甘 萍，譚永紅，金偉華，王玲潔，于波濤

(成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610083)

CJ016對人肺癌裸鼠移植瘤的抑制活性研究

甘 萍，譚永紅，金偉華，王玲潔，于波濤

(成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610083)

目的 研究CJ016對人肺癌模型的治療效果及其作用機制。方法 建立人肺腺癌細(xì)胞A549裸鼠移植瘤模型，考察CJ016體內(nèi)抑制腫瘤生長效果；同時將腫瘤進(jìn)行免疫組化檢測，考察其對腫瘤內(nèi)CD31和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 CJ016對A549細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，其IC50值為34.22 nmol·L-1；動物實驗表明其具有較好的腫瘤抑制效果，抑瘤率、T/C%值分別為70.08%和27.75%(20 mg·kg-1)；同時，CJ016能降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)CD31的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)論 CJ016能明顯抑制A549細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤生長，其可能的作用機制是減少血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

肺癌；作用機制；CJ016；A549；IC50；CD31；細(xì)胞凋亡

癌癥，即惡性腫瘤，是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。長期以來，體內(nèi)基因的表達(dá)異常如基因突變、缺失、重組以及擴增被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的起因。與此同時，越來越多的證據(jù)表明，除了基因序列的改變外，表觀遺傳的改變也會致使腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。其中值得注意的是，與基因突變相比，表觀遺傳的變化過程是可逆的。因此，調(diào)節(jié)或干預(yù)表觀遺傳漸漸成為治療腫瘤的一個很有吸引力的靶點[2-3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙酰化和去乙?；饔檬钦{(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的重要的表觀遺傳現(xiàn)象，這與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；饔梅謩e受到組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)的調(diào)節(jié)。其中，組蛋白去乙?；?HDAC)是一類能調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的蛋白酶。HDACs的主要作用是催化組蛋白氨基酸末端賴氨酸殘基的去乙酰化，導(dǎo)致染色質(zhì)凝結(jié)和轉(zhuǎn)錄抑制。此外，HDACs還能通過調(diào)節(jié)蛋白的乙?；癄顟B(tài)，影響蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾。腫瘤細(xì)胞中常見HDACs的表達(dá)異常，抑制腫瘤細(xì)胞中HDACs的活性，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長阻滯、分化或者凋亡，能夠從多通路、多靶點共同作用來阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因而HDAC抑制劑已漸漸成為抗腫瘤藥物研發(fā)中炙手可熱的靶點[6-8]。通過前期篩選工作，編號為CJ016的化合物被篩選出為最優(yōu)化合物，本文初步探索了化合物CJ016的體內(nèi)外抗腫瘤活性、作用靶點及抗腫瘤分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 CJ016來自本課題組；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、100×青霉素-鏈霉素混合液購自美國HyClone公司；胎牛血清購自內(nèi)蒙古呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司；紫杉醇注射液購自太極集團四川太極制藥有限公司；CD31抗體購自Santa Cruz公司；凋亡檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.1.2 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、數(shù)碼倒置顯微鏡、常溫離心機、全波長酶標(biāo)儀、石蠟切片機。

1.1.3 實驗動物和細(xì)胞株 BALB/c裸鼠，SPF級，♀，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號編號：SCXK(京)2014-0004；所用細(xì)胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由本實驗室培養(yǎng)并保種。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定CJ016對細(xì)胞生長的抑制作用 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，以3×107·L-1的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔100 μL，在5% CO2飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[1,4]。24 h后，加入不同濃度的CJ016處理，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。按每孔10%加入MTT(以PBS配成5 g·L-1)，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀上震蕩10 min，檢測490 nm處吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=(實驗組A值-陰性對照組A值)/(空白對照組A值-陰性對照組A值)×100%，并統(tǒng)計出IC50值，以上實驗重復(fù)3次(n=6)。

1.2.2 A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型建立 將A549細(xì)胞進(jìn)行傳代擴大培養(yǎng)，收集細(xì)胞并用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為每毫升2×107個細(xì)胞。于超凈工作臺內(nèi)，按0.1 mL每鼠接種于裸鼠右側(cè)腋下，待腫瘤體積超過100 mm3時開始進(jìn)行分組、給藥[5,12]。實驗分為5組：空白對照組，生理鹽水，尾靜脈注射，0.2 mL每鼠，2 d一次；陽性對照紫杉醇組，紫杉醇(paclitaxel,PTX)20 mg·kg-1，腹腔注射，7 d一次；CJ016給藥組(5、10、20 mg·kg-1)，尾靜脈注射，0.2 mL每鼠，2 d一次。給藥期間觀察并記錄裸鼠狀態(tài)，每2天測量腫瘤體積和裸鼠體重，給藥d 20時處死裸鼠，剖離腫瘤，稱重并計算抑瘤率(n=6)。

1.2.3 抗腫瘤活性評價方法 抑瘤率/%=(空白對照組腫瘤重量-治療組腫瘤重量)/空白對照組腫瘤重量×100%；腫瘤體積(tumor volume，TV)的計算公式為：TV=1/2×a×b2，其中a、b分別表示長寬。根據(jù)測量結(jié)果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV )，計算公式為：RTV=Vt/V0，其中V0為開始給藥時所測得腫瘤體積，Vt為每次測量時的腫瘤體積。同時計算出相對腫瘤增殖率(T/C%值)：T/C%=TRTV/CRTV×100%，其中TRTV為治療組相對腫瘤體積，CRTV為空白對照組相對腫瘤體積[9-10]。

1.2.4 免疫組化檢測 治療終點時，將瘤組織于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、滲蠟、包埋、切片，用CD31抗體進(jìn)行染色，觀察腫瘤組織中微血管密度(MVD)。按凋亡檢測試劑盒操作方法，經(jīng)酶處理、標(biāo)記、DBA顯色、蘇木精復(fù)染、鏡檢，凋亡細(xì)胞呈棕黃色，記錄腫瘤細(xì)胞凋亡情況(n=3)。

2 結(jié)果

2.1 CJ016對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用 實驗結(jié)果顯示，CJ016對多種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用，其中對肺癌細(xì)胞系最為敏感(Tab 1)。在多株肺癌細(xì)胞IC50結(jié)果均小于1 μmol·L-1，其中在A549細(xì)胞株的IC50值達(dá)34.22 nmol·L-1，顯示出較好的抑制作用。

2.2 CJ016體內(nèi)抗腫瘤藥效結(jié)果 腫瘤體積生長曲線和腫瘤重量稱量結(jié)果見Fig 1、Tab 2。由結(jié)果可以看出，CJ016在5 mg·kg-1時即顯示腫瘤抑制作用，體積測量和瘤重稱量結(jié)果與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.01)；同時，隨劑量增加抑制作用也相對增強，在20 mg·kg-1劑量時對腫瘤生長抑制作用最好，其抑瘤率達(dá)70.08%，超過陽性對照紫杉醇組(69.54%)，顯示出較好的抗腫瘤效果；此外，治療終點時，CJ016各劑量組裸鼠體重稱量結(jié)果較空白對照組下降值比紫杉醇組要小，實驗過程中裸鼠體重相對穩(wěn)定。

Tab 1 Effects of CJ016 on cell proliferation

Fig 1 Effects of CJ016 on growth of A549 cell transplantation tumor

1:Control,2:PTX(20 mg·kg-1),3:CJ016(5 mg·kg-1),4:CJ016(10 mg·kg-1),5:CJ016(20 mg·kg-1).**P<0.01vscontrol

Fig 2 The immunohistochemical results of CJ016 on tumor(10×)

A:CD31;B: Apoptosis.1:Control,2:PTX(20 mg·kg-1),3:CJ016(5 mg·kg-1),4:CJ016(10 mg·kg-1),5:CJ016(20 mg·kg-1)

GroupDose/mg·kg-1Bodyweight/gBeginEndTumorvolume/mm3BeginEndT/C%Tumorweight/gInhibition/%Control———19.62±1.1022.01±1.61133.72±24.251766.15±466.52———1.22±0.33———Paclitaxel2020.21±1.0117.16±2.01136.81±11.42524.36±186.44**28.610.37±0.09**69.54CJ016519.82±1.3219.91±1.46135.66±27.74813.57±356.22**37.630.62±0.13**49.181020.22±0.9420.01±1.41141.21±17.43739.23±378.89**33.160.54±0.09**55.602019.96±1.3619.34±1.70143.22±30.15497.18±199.07**27.750.37±0.11**70.08

**P<0.01vscontrol

2.3 免疫組化檢測結(jié)果 免疫組化檢測結(jié)果如Fig 2所示：治療終點時，CJ016各給藥組瘤體新生血管數(shù)目較空白對照組明顯減少(Fig 2A)，顯示出較好的抑制血管生成作用；同時，瘤體細(xì)胞凋亡數(shù)目與空白對照組比較明顯增加(Fig 2B)，說明CJ016對誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有一定的促進(jìn)作用。

3 討論

近年來，越來越多的努力已投入到HDAC抑制劑的開發(fā)中。目前，美國食品和藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)4種HDAC抑制劑上市，分別是：Vorinostat(SAHA)、Romidepsin、Panobinostat(LBH589)和Belinostat；而我國自主知識產(chǎn)權(quán)的亞型選擇性HDAC抑制劑西達(dá)苯胺(chidamide)已在全球獲準(zhǔn)上市[11]。這些HDAC抑制劑臨床上主要用于皮膚或外周T細(xì)胞淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤的治療，而對實體瘤的治療效果欠佳。為擴大HDAC抑制劑的抗瘤譜，本課題組合成了一系列新型HDAC抑制劑，并優(yōu)化得到編號為CJ016的小分子化合物，旨在用于實體瘤治療[13]。體外研究表明(Tab 1)，CJ016對多株人源腫瘤細(xì)胞株增殖有明顯抑制作用，對多株肺癌細(xì)胞IC50檢測結(jié)果均小于0.25 μmol·L-1。因此，本文選取A549細(xì)胞株(IC50=34.22 nmol·L-1)建立裸鼠移植瘤模型，探討其體內(nèi)抗腫瘤活性和可能的作用靶點。

HDAC抑制劑能通過調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，影響細(xì)胞基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的功能，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分化、衰老、生長停滯以及凋亡，并抑制血管生成。不同的HDAC抑制劑由于分子特征、選擇性、作用濃度和時間不同，其抗腫瘤的機制也會有差異。目前，已報道的文獻(xiàn)指出，HDAC抑制劑能夠抑制腫瘤細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)血管的生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡，同時也可直接作用非組蛋白，影響其乙?；癄顟B(tài)，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。此外，越來越多的證據(jù)表明，HDAC抑制劑可通過直接影響惡性腫瘤細(xì)胞使其成為更有吸引力的免疫靶標(biāo)，一定程度上加強宿主自身抗腫瘤免疫能力[14]。實驗結(jié)果表明(Fig 1、Tab 2)，CJ016對A549荷瘤小鼠腫瘤生長有明顯抑制作用，20 mg·kg-1劑量時抑瘤率達(dá)70.08%(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示(Fig 2)，CJ016各給藥組腫瘤細(xì)胞CD31表達(dá)明顯減少，其對瘤體周圍血管生成有明顯抑制作用；同時，瘤體細(xì)胞凋亡發(fā)生明顯增加，腫瘤細(xì)胞增殖被有效抑制，共同起到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。然而，CJ016抑制瘤體內(nèi)血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能的分子機制有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞的凋亡途徑主要包括死亡受體(細(xì)胞外)途徑和線粒體(細(xì)胞內(nèi))途徑，這兩個途徑均會誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)。大量的研究表明，HDAC抑制劑可激活多種腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員及其配體的轉(zhuǎn)錄，同時還能影響B(tài)cl-2家族基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的活性。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bim、Bmf、Bid等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1等)。Bcl-2家族基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的活性在線粒體凋亡途徑中起著重要作用[15]。因此，本課題組后續(xù)研究將圍繞CJ016對Caspase家族和Bcl-2家族相關(guān)蛋白的影響展開進(jìn)一步研究，以期更好地闡明其抑瘤機制。此外，裸鼠體重稱量結(jié)果顯示(Tab 2)，治療終點時，陽性藥紫杉醇組裸鼠體重較分組時明顯減少，而CJ016各給藥組裸鼠體重基本保持恒定，說明其在藥物刺激性和毒性反應(yīng)上具有優(yōu)勢。綜上，CJ016在治療肺癌方面效果較為明顯，且進(jìn)入體內(nèi)后未見明顯的不良反應(yīng)，其低毒、安全、有效的特點，頗具進(jìn)一步開發(fā)的價值。

(致謝：感謝四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室葉昊宇老師在移植瘤裸鼠模型建立及實驗過程中的悉心指導(dǎo)和幫助，并提供動物飼養(yǎng)場所。)

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Study of CJ016 in treatment of lung cancer

GAN Ping,TAN Yong-hong,JIN Wei-hua, WANG Ling-jie,YU Bo-tao

(DeptofPharmacy,GeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Chengdu610083,China)

Aim To study the therapeutic effect of CJ016 on human lung cancer model and the mechanism.Methods An experimental human lung adenocarcinoma model of A549 was set up to investigate the anti-tumor effect of CJ016, while the effect of angiogenesis and apoptosis in tumor were detected.ResultsInvitro,the cell proliferation was inhibited significantly by CJ016,and the value of IC50was 34.22 nmol·L-1.Invivo, the tumor inhibition rate and T/C% value were 70.08% and 27.75%, respectively, at the dose of 20 mg·kg-1.Meanwhile,CJ016 could reduce the expression of CD31 and promote the apoptosis of tumor cells.Conclusion CJ016 can inhibit the growth of A549 cells, and the possible mechanism may be related to the reduction of angiogenesis and inducing tumor cell apoptosis.

lung cancer; mechanism; CJ016; A549; IC50; CD31;apoptosis

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.036.html

2016-10-25,

2016-12-21

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(No 81402493)

甘 萍(1987-)，女，碩士，藥劑師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail：ganping_2007@163.com; 于波濤(1965-)，男，博士，主任藥師，通訊作者,E-mail：cj_yubotao@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.018

A

1001-1978(2017)03-0384-05

R-332；R329.25；R363-332；R73-352；R734.2；R916.4；R979.1