卓俊城，曾曉會(huì)，曾巧煌，陳玉興，蔡大可，姚 楠，甘海寧，張成哲

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510504;2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120;4.廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510095)

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

Triton WR-1399 通過(guò)影響VLDL-C代謝通路和RCT誘導(dǎo)急性HLP小鼠模型的研究

卓俊城1,2,4，曾曉會(huì)2,4，曾巧煌3，陳玉興2，4，蔡大可2,4，姚 楠2,4，甘海寧2,4，張成哲1,4

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510504;2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120;4.廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510095)

目的 觀察肌肉注射化學(xué)表面活化劑Triton WR-1399誘導(dǎo)小鼠急性高脂血癥模型，考察時(shí)效和量效關(guān)系，并從基因水平探討Triton WR-1399誘發(fā)高脂血癥動(dòng)物模型的機(jī)制。方法 用肌肉注射的方式分別給予小鼠0.4 g·kg-1，0.8 g·kg-1和1.5 g·kg-1的Triton WR-1399，取血時(shí)間點(diǎn)為24、32、48、56、72、80和96 h，觀察這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)的變化；采用熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)脂蛋白脂肪酶(LPL)，膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(LCAT)，膽固醇7-羥化酶(CYP7A1)，載脂蛋白AI(ApoAI)，載脂蛋白(ApoB)，低密度脂蛋白受體(LDLR)，B類Ⅰ型清道夫受體(SRB1)和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)的脂質(zhì)代謝相關(guān)通路基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化?；谀Ｐ蛷?fù)制方法考察，研究貝特類和他汀類代表藥物的調(diào)脂作用，驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性。結(jié)果 Triton WR-1399(0.8 g·kg-1，1.5 g·kg-1)劑量組的TC、TG和LDL-C水平明顯升高，LPL、LDLR、ApoB和SRB1的基因相對(duì)表達(dá)明顯降低，HMGCR的基因相對(duì)表達(dá)明顯升高；非諾貝特對(duì)該急性模型有明顯降脂作用。結(jié)論 采用肌肉注射0.8 g·kg-1Triton WR-1399所誘導(dǎo)的急性高脂血癥小鼠模型穩(wěn)定，可用于調(diào)脂藥物篩選，其誘導(dǎo)模型的機(jī)制可能與抑制VLDL-C代謝通路和阻斷膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程有關(guān)?；谠撃Ｐ偷陌l(fā)病機(jī)制，非諾貝特比瑞舒伐他汀表現(xiàn)出更為明顯的降脂作用。

Triton WR-1399；高脂血癥模型；基因表達(dá)；VLDL-C；HMGCR; LPL; 非諾貝特

高脂血癥(hyperlipidemia, HLP)，即脂質(zhì)代謝紊亂引起的多種脂質(zhì)水平異常，是導(dǎo)致脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管損害等多種疾病的重要因素[1]。因此，為篩選防治高脂血癥的藥物及其藥效評(píng)價(jià)提供有效且穩(wěn)定的動(dòng)物模型顯得尤為重要。Triton WR-1399是一種非離子表面活性劑，可用于復(fù)制急性小鼠高脂血癥動(dòng)物模型[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該模型產(chǎn)生機(jī)制主要與抑制脂蛋白脂酶活性有關(guān)[3]，但與脂質(zhì)相關(guān)通路其他靶標(biāo)的研究報(bào)道甚少，其誘發(fā)機(jī)制還需深入挖掘。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)制該模型所需造模劑的劑量和成模時(shí)間也是眾說(shuō)紛紜。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)旨在考察Triton WR-1399 誘導(dǎo)HLP小鼠模型的時(shí)效和量效關(guān)系，以及探討其誘發(fā)小鼠HLP模型的機(jī)制，為建立穩(wěn)定可行的急性小鼠HLP模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑 Triton WR-1399，SIGMA產(chǎn)品，Lot # MKBQ7986V。 膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒，批號(hào)20150815；甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒，批號(hào)20150815，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒，批號(hào)140501；低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)試劑盒，批號(hào)140461，均購(gòu)于中生北控生物科技股份有限公司。瑞舒伐他汀鈣片(rosuvastatin)，阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)129721；非諾貝特(fenofibrate)，法利博福尼制藥公司，批號(hào)23504。

1.2 儀器 IQTM5型熒光定量PCR儀、SmartSpec plus 核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；BS224S電子天平(1/萬(wàn))(德國(guó)SARTORIUS)；5450 型小型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)NIH小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量18 g～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)№44007200025983。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)SYXK(粵)2010-0059。

2 方法

2.1 肌注Triton WR-1399誘導(dǎo)小鼠急性高脂血癥模型的時(shí)效和量效關(guān)系考察 取SPF級(jí)NIH小鼠280只，♀♂各半，隨機(jī)均分為28組，即正常對(duì)照組，0.4、0.8、1.5 g·kg-1，每個(gè)劑量設(shè)置24、32、48、56、72、80、96 h時(shí)間點(diǎn)，每組10只。根據(jù)時(shí)間設(shè)置，造模前動(dòng)物禁食不禁水16 h，均肌肉注射不同劑量Triton WR-1399 造模，正常對(duì)照組同法肌肉注射等體積生理鹽水。動(dòng)物麻醉，眼眶靜脈叢取血，6 000 r·min-1離心10 min。

2.2 貝特類和他汀類代表藥物的降脂作用研究 取SPF級(jí)NIH小鼠40只，♀♂各半，隨機(jī)分為4組即空白對(duì)照組，模型組，非諾貝特組和瑞舒伐他汀組，每組10只。動(dòng)物連續(xù)給藥7 d，于d 5，動(dòng)物禁食不禁水16 h，均肌肉注射0.8 g·kg-1Triton WR-1399造模，正常對(duì)照組同法肌肉注射等體積生理鹽水。末日給藥1 h后，動(dòng)物麻醉，眼眶靜脈叢取血，6 000 r·min-1離心10 min。

2.3 血脂水平檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書，TC測(cè)定采用膽固醇氧化酶法；TG測(cè)定采用甘油磷酸氧化酶法；HDL-C測(cè)定采用磷鎢酸-鎂沉淀法；LDL-C采用聚乙烯硫酸沉淀法測(cè)定。

2.4 對(duì)小鼠肝臟基因表達(dá)的影響 各組小鼠取同一位置小塊肝臟100 mg，液氮下研磨，然后加入1 mL TRIzol試劑，混勻后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，在室溫下放置5 min。然后在4 ℃下12 000 r·min-1，離心10 min。取出上清液，轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入1/5體積的氯仿，用力混勻2 min，4 ℃下12 000 r·min-1，離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，放入-20℃冰箱靜置過(guò)夜。次日，取出在4 ℃下12 000 r·min-1，離心10 min。棄上清，沉淀用1 mL 75%的乙醇洗滌2次后，在室溫下干燥10 min。最后用200 μL滅菌超純水溶解沉淀，并且用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD260/OD280比值，算出RNA的濃度和純度。

反轉(zhuǎn)錄的操作按照Invitrogen公司M-MLV First Strand Kit提供的實(shí)驗(yàn)方法(下表)進(jìn)行，加入上述提取的總RNA，合成第一鏈 cDNA。

Tab 1 First strand cDNA synthesis

60 min reaction at 42 ℃，5 min reaction at 94℃，first-strand cDNA is obtained

根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)利用Primer5.0和Beacon Designer 7.91生物軟件，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。設(shè)計(jì)的引物序列如下表所示。

基因表達(dá)的檢測(cè)按照下表所示組分進(jìn)行添加，然后放入熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。

Tab 2 Information of augmented gene primers

Tab 3 Components of PCR reactions

將上述反應(yīng)混合物放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。步驟①：94 ℃×5 min；步驟②：94 ℃×30 s→55℃×30 s→72 ℃×50 s(45個(gè)循環(huán))；步驟③：72 ℃×7 min。每組10個(gè)樣品，分別取1 μL作為cNDA模板擴(kuò)增，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。具體計(jì)算公式為：

F=2-[(待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值)-

(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值)]

3 結(jié)果

3.1 模型復(fù)制的時(shí)效和量效考察結(jié)果

3.1.1 注射Triton WR-1399后小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的變化 如Tab 4，與空白對(duì)照組相比，Triton WR-1399各劑量組的動(dòng)物體質(zhì)量并無(wú)明顯變化；其肝臟重量在0.4 g·kg-1和1.5 g·kg-1劑量組明顯升高；各劑量組的肝臟指數(shù)與空白對(duì)照組的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1.2 注射Triton WR-1399后血脂水平的時(shí)效與量效關(guān)系 見(jiàn)Tab 5～8，與正常對(duì)照組比較，0.8 g·kg-1和1.5 g·kg-1劑量組的TG、TC和LDL-C水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)；前者的HDL-C水平有降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；后者能明顯降低HDL-C的水平(P<0.05或P<0.01)。0.4 g·kg-1劑量組對(duì)TG、TC、LDL-C和HDL-C水平均無(wú)影響(P>0.05)。

從Fig 1A～D可見(jiàn)，0.8 g·kg-1和1.5 g·kg-1劑量組的血脂水平變化趨勢(shì)基本一致。TG和TC水平大約在56 h時(shí)達(dá)到峰值，且在24～56 h趨于穩(wěn)定；0.8 g·kg-1劑量組的LDL-C在32 h左右達(dá)到峰值，之后隨著時(shí)間推移而呈下降趨勢(shì)；與之相對(duì)應(yīng)的HDL-C在32 h內(nèi)呈下降趨勢(shì)，其后隨時(shí)間推移上升并在56 h左右達(dá)到峰值，隨后下降；1.5 g·kg-1劑量組的LDL-C在48 h左右達(dá)到峰值，HDL-C在24 h達(dá)到最低值，之后隨著時(shí)間推移略微回升，72 h達(dá)到峰值，其后明顯下降(P<0.05或P<0.01)。

3.1.3 RT-qPCR檢測(cè)Triton WR-1399對(duì)脂質(zhì)代謝通路相關(guān)基因表達(dá)的影響 由Fig 2可見(jiàn)，與空白組相比，Triton WR-1399各劑量組能明顯地降低LPL基因表達(dá)水平(P<0.01)；0.8 g·kg-1和1.5 g·kg-1劑量組的ApoB基因相對(duì)表達(dá)也呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，LCAT和ApoA1基因相對(duì)表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

此外，在Triton WR-1399不同劑量的條件下，LDLR、HMGCR和CYP7A1基因表達(dá)水平在24～72 h之間呈現(xiàn)起伏波動(dòng)，分別于32 h和56 h到達(dá)峰值，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，于72 h之后趨于平穩(wěn)；與空白對(duì)照組相比，其中0.8 g·kg-1劑量組的SRB1、LDLR和HMGCR基因表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)；而CYP7A1在0.8 g·kg-1和1.5 g·kg-1劑量組條件下，呈現(xiàn)明顯波動(dòng)趨勢(shì)，分別于32 h和56 h到達(dá)峰值。

3.2 非諾貝特和瑞舒伐他汀對(duì)注射Triton WR-1399小鼠急性高脂血癥模型的影響 從Tab 9可以看出，與空白對(duì)照組相比，模型組的TC、TG和LDL-C的水平均上升，HDL-C水平下降(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，非諾貝特組的TC、TG和LDL-C水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；瑞舒伐他汀組降脂作用不明顯(P>0.05)。

4 討論

4.1 模型復(fù)制方法 該模型采用了肌肉注射的方式進(jìn)行誘導(dǎo)，比尾靜脈注射操作更加方便，可重復(fù)性高。與空白對(duì)照組相比，Triton WR-1399各劑量組的肝臟指數(shù)沒(méi)有明顯變化。

Fig 1 The time- dependent influence of different dosages of Triton WR-1399 on TG, TC, LDL-C and HDL-C level

GroupDosage/g·kg-1Bodyweight/gLiverweight/gLiverratio(×100)Control-24.08±1.281.58±0.146.57±0.61TritonWR-13990.424.78±1.431.65±0.166.65±0.570.824.65±1.311.61±0.196.52±0.721.524.43±1.431.60±0.176.56±0.52

Time/hGroupControl0.4g·kg-10.8g·kg-11.5g·kg-1245.77±0.976.94±0.9513.67±3.92*14.02±4.86325.91±0.567.24±2.1814.66±3.42**16.10±3.82**485.68±1.097.32±1.7217.24±4.57**25.20±4.37**565.80±1.697.52±0.4418.59±4.17**25.42±5.42**725.28±1.607.04±1.027.25±3.2922.95±5.04**805.62±1.585.10±0.584.65±0.959.67±3.98965.96±1.204.46±0.81**4.78±1.27**4.43±0.66**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Time/hGroupControl0.4g·kg-10.8g·kg-11.5g·kg-1241.28±0.411.04±0.6726.06±3.92**28.37±9.70*321.51±0.480.81±0.5225.06±2.92**34.68±7.74**481.20±0.401.22±0.4028.13±3.86**37.09±2.88**561.58±0.590.97±0.3328.14±7.60**36.94±1.28**721.22±0.560.88±0.715.55±4.15*33.71±4.27*801.18±0.541.51±0.331.69±0.507.33±5.08**961.51±0.442.20±0.411.34±0.391.40±0.54

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Time/hGroupControl0.4g·kg-10.8g·kg-11.5g·kg-124h0.76±0.151.03±0.21 3.88±0.90**4.44±5.0732h1.01±0.681.61±0.488.69±2.77*5.53±5.9848h1.09±0.912.59±0.776.96±2.02**8.87±8.80**56h1.05±0.712.21±0.984.90±2.14**5.83±6.69**72h0.93±0.382.17±0.66**2.84±0.90**6.45±6.7680h1.38±0.472.18±0.511.44±0.952.75±2.8096h1.18±0.781.37±0.261.46±1.540.58±0.63

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

4.2 Triton WR-1399 對(duì)HLP小鼠模型血脂水平的量效和時(shí)效影響 與空白組相比，不同劑量的Triton WR-1399對(duì)血脂水平的影響呈量效關(guān)系，其中0.8 g·kg-1和1.5 g·kg-1劑量組血脂水平(TC、TG和LDL-C)明顯升高，說(shuō)明模型誘導(dǎo)成功。從時(shí)效曲線的結(jié)果可見(jiàn)，血脂水平(TC、TG)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，于32～56 h間出現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Triton WR-1399誘導(dǎo)急性小鼠HLP模型呈劑量和時(shí)間依賴性，選擇合適的劑量進(jìn)行誘導(dǎo)，且在血脂水平處于相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)期即32～56 h之間，將更能可靠的呈現(xiàn)調(diào)血脂藥物的療效評(píng)價(jià)效果。

Tab 8 The time-dependent influence of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

4.3 Triton WR-1399 對(duì)HLP小鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)的影響 由結(jié)果可知，肌肉注射不同劑量的Triton WR-1399脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)情況各異。結(jié)合Fig 3脂質(zhì)代謝關(guān)鍵通路圖分析，0.8 g·kg-1在32 h～56 h內(nèi)，明顯地下調(diào)了LPL、LDLR、ApoB和SRB1的基因相對(duì)表達(dá)，ApoA1、LCAT、CYP7A1和HMGCR的水平也呈下調(diào)趨勢(shì)。有文獻(xiàn)報(bào)道Triton WR-1399能抑制LPL的活性和其轉(zhuǎn)錄水平[4]，與本研究結(jié)果一致，從而使VLDL-C水解受阻，大量的堆積導(dǎo)致血中TG和TC水平升高；ApoB是VLDL-C與LDL-C的主要載脂蛋白，可以識(shí)別LDLR[5-6]，結(jié)果顯示其mRNA表達(dá)下調(diào)，表明LDL-C代謝通路受阻，使與之結(jié)合的TC無(wú)法被肝細(xì)胞的LDLR攝取分解成FC，從而上調(diào)了HMGCR的活性和mRNA的表達(dá)[7-8]，使得內(nèi)源性FC合成增加[8]，然而FC對(duì)HMGCR的活性有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，當(dāng)內(nèi)源性FC能滿足細(xì)胞內(nèi)的需求時(shí)，HMGCR的活性或基因表達(dá)則會(huì)下調(diào)。

結(jié)果顯示Triton WR-1399能夠使LCAT基因相對(duì)表達(dá)下調(diào)，使得LCAT在HDL表面催化FFA從卵磷脂轉(zhuǎn)移至FC生成CE這一過(guò)程被阻斷，無(wú)法向成熟的HDL-C轉(zhuǎn)化，從而影響膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)通路[9-10]。同時(shí)，作為L(zhǎng)CAT的輔助因子，ApoA1的mRNA下調(diào)，使其激活受到影響，進(jìn)一步影響HDL-C的發(fā)育成熟；肝細(xì)胞的SRB1可以攝取分解未與LDLR結(jié)合的LDL-C以及HDL-C[11]，當(dāng)SRB1的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，導(dǎo)致攝取CE的過(guò)程被阻斷；進(jìn)入肝臟后的FC可以被CYP7A1轉(zhuǎn)化成膽汁酸外排以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的膽固醇流量[12]，完成膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，從結(jié)果可看出，注射Triton WR-1399后其活性及其mRNA表達(dá)先升高，這可能與其肝臟代償性表現(xiàn)有關(guān)，32 h之后隨著時(shí)間的推移其表達(dá)下降，膽固醇代謝去路受阻，進(jìn)一步加劇TC的滯留。

GroupIndexesTG/mmol·L-1TC/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1Control2.14±0.744.16±0.812.85±0.821.23±0.35Model24.76±7.74**15.66±4.56**6.26±3.26*0.72±0.39**Rosuvastatin22.17±6.0213.97±5.194.95±2.801.23±0.17##Fenofibrate2.08±0.95##6.65±1.70**##3.09±1.03#1.28±0.74##

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

Fig 2 Influence of different dosages of Triton WR-1399 on relative gene expression in HLP mice models*P<0.05,**P<0.01 vs control group

綜上所述，Triton WR-1399 誘導(dǎo)急性HLP小鼠模型的機(jī)制可能通過(guò)影響VLDL-C代謝通路和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[13]，使得TG和TC滯留在血液中，CE無(wú)法充分地被肝細(xì)胞的LDLR和SRB1攝取分解成FC以滿足自身所需，導(dǎo)致內(nèi)源性膽固醇合成途徑被激活，從而進(jìn)一步升高TC和TG在體內(nèi)的水平[14]。

Fig 3 Influence of Triton WR-1399 onpathway of endogenous lipid metabolic mechanism

4.4 貝特類和他汀類代表藥物對(duì)肌注Triton WR-1399小鼠急性高脂血癥模型的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型復(fù)制方法穩(wěn)定可靠，我們選擇了降脂作用靶點(diǎn)明確的貝特類和他汀類代表藥物—非諾貝特和瑞舒伐他汀作為研究對(duì)象，觀察其降脂效果。

本研究結(jié)果初步證實(shí)，Triton WR-1399 誘導(dǎo)急性HLP小鼠模型的機(jī)制可能與選擇性地抑制了LPL的活性以及阻斷膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，導(dǎo)致TG和TC在體內(nèi)大量蓄積，從而誘發(fā)高脂血癥?；谠撃Ｐ偷难芯?，發(fā)現(xiàn)非諾貝特降脂效果明顯，而瑞舒伐他汀并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的降脂作用。眾所周知，非諾貝特為第3代苯氧芳酸類調(diào)脂藥，為PPAR-α的激動(dòng)劑[15]，通過(guò)調(diào)節(jié)下游脂肪組織和骨骼肌中LPL的活性，從而加快富含TG的脂蛋白分解代謝，降低T G水平[16]；非諾貝特還可升高HDL-C水平，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，降低TC[17-18]。而瑞舒伐他汀作為新一代他汀類藥物，可高度選擇性地抑制HMGCR活性，減少TC合成，從而實(shí)現(xiàn)降血脂作用[19]，然而本模型中不同劑量Triton WR-1399組的HMGCR基因表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)明顯的起伏變化，其中0.8 g·kg-1劑量組HMGCR基因表達(dá)在有效篩選藥效時(shí)間內(nèi)代償性上調(diào)后呈下調(diào)趨勢(shì)，使得他汀類藥物無(wú)法發(fā)揮其調(diào)脂藥效。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院中藥藥理研究室和廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，感謝陳玉興老師、曾曉會(huì)老師、蔡大可老師、姚楠老師、甘海寧師兄、曾巧煌師姐和張成哲同學(xué)的幫助與支持。)

[1] 趙 嚴(yán), 胡國(guó)勇, 柯愛(ài)武,等. 高脂血癥動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J]. 中華胰腺病雜志, 2011, 11(4):295-7.

[1] Zhao Y, Hu G Y, Ke A W. et.al. Research progress of hyperlipidemia animal model[J].ChinJPancreatol,2011, 11(4):295-7.

[2] 翟羽佳, 陳邦添, 李善兵,等. Triton WR-1339誘發(fā)小鼠高脂血癥模型的研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2011, 27(8):1178-80.

[2] Qu Y J, Chen B T, Li S B,et al. Study on hyperlipoidemia model induced by Triton WR-1339 in mice[J].ChinPharmacolBull, 2011, 27(8):1178-80.

[3] 余艷輝, 文 軍, 郭兆貴. Triton WR-1339對(duì)小鼠血脂水平的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2002, 18(5):599-600.

[3] Yu Y H, Wen J, Guo Z G. Effects of Triton WR-1339 on blood-lipids of mice[J].ChinPharmacolBull, 2002, 18(5):599-600.

[4] Takahashi Y,Inaba N,Kuwahara S.Antioxidative effect of citrus essential oil components on human low-density lipoproteininvitro[J].BiosciBiotechnolBiochem,2003,67:195-7.

[5] 胡源岙. 根皮苷激活脂蛋白脂酶改善實(shí)驗(yàn)性高甘油三酯血癥[D].暨南大學(xué), 2013.

[5] Hu Y A. Effects of phloridzin on experimental hypertriglyceridemia by activating lipoprotein lipase[D].Jinan University,2013.

[6] 宋 鑫, 高南南, 楊潤(rùn)梅,等. 豚鼠高脂血癥模型LDL-C代謝紊亂的機(jī)制研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2012, 28(3):342-6.

[6] Song X, Gao N N, Yang R M. et al. Mechanism of hyperlipidemia LDL-C metabolic disorder in the guinea pig[J].ChinPharmacolBull, 2012, 28(3):342-6.

[7] Kou S,Han B,Wang Y,et al.Synergetic cholesterol-lowering effects of main alkaloids from Rhizoma Coptidis in HepG2 cells and hypercholesterolemia hamsters[J].LifeSci,2016,151:50-60.

[8] Hu H J,Luo X G,Dong Q Q,et al.Ethanol extract of Zhongtian hawthorn lowers serum cholesterol in mice by inhibiting transcription of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase via nuclear factor-kappa B signal pathway[J].ExpBiolMed(Maywood),2016,241:667-74.

[9] 李向榮,陳菁菁, 劉曉光. 桑葉總黃酮對(duì)高脂血癥動(dòng)物的降血脂效應(yīng)[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志,2009,44(21):1630-3.

[9] Li X R,Chen Q Q,Liu X G. Lipid lowering activity of total flavonoids from mulberry leaves in two hyperlipidemic animal models[J].ChinPharmaJ, 2009, 44(21):1630-3.

[10]顧 清, 周朋輝, 張靜姝,等. 核黃素對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的影響[J]. 中國(guó)慢性病預(yù)防與控制, 2015, 23(1):34-6.

[10]Gu Q, Zhou P H, Zhang J S. et al. The effects of riboflavin on lipid metabolism in rats with hyperlipidemia[J].ChinJPreventControlChronDis,2015, 23(1):34-6.

[11]Prashanth A,Jeyakumar S M,Giridharan N V.Vitamin A-enriched diet modulates reverse cholesterol transport in hypercholesterolemic obese rats of the WNIN/Ob strain[J].JAtherosclerThromb,2014,21:1197-207.

[12]Schurr P E,Schultz J R.Triton-induced hyperlipidemia in rats as an animal model for screening hypolipidemic drugs[J].Lipids,1972,7:68-74.

[13]Davidson M H,Voogt J,Luchoomun J,et al.Inhibition of intestinal cholesterol absorption with ezetimibe increases components of reverse cholesterol transport in humans[J].Atherosclerosis,2013,230:322-9.

[14]Cao P,Pan H,Xiao T,et al.Advances in the study of the antiatherogenic function and novel therapies for HDL[J].IntJMolSci,2015,16:17245-72.

[15]Zhang Y,Cui Y,Wang X L,et al.PPARα/γ agonists and antagonists differently affect hepatic lipid metabolism, oxidative stress and inflammatory cytokine production in steatohepatitic rats[J].Cytokine,2015,75:127-35.

[16]閆冬梅. 非諾貝特作用機(jī)制的進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南, 2012, 10(21):467-9.

[16]Yang D M. Advances in mechanism of fenofibrate[J].GuideChinaMed, 2012, 10(21):467-9.

[17]Ferreira E S,Silva M A,Demonte A.β-conglycinin combined with fenofibrate or rosuvastatin have exerted distinct hypocholesterolemic effects in rats[J].LipidsHealthDis,2012,11:11.

[18]初欣欣, 楊潤(rùn)梅, 于 瑩,等. 金黃地鼠高脂血癥模型甘油三酯代謝紊亂的生物標(biāo)志物的研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2014,30(7):1012-7.

[18]Chu X X, Yang R M, Yu Y,et al. Triglyceride disorder biomakers in hyperlipidemia hamsters[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(7):1012-7.

[19]李玉霞, 江 珊. 瑞舒伐他汀的研究進(jìn)展[J]. 心血管病學(xué)進(jìn)展, 2010, 31(4):585-8.

[19]Li Y X, Jiang S. Advances in research of rosuvastatin[J].AdvCardiovaDis, 2010, 31(4):585-8.

Study on hyperlipidemia mice models induced by Triton WR-1399 via VLDL-C metabolic pathway and reverse cholesterol transport

ZHUO Jun-cheng1,2,4, ZENG Xiao-hui2,4, ZENG Qiao-huang3,CHEN Yu-xing2,4, CAI Da-ke2,4, YAO Nan2,4,GAN Hai-ning2,4, ZHANG Cheng-zhe1,4

(1.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510504,China;2.GuangdongProvinceEngineeringTechnologyResearchInstituteofT.C.M,Guangzhou510095,China;3.TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510120,China；
4.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentinTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510095,China)

Aim To investigate the time and dosage-dependent relationship in Triton WR-1399 -induced acute hyperlipidemia mice models and explore the underlying mechanism in gene relative expression.Methods Mice were given different dosages of Triton WR-1399(0.4 g·kg-1, 0.8 g·kg-1, 1.5 g·kg-1) through im and blood was collected at different time(24 h,32 h,48 h,56 h,72 h,80 h and 96 h) to observe the changes of TG,TC,LDL-C and HDL-C in HLP mice models. RT-qPCR was utilized to detect gene relative expression of LPL,LDLR,ApoA1,ApoB,LCAT,SRB1,CYP7A1 and HMGCR. To verify stability of this model, fenofibrate and rosuvastatin were adapted to investigate the mechanism of lipid regulation based on the exploration of acute HLP mice models.Results Triton WR-1399(0.8 g·kg-1,1.5 g·kg-1) could significantly reduce the level of TC,TG,LDL-C and enhance the content of HDL-C. In addition, it obviously inhibited the gene relative expression of LPL, LDLR, ApoB andSRB1, while HMGCR was significantly enhanced.Fenofibrate showed noble hypolipidemic efficacy in this model.Conclusions The effective time range for screening low-cholesterol is 24 h～32 h after intramuscular injection of Triton WR-1399(0.8 g·kg-1) and the underlying mechanism is likely associated with inhibition of metabolic pathway of VLDL-C and block of the reverse cholesterol transport. Based on the mechanism of acute HLP mice models,fenofibrate performs stronger hypolipidemic efficacy than rosuvastatin.

Triton WR-1399; hyperlipidemia model; gene expression; VLDL-C; HMGCR; LPL; fenofibrate

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.052.html

2016-10-08,

2016-12-08

廣東省科技廳資助項(xiàng)目(No 2015A040404030，2014A070705014，2013B060300034)；廣東省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(No 20151013，20152006，20161026，20141028)

卓俊城(1993-)，男，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：boyce0118@126.com; 陳玉興(1971-)，男，主任中藥師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：tcmgdp@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.026

A

1001-1978(2017)03-0433-07

R-332；R344；R363-332；R589.2；R965.1；R972.6；R977.6