的生長并提高對土霉素的降解率,如添加Fe3+,Cu2+降解率分別達72.21%和66.56%,菌株生長質(zhì)量濃度也分別達0.78和0.67 mg/mL,而重金屬離子Pb2+明顯抑制微生物的生長(圖9).

圖9 金屬離子對菌株降解土霉素能力的影響Fig.9 Effects of metal ions on the degradation of oxytetracycline by strain

3 結(jié) 論

(1) 采自葫蘆島市某畜禽養(yǎng)殖堆肥場周邊土壤,并從中分離得到1株土霉素高效降解菌YH1,經(jīng)過形態(tài)學觀察和16S rDNA基因序列分析,初步鑒定該菌株為短波單胞菌屬(Brevundimonassp.).

(2) 分別采用培養(yǎng)溫度30 ℃、pH6.0,土霉素質(zhì)量濃度300 mg/L,裝液量80 mL時,菌株能在72 h內(nèi)對質(zhì)量濃度為300 mg/L的土霉素降解67.71%以上.其中加入2 g/L可溶性淀粉,麥芽糖影響更顯著,土霉素降解分別為70.34%、71.89%,由此可見添加不同的碳源或氮源均有利于細菌對土霉素的降解.,由此可見金屬離子對菌株降解土霉素的速率亦有影響.當添加1 g/L的Fe3+和Cu2+時亦可提高菌株對土霉素的降解率分別為72.21%、66.56%,由此可見金屬離子對菌株降解土霉素的速率亦有影響.而Cd2+、Mn2+可明顯抑制細菌對土霉素的降解率.綜上所述該土霉素降解菌株具有環(huán)境適應(yīng)能力強,降解效率高,底物范圍廣等優(yōu)點.

菌株是來源于實際污染的土壤中進行分離純化而獲得的,一株能降解土霉素的短波單胞菌(Brevundimonassp.).由于本試驗是在室內(nèi)選擇不同的溫度、培養(yǎng)基pH值、底物濃度、通氣量、添加碳源或氮源及金屬離子等進行的研究該菌株對土霉素的降解作用,而在實際降解無害化處理過程中的影響因子更多,故對其能否在實際畜禽糞便無害化資源化處理過程中應(yīng)用還有待于進一步探討.根據(jù)新華社媒體報道,“十三五”規(guī)劃綱要中100個重大工程項目,包括開展1 000萬畝受污染耕地治理和4 000萬畝受污染耕地風險管理.個人認為,政策明確了土壤修復目標,特別是將此前被市場認為最缺乏盈利模式的耕地納入其中,體現(xiàn)出較大政策力度.本研究篩選的菌株對土霉素具有良好的降解效果,研究結(jié)果具有潛在的實際應(yīng)用價值,為進一步降解畜禽糞便中的土霉素奠定了基礎(chǔ),為后續(xù)的深入研究提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

[1] 張欣陽,蔡婷靜,許旭萍,等. 一株高效四環(huán)素降解菌的分離鑒定及其降解性能研究[J]. 生物 技術(shù)通報, 2015,31(1):173-180. (ZHANG X Y, CAI T J, XU X P, et al. Isolation and identification of a tetracycline-degrading bacterium and optimizing condition for tetracycline degradation[J]. Biotechnology Bulletin, 2015,31(1):173-180.)

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【責任編輯: 胡天慧】

Screening and Optimization of Degradation Condition of Oxytetracycline Degrading Bacteria

YuHao,LiYe,ChengQuanguo

(College of Environment, Shenyang University, Shenyang 110044, China)

An oxytetracycline-degrading strain from the soil of poultry breeding farms in Huludao City was isolated by enrichment culture method and its degradation conditions were optimized. The strain named YH1 was identified based on the morphology observation; the colony morphology was gray, irregular margin, and the center was raised like a straw hat. By 16S rDNA gene sequence, the preliminary identification suggested that the strain belonged to Brevundimonas sp. When the temperature was 30 ℃, pH was 6.0, and mass concentration of oxytetracycline was 300 mg/L, the degradation rate of the bacterial strain was up to 70.34%. Adding different carbon or nitrogen sources and metal ions had an impact on the degradation of strains; when 2 g/L soluble starch and maltose were added, the degradation rate of the strain was increased; when 1 g/L of Fe3+and Cu2+was added, the degradation rate of the strain was increased; while Cd2+and Mn2+could inhibit the degradation rate.

oxytetracycline; microbial degradation; condition optimization; 16S rDNA

2016-09-29

國家自然科學基金資助項目(31470552); 遼寧省教育廳資助項目( L2012405).

于 浩(1990-),男,遼寧沈陽人,沈陽大學碩士研究生.

2095-5456(2017)01-0021-05

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