張玲敏，謝 娟，李龍寬，廖榮華，邱鐘燕（.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 55000；2.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴陽 550002；.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，貴陽 558000；.貴州省人民醫(yī)院兒科，貴陽550002）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定人血漿中丙戊酸鈉及其代謝產(chǎn)物的濃度Δ

張玲敏1＊，謝 娟2#，李龍寬3，廖榮華1，邱鐘燕4（1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴陽 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，貴陽 558000；4.貴州省人民醫(yī)院兒科，貴陽550002）

目的：建立同時(shí)測(cè)定人血漿中丙戊酸鈉（VPA）及其代謝產(chǎn)物2-丙基-2-戊烯酸（2-ene-VPA）濃度的方法。方法：血漿樣品經(jīng)環(huán)己烷沉淀蛋白后，用2，4′-二溴苯乙酮進(jìn)行衍生化，以正辛酸為內(nèi)標(biāo)，采用反相高效液相色譜法測(cè)定。色譜柱為Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為乙腈-水（65∶35，V/V），流速為1 mL/min，柱溫為35⑥，紫外檢測(cè)波長為258 nm，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：VPA、2-ene-VPA血藥濃度分別在5.0～200.0、0.5～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r均為0.999 9，n＝5），定量下限分別為5.0、0.5 μg/mL；日內(nèi)、日間RSD均小于5%，方法回收率分別為95.99%～98.80%、97.40%～98.17%，提取回收率分別為80.46%～86.23%、80.45%～85.61%。采用該法測(cè)得10例癲癇患兒VPA血藥濃度為27.4～93.2 μg/mL，2-ene-VPA血藥濃度為0.85～3.94 μg/mL。結(jié)論：該方法操作簡便、專屬性強(qiáng)，可用于VPA血藥濃度檢測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究。

丙戊酸鈉；2-丙基-2-戊烯酸；反相高效液相色譜法；衍生化；血藥濃度

丙戊酸鈉（Sodium valproate，VPA）是臨床上治療單純或復(fù)雜失神發(fā)作、肌陣攣發(fā)作、全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作的一線廣譜抗癲癇藥，其有效治療濃度為50～100 μg/mL[1]。由于其給藥劑量與血藥濃度呈非線性動(dòng)力學(xué)關(guān)系[1-2]，且治療窗窄、個(gè)體差異大，故需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)以及時(shí)調(diào)整患者個(gè)體化給藥方案，從而保證治療效果、減少藥品不良反應(yīng)的發(fā)生[3-4]。VPA主要經(jīng)3條途徑代謝，其中由線粒體β氧化代謝途徑生成的2-丙基-2-戊烯酸（2-Propyl-2-pentenoic acid，2-ene-VPA）被認(rèn)為是比VPA抗癲癇及鎮(zhèn)靜作用更強(qiáng)的物質(zhì)，但可能存在損傷神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。由于2-ene-VPA的半衰期長且可通過血腦屏障，故懷疑其可能與患者服用VPA所致的頭暈、嗜睡、腦水腫、長時(shí)間昏迷、神經(jīng)毒性和VPA腦病等不良反應(yīng)相關(guān)[7]。有研究者采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定2-ene-VPA的血藥濃度，或采用氣質(zhì)聯(lián)用（GCMS）法同時(shí)測(cè)定VPA和2-ene-VPA的血藥濃度[1，8]。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了同時(shí)測(cè)定VPA和2-ene-VPA血藥濃度的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，以期為VPA及其代謝產(chǎn)物的藥動(dòng)學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；TGL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海梅香儀器有限公司，離心半徑為5.1 cm）；SC-3610型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，離心半徑為16.0 cm）；SMARTN15UV型純水儀（上?？道追治鰞x器有限公司）；TDA-8002型水浴鍋（河北省黃驊航天儀器廠）；AL204型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；XH-B型漩渦混合器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）。

1.2 藥品與試劑

VPA對(duì)照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：J1115AS，純度≥99%）；2-ene-VPA對(duì)照品（加拿大Toronto Research Chemicals，批號(hào)：5-JHY-61-1，純度≥98%）；正辛酸對(duì)照品[內(nèi)標(biāo)，生工生物工程（上海）有限公司，批號(hào)：SJ1211S0513J，純度：＞99%]；2，4′-二溴苯乙酮（衍生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：19703，純度：＞98%）；乙腈為色譜純，三乙胺為分析純，水為超純水；空白血漿由貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（65∶35，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：35⑥，進(jìn)樣器溫度：20⑥；紫外檢測(cè)波長：258 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 VPA標(biāo)準(zhǔn)工作液 精密稱取VPA對(duì)照品100 mg，用甲醇溶解并稀釋，得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的VPA貯備液，于－20⑥冰箱中保存。臨用前用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、5 mg/mL的VPA標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

2.2.2 2-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)工作液 精密稱取2-ene-VPA對(duì)照品5 mg，用甲醇溶解并稀釋，得質(zhì)量濃度為5 mg/mL的2-ene-VPA貯備液，于－20⑥冰箱中保存。臨用前用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200、400、500 μg/mL的2-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品100 mg，用甲醇溶解并稀釋，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，于－20⑥冰箱中保存。臨用前用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.4 衍生化試劑 精密稱取2，4′-二溴苯乙酮500 mg至50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的衍生化試劑，于4⑥密封保存。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品250 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL和2 mol/L硫酸10 μL，渦旋混勻2 min，加入環(huán)己烷1 mL，渦旋混勻10 min，以轉(zhuǎn)速16 000 r/min高速離心10 min。吸取全部上清液置于2 mL EP管中，分別加入衍生化試劑和三乙胺各50 μL，混勻，于70⑥下以氮?dú)饬鲹]干，殘?jiān)靡译?00 μL復(fù)溶，加入衍生化試劑10 μL和三乙胺3 μL，渦旋混勻，置于80⑥水浴中反應(yīng)30 min，加乙腈至總體積為200 μL，混勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，2-ene-VPA、VPA與內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，2-ene-VPA、VPA和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為11.5、14.3、15.2 min，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與定量下限考察 取空白血漿、相應(yīng)質(zhì)量濃度VPA標(biāo)準(zhǔn)工作液和2-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)工作液各適量，分別配制成VPA質(zhì)量濃度為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、200.0 μg/mL，2-ene-VPA質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg/mL的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為yVPA＝0.224 5xVPA+0.192 5（r＝0.999 9，n＝5），y2-ene-VPA＝0.292 0 x2-ene-VPA+0.150 2（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，VPA和2-ene-VPA血藥濃度分別在5.0～200.0、0.5～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限分別為5.0、0.5 μg/mL（信噪比＞5）[9]。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別配制VPA低、中、高質(zhì)量濃度（10.0、40.0、160.0 μg/mL）和2-ene-VPA低、中、高質(zhì)量濃度（1.0、4.0、16.0 μg/mL）的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，各樣品重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日內(nèi)、日間精密度；以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度比較，計(jì)算方法回收率，考察方法準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，VPA各質(zhì)量濃度血漿樣品日內(nèi)RSD為1.66%～4.11%，日間RSD為1.05%～2.95%，方法回收率為95.99%～98.80%；2-ene-VPA各質(zhì)量濃度血漿樣品日內(nèi)RSD為2.04%～4.70%，日間RSD為0.25%～1.03%，方法回收率為97.40%～98.17%。精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

表1 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

待測(cè)物 理論質(zhì)量濃度，μg/mL方法回收率，% VPA 2-ene-VPA 10．0 40．0 160．0 1．0 4．0 16．0日內(nèi)精密度實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，μg/mL 9．65±0．16 38．40±1．58 156．16±4．88 0．97±0．05 3．92±0．08 15．55±0．37 RSD，% 1．66 4．11 3．13 4．70 2．04 2．38日間精密度實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，μg/mL 9．66±0．25 38．62±1．14 158．08±1．66 0．97±0．01 3．93±0．01 15．63±0．14 RSD，% 2．59 2．95 1．05 1．03 0．25 0．90 96．55 95．99 98．80 97．40 98．17 97．67

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 分別配制VPA低、中、高質(zhì)量濃度（10.0、40.0、160.0 μg/mL）和2-ene-VPA低、中、高質(zhì)量濃度（1.0、4.0、16.0 μg/mL）的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，得色譜峰面積A；空白血漿經(jīng)4倍體積環(huán)己烷萃取后，取上清液，分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度VPA、2-ene-VPA的標(biāo)準(zhǔn)工作液各適量，使最終質(zhì)量濃度與前者相對(duì)應(yīng)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，得色譜峰面積B，計(jì)算提取回收率（A/B×100%）。結(jié)果顯示，VPA各質(zhì)量濃度血漿樣品的提取回收率分別為86.23%、82.81%和80.46%，2-ene-VPA各質(zhì)量濃度血漿樣品的提取回收率分別為80.45%、82.22%和85.61%，內(nèi)標(biāo)的提取回收率為81.83%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別配制VPA低、中、高質(zhì)量濃度（10.0、40.0、160.0 μg/mL）和2-ene-VPA低、中、高質(zhì)量濃度（1.0、4.0、16.0 μg/mL）的血漿樣品各5份，分別考察其在室溫放置0、6、12、24 h，反復(fù)凍融3次，－80②冰凍放置0、10、30 d的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在上述條件下，VPA各質(zhì)量濃度血漿樣品的回收率為97.04%～100.65%、95.04%～98.83%、95.04%～100.79%，2-ene-VPA各質(zhì)量濃度血漿樣品的回收率為94.55%～101.63%、97.40%～100.97%、95.15%～100.24%，RSD＜5%，表明血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.5 臨床應(yīng)用血藥濃度監(jiān)測(cè)

采用上述RP-HPLC法測(cè)定10例癲癇患兒血漿中VPA和2-ene-VPA的濃度。選擇以VPA治療2個(gè)月以上的患兒，于末次給藥后次日晨起靜脈采血2 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min低速離心5 min，取上清液按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，10例癲癇患兒VPA血藥濃度為27.4～93.2 μg/ mL；2-ene-VPA的血藥濃度為0.85～3.94 μg/mL，其中有1例患兒的血藥濃度低于定量下限，詳見表2。

表2 10例癲癇患兒VPA和2-ene-VPA血藥濃度Tab 2 Plasma concentrations of VPA and 2-ene-VPA in 10 epileptic children

3 討論

VPA是含有8個(gè)碳的短鏈脂肪酸，因其沒有可產(chǎn)生紫外吸收光譜的結(jié)構(gòu)，用HPLC法難以直接測(cè)定[10]。本研究以2，4′-二溴苯乙酮作為衍生化試劑，對(duì)VPA和2-ene-VPA進(jìn)行衍生化，使其攜帶紫外特征吸收基團(tuán)，能夠在紫外光下被檢測(cè)。通過二極管陣列檢測(cè)器掃描，最終確定其最大吸收波長為258 nm，且該波長下待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)分離良好，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)其測(cè)定無明顯干擾。

在內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的篩選中，筆者分別考察了庚酸、正辛酸和壬酸。結(jié)果顯示，庚酸的保留時(shí)間較短，且與雜質(zhì)峰重合；壬酸保留時(shí)間過長，不利于臨床大樣本的監(jiān)測(cè)；而正辛酸保留時(shí)間適中，且與待測(cè)物、內(nèi)源性雜質(zhì)的分離良好，故最終選擇正辛酸作為內(nèi)標(biāo)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血漿樣品的處理一般采用溶劑萃取法和沉淀法[9]，本研究對(duì)這兩種方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，采用乙腈為蛋白沉淀劑處理血漿樣品，低質(zhì)量濃度樣品未能檢出[11]，故最終選用提取回收率更高的溶劑萃取法。在對(duì)萃取溶劑的篩選中，筆者比較了常用萃取溶劑乙酸乙酯、環(huán)己烷和石油醚[6，11]，最后選擇了提取效率較高的環(huán)己烷作為萃取溶劑，其提取回收率＞80%，符合生物樣品定量分析的基本要求[9]。在復(fù)溶溶劑的選擇中，本研究先選用甲醇作為復(fù)溶溶劑，但溶解效率并不高，代謝產(chǎn)物2-ene-VPA未能出峰；當(dāng)選用乙腈作為復(fù)溶溶劑后，反應(yīng)效率提高，低質(zhì)量濃度待測(cè)物亦可被檢出，這可能與乙腈為非質(zhì)子性溶劑、衍生化物在其中能更好地溶解有關(guān)，故最終選用乙腈為復(fù)溶溶劑。

參照文獻(xiàn)[12]對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，以甲醇-水作為流動(dòng)相，未能檢出2-ene-VPA，其原因可能與待測(cè)物質(zhì)量濃度較低或與其在甲醇中的溶解度不佳有關(guān)；選用非質(zhì)子性溶劑乙腈組成流動(dòng)相，當(dāng)乙腈-水比例為65∶35（V/V）時(shí)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰形良好，且與內(nèi)源性物質(zhì)分離完全，故選為乙腈-水（65∶35，V/V）作為流動(dòng)相。

將該法用于檢測(cè)10例癲癇患兒體內(nèi)VPA的血藥濃度。結(jié)果顯示，其體內(nèi)VPA的血藥濃度為27.4～93.2 μg/mL，有3例患兒的血藥濃度低于有效治療濃度（50～100 μg/mL）；2-ene-VPA的血藥濃度為0.85～3.94 μg/mL，其中1例患兒的血藥濃度低于定量下限，可能與藥物代謝的個(gè)體差異及聯(lián)合用藥有關(guān)。

本研究采用衍生化試劑對(duì)待測(cè)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，建立了同時(shí)測(cè)定人血漿中VPA和2-ene-VPA濃度的RPHPLC法，該方法操作簡便、專屬性強(qiáng)，可用于VPA血藥濃度檢測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究。

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Simultaneous Determination of Sodium Valproate and Its Metabolite in Human Plasma by RP-HPLC

ZHANG Lingmin1，XIE Juan2，LI Longkuan3，LIAO Ronghua1，QIU Zhongyan4（1.Basic Medical College，Guizhou Medical University，Guiyang 555004，China；2.Dept.of Pharmacy，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang 550002，China；3.Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 558000，China；4.Dept.of Pediatrics，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang 550002，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of sodium valproate（VPA）and its metabolite 2-propyl-2-pentenoic acid（2-ene-VPA）in human plasma.METHODS：Plasma sample was extracted with cyclohexane and experienced derivatization with 2，4′-dibromoacetophenone using n-octanoic acid as an internal standard.RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（65∶35，V/V）at the flow rate of 1 mL/min.The column temperature was set at 35②，and UV dectection wavelenth was set at 258 nm. The sample size was 20 μL.RESULTS：The linear range of VPA and 2-ene-VPA were 5.0-200.0，0.5-20.0 μg/mL（r＝0.999 9，n＝5）.The limits of quantification were 5.0，0.5 μg/mL.RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 5%.Method recoveries were 95.99%-98.80%and 97.40%-98.17%，and extraction recoveries were 80.46%-86.23%and 80.45%-85.61%.The plasma concentrations of VPA in 10 epileptic children were 27.4-93.2 μg/mL，and those of 2-ene-VPA were 0.85-3.94 μg/mL，respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，specific and suitable for plasma concentration determination and pharmacokinetic study of VPA.

Sodium valproate；2-propyl-2-pentenoic acid；RP-HPLC；Derivatization；Plasma concentration

R969

A

1001-0408（2017）05-0611-04

2016-07-05 修回時(shí)間：2016-10-20）

（編輯：張?jiān)拢?/p>

貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（No.gzwjkj2015-1-076）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：0851-85923180。E-mail：332300028@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：0851-85923180。E-mail：xiejuan945@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.05.09