Jelli Venkatesh Molly Jahn Byoung-Cheorl Kang *

（1. 植物科學(xué)與植物基因組育種研究所， 蔬菜育種研究中心， 首爾大學(xué) 首爾， 151–921韓國(guó)； 2. 威斯康星大學(xué)， 麥迪遜市 威斯康星州，WI53706美國(guó)）

1 前言

植物應(yīng)對(duì)病原物產(chǎn)生了多種防御反應(yīng)?？共⌒酝ǔＪ怯芍参锟共』颍≧）編碼的蛋白和病原物無(wú)毒基因（Avr）編碼的相應(yīng)效應(yīng)蛋白的基因?qū)蚍绞交プ鳟a(chǎn)生的。這種互作激活了寄主中抑制病原物入侵的防御相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1-2]。一些植物的R基因已經(jīng)被克隆，對(duì)寄主抗性機(jī)制的研究也取得了很大進(jìn)展[3-8]。

植物的R基因根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分為8類[7,9]。醋栗番茄（Solanum pimpinellifoliumL.）的Pto基因是R基因的最好例子[10]。Pto編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶（STK）與抗丁香假單胞菌（P. syringae）的效應(yīng)蛋白AvrPto和AvrPtoB直接互作，從而引發(fā)寄主植物的抗性[12,14-15]。AvrPto和AvrPtoB在其原本不存在的細(xì)菌菌株中表達(dá)時(shí)顯示毒性會(huì)增加[16-18]。AvrPtoB的致病機(jī)理是通過(guò)抑制細(xì)胞程序性壞死來(lái)擾亂寄主的防御反應(yīng)[18]。有趣的是，AvrPto也能夠抑制本氏煙（Nicotiana benthamiana）和番茄中非寄主病原體導(dǎo)致的細(xì)胞程序性壞死[19]。在抗Pst系統(tǒng)中已經(jīng)確定了三類下游效應(yīng)器。Pti1是增強(qiáng)體內(nèi)超敏反應(yīng)的蛋白激酶；Pti4、Pti5和Pti6是防御相關(guān)的類乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子（EREBP）[16,20-21]，Prf是一個(gè)結(jié)合核苷酸的富亮氨酸重復(fù)（NB-LRR）的蛋白質(zhì)。通過(guò)Prf的識(shí)別，AvrPto效應(yīng)子使Pto激酶磷酸化，從而產(chǎn)生抗性[22-25]。

盡管對(duì)植物特別是番茄中的Pto通路基因有了廣泛的研究，但除了茄屬植物，其他植物都沒(méi)有鑒定到識(shí)別AvrPto的Pto功能同系物。在一些植物物種中尋找類Pto序列一直都在嘗試[26-27]。在這些研究中，有人認(rèn)為識(shí)別AvrPto的分子可能類似于番茄中的Pto激酶。然而，突變分析顯示AvrPto蛋白在番茄和煙草中被差異性識(shí)別[17]，這表明煙草中的AvrPto識(shí)別蛋白可能與番茄Pto序列無(wú)關(guān)[17]。已有報(bào)道在大豆中鑒定出了AvrPto[28]，這表明AvrPto的識(shí)別和下游信號(hào)級(jí)聯(lián)可能在物種間保守[28]。植物中對(duì)AvrPto的識(shí)別也引起了關(guān)于AvrPto識(shí)別蛋白在Pst非寄主物種中的作用問(wèn)題。

最近，已經(jīng)在一些茄屬植物[27]以及菜豆[26]、葡萄[29]、黃瓜[30]、香蕉[31]、草莓[32]和柑橘[33]等植物中鑒定出類Pto基因。但是，兩種不同的番茄（S.lycopersicum）基因型中不存在Pto同源物[34-35]。而由特異性AvrPto和Pto介導(dǎo)的抗性可能是從醋栗番茄（Solanum pimpinellifoliumL.）中進(jìn)入到一些栽培番茄品種中[10,36]。盡管對(duì)Pto基因在分子遺傳學(xué)方面研究有所進(jìn)展，但對(duì)Pto基因的分子進(jìn)化研究仍然知之甚少。了解Pto基因的進(jìn)化關(guān)系對(duì)于解開(kāi)其功能差異以及了解其在非寄主抗病性中的作用非常重要。

辣椒是一種重要的香料作物，一直被認(rèn)為是Pst的非寄主。有證據(jù)表明辣椒可能具有識(shí)別AvrPto蛋白并誘導(dǎo)抗性的能力[19]。然而，Pto激酶并未被確定為識(shí)別組分。本研究中，我們使用PVX系統(tǒng)檢測(cè)辣椒能否識(shí)別AvrPto。此外，我們對(duì)辣椒中類Pto基因家族（PLPKs）進(jìn)行了全基因組分析，共確定了25個(gè)PLPK基因，同時(shí)基于序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將其分為8個(gè)亞族（PLPKⅠ－PLPKⅧ）。為了解植物類Pto基因的進(jìn)化多樣性，使用其他茄科植物如番茄、馬鈴薯、本氏煙（Nicotiana benthamiana）、擬南芥和水稻的Pto家族基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育比較和分子進(jìn)化分析。根據(jù)計(jì)算機(jī)工具研究辣椒PLPK的結(jié)構(gòu)特征。最后，我們使用RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)各種辣椒基因型的PLPK基因表達(dá)譜進(jìn)行分析。

2 材料與方法

2.1 植物材料

本研究使用Robert Stall提供的C.annuum‘NuMex Rnaky’（RNaky），Early CalWonder 30（ECW），‘Criollo de Morelos 334’（CM334），‘Perennial’，C. chinense‘PI159234’（234）和‘Habanero’等不同基因型的辣椒品種。試驗(yàn)品種包括生產(chǎn)中重要的易感病品種（ECW和RNaky），以及抗病品種（Perennial，CM334，Habanero和PI159234）。使用本氏煙（Nicotiana benthamiana）進(jìn)行PVX載體擴(kuò)增。

2.2 使用PVX衍生載體在辣椒中瞬時(shí)表達(dá)AvrPto

將G.Martin和X.Tang提供的AvrPto和AvrPtoI96T突變體克隆到由D.Baulcombe提供的pPVX201載體中，來(lái)構(gòu)建PVX衍生載體的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)[37]。選 擇 5'-ATATCGATGGGAAATATATGTGTC-3'和5'-GAGGTCGACATTATGACGCC-3'作 為 引 物，利用PCR從質(zhì)粒pPtE6[28]和pPtE6:I96T[17]中擴(kuò)增每個(gè)AvrPto基因的528 bp編碼區(qū)。引物中的ClaI和Sall位點(diǎn)用下劃線標(biāo)注。擴(kuò)增片段克隆到pGEMT載體中，并通過(guò)測(cè)序檢測(cè)。用限制酶ClaI和Sall消化基因并亞克隆到相應(yīng)載體位點(diǎn)。所得到的pPVX201衍生物稱為pPVX201::AvrPto和pPVX201::AvrPtoI96T。攜帶GFP cDNA的pPVX201衍生物pPVX204當(dāng)作對(duì)照[37]。利用15%膨潤(rùn)土懸浮液和43 mM磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），將≥50 μg的質(zhì)粒摩擦接種到4～6周大小的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）中[37]，產(chǎn)生接種物。使用pPVX201、pPVX204或pPVX載體，系統(tǒng)侵染本氏煙草（Nicotiana benthamiana），在接種后14 d其出現(xiàn)了系統(tǒng)花葉病癥狀，而pPVX::AvrPto導(dǎo)致植株白化和出現(xiàn)死斑，然后出現(xiàn)系統(tǒng)壞死癥狀[38]。沒(méi)有發(fā)生壞死癥狀的本氏煙（Nicotiana benthamiana）的煙葉在接種后10～14 d用50 mM磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）進(jìn)行勻漿，然后摩擦接種到6～8周大小的辣椒植株中。模擬接種的辣椒作為常規(guī)對(duì)照。通過(guò)雜交分析和抗PVX抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（Agdia, Elkhart, IN）確定感染[39]。接種14 d后從植物的未接種上部葉提取總RNA，將其印跡到尼龍膜N+上，并與放射性標(biāo)記的PVX衍生序列和AvrPto序列雜交。

2.3 Pto通路同源物基因定位和全基因組分析

利用已發(fā)表的辣椒遺傳連鎖圖譜[40]來(lái)確定Pto通路基因的位置。Pto、Fen和Prf克隆的cDNA由S.D.Tansksley（康奈爾大學(xué)，伊薩卡，紐約）提供。Pti1、Pti4、Pti5和Pti6的克隆基因由G.Martin（康奈爾大學(xué)，伊薩卡，紐約）提供。為研究PI159234和NuMex Rnaky品種的限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLPs），用EcoRⅠ、EcoRⅤ、DraⅠ、BclⅠ、BstNⅠ、HindⅢ和XbaⅠ限制酶消化親代DNA，并與Pto通路基因雜交。根據(jù)Livingstone等[40]描述的75個(gè)植物F2代的定位來(lái)收集RFLP標(biāo)記物的分離。通過(guò)MAPMAKER軟件對(duì)照原始框架標(biāo)記數(shù)據(jù)集，來(lái)確定PCR克隆片段的圖譜位置。

以番茄（S.pimpinellipolium）中具有Pto基因同源序列的LpimPth2（AAF76305）,LpimPth3（AAF76304）,LpimPth4（AAF76303）,Fen_kinase（AAF76307） 和Pto_kinase（AAF76306） 作 為引用數(shù)據(jù)，使用BLAST程序在CM334 20140109（v1.5）PROTEINS數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://cab.pepper.snu.ac.kr/）中鑒定出辣椒（C.annuum）基因組的Pto基因家族成員。從茄科基因組學(xué)資源數(shù)據(jù)庫(kù)（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/）中獲得預(yù)測(cè)的馬鈴薯Pto蛋白同源序列。在擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR）和水稻基因組注釋計(jì)劃（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中以番茄Pto同源序列作為引用數(shù)據(jù)，利用BLAST程序獲得擬南芥和水稻的類Pto蛋白激酶序列。利用番茄Pto序列作為引用數(shù)據(jù)在茄科基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://solgenomics.net/）中進(jìn)行BLASTP比對(duì)得到番茄和煙草的類Pto蛋白序列。我們也使用番茄Prf1（AAF76308）、Pti1（U28007）、Pti4（U89255）、Pti5（U89256）和Pti6（U89257）序列作為引用數(shù)據(jù)，通過(guò)BLAST程序鑒定出番茄Prf同系物和辣椒Pti同系物。

2.4 辣椒類Pto基因和其他辣椒Pto通路相關(guān)基因的染色體定位

通過(guò)辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cab.pepper.snu.ac.kr/）獲得辣椒PLPK基因和其他Pto通路基因的染色體定位。使用MapChart程序?qū)LPK定位到辣椒染色體上[41]。從辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cab.pepper.snu.ac.kr/）獲得辣椒基因組的DNA和CDS序列。在GSDS網(wǎng)站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/） 中通過(guò)比較基因組DNA和其對(duì)應(yīng)的CDS序列，做出PLPK基因和其他Pto通路基因外顯子－內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。

2.5 確定進(jìn)化分析與保守模體

進(jìn)化樹(shù)中包括辣椒、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥和水稻等植物的蛋白序列以確定進(jìn)化關(guān)系。為確定辣椒和其他物種PLPKs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用所有可得到的植物物種PLPK序列，例如水稻、擬南芥、番茄、煙草和辣椒預(yù)測(cè)的PLPK序列，使用 Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）程序（參數(shù)默認(rèn)）進(jìn)行多重序列比對(duì)。各種類型的擬南芥蛋白激酶[42]也包括在系統(tǒng)發(fā)育分析中，用來(lái)區(qū)分Pto和PLPK成員。使用軟件JalView 2.8[43]編輯由高差異區(qū)域或缺失造成不確定比對(duì)的序列，并將其排除在進(jìn)一步分析之外。使用MEGA 6.0軟件（鄰接法）對(duì)全長(zhǎng)PLPK序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[44]，Bootstrap參數(shù)為1 000。類似地，對(duì)辣椒的PLPK蛋白進(jìn)行了單獨(dú)的系統(tǒng)進(jìn)化分析。在進(jìn)化樹(shù)根是辣椒類受體激酶（PLK）蛋白。由其他植物的PLPK成員的進(jìn)化關(guān)系對(duì)辣椒的PLPK蛋白成員進(jìn)行分類。通過(guò)EuLoc網(wǎng)站對(duì)辣椒PLPK進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[45]。利用SMART網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）來(lái)分析PLPK蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域。

2.6 選擇壓力檢測(cè)

利用Datamonekey在線服務(wù)器（http://www.datamonkey.org/）來(lái)估計(jì)核酸密碼子的非同義（dN）和同義（dS）替換速率，以及dN與dS的比值（ω），以此確定Pto和PLPK蛋白殘基的絲氨酸/蘇氨酸激酶（STK）結(jié)構(gòu)域選擇壓力的性質(zhì)。為避免假陽(yáng)性，我們進(jìn)行了重組檢測(cè)的遺傳算法（GARD）[46]。在Datamonekey網(wǎng)站上[47]我們使用幾種基于密碼子的最大似然法計(jì)算特定位點(diǎn)的選擇壓力：固定效應(yīng)似然法（FEL），內(nèi)部固定效應(yīng)似然法（IFEL）和單一似然祖先計(jì)算（SLAC）。使用REV核酸替換模型來(lái)研究核酸位點(diǎn)。為確定多樣化選擇的單獨(dú)密碼子，我們進(jìn)行了進(jìn)化的混合效應(yīng)模型（MEME）分析。ω值< 1表示負(fù)（純化）選擇，ω值> 1表示正（多樣化）選擇，ω＝1表示位點(diǎn)不受選擇壓力的影響。

2.7 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

利用前人研究的RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)各種辣椒基因型中PLPK基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析[48]。使用軟件CLC Genomics Workbench v8.0（CLC Bio,Aarhus, Denmark）（參數(shù)默認(rèn)）將測(cè)序片段比對(duì)到辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中（http://cab.pepper.snu.ac.kr）。所得數(shù)據(jù)用每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的讀長(zhǎng)（RPKM）標(biāo)準(zhǔn)化。RPKM值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，并使用R中g(shù)gplot包的heatmap.2函數(shù)生成熱圖。

3 結(jié)果

3.1 辣椒中AvrPto特異性誘導(dǎo)超敏反應(yīng)和PVX抗性

圖1 接種PVX載體的辣椒幼苗用于表達(dá)GFP，AvrPto和AvrPtoI96T

為了確定辣椒中是否發(fā)生了AvrPto的特異性識(shí)別，我們使用PVX衍生載體[49]表達(dá)AvrPto和AvrPtoI96T，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中96位點(diǎn)的取代突變阻止AvrPto和Pto的相互作用，使其對(duì)毒力沒(méi)有影響[17]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)包括Perennial、234、Habanero、Rnaky、ECW和CM334等6種不同的辣椒基因型進(jìn)行PVX的易感性篩選（附圖1）。單獨(dú)接種載體時(shí)，234、Habanero、ECW和Rnaky基因型的整個(gè)植株出現(xiàn)感病癥狀（附圖1）。隨后生長(zhǎng)的234和ECW基因型植株被單獨(dú)接種PVX載體或者GFP、AvrPto和AvrPtoI96T來(lái)表達(dá)構(gòu)建體（圖1）。病原和PVX同源序列在接種部位 （數(shù)據(jù)未顯示）和上部未接種組織（圖1）都存在，并且接種GFP構(gòu)建體的植株中，其未接種的葉片在紫外線下產(chǎn)生熒光（數(shù)據(jù)未顯示），這些都證明單獨(dú)接種載體（附圖1） 和接種包含GFP的PVX構(gòu)建體 （圖1A中Ⅰ，Ⅱ）都導(dǎo)致了系統(tǒng)癥狀的感染。相比之下，當(dāng)植物接種pPVX::AvrPto時(shí)，癥狀被限制在接種葉片下端的葉上，并表現(xiàn)出局部壞死癥狀（圖1A中Ⅲ，Ⅳ）。另外，僅在接種組織中檢測(cè)到PVX抗原、PVX-和AvrPto-同源序列（數(shù)據(jù)未顯示），而在未接種組織沒(méi)有檢測(cè)到（圖1B）。在感病的辣椒植株中，PVX從感染部位散布到整個(gè)植株。同樣，PVX::AvrPto也被認(rèn)為是全身性移動(dòng)。然而，PVX::AvrPto的散布在辣椒中受到限制，只能在感染的下部葉片中檢測(cè)到。這可能是由于AvrPto是通過(guò)Pto同系物定位在接種葉上，從而抑制PVX::AvrPto的全身移動(dòng)。因此，在未接種的上部葉片中PVX和AvrPto都沒(méi)有檢測(cè)到（圖1B，道4）。

根據(jù)局部病變特征性壞死的出現(xiàn)，所有對(duì)PVX敏感的辣椒基因型似乎都識(shí)別AvrPto，因此不適用需要不同寄主反應(yīng)的常規(guī)遺傳方法。與Pto不互作的突變激發(fā)子AvrPtoI96T的獲得，讓我們有了一種替代方法。如果辣椒Pto同源序列在體內(nèi)編碼可以識(shí)別AvrPto的功能基因產(chǎn)物，且該識(shí)別對(duì)定位PVX感染是重要的，那么表達(dá)AvrPtoI96T的PVX載體應(yīng)該是系統(tǒng)性擴(kuò)散的。當(dāng)辣椒幼苗接種pPVX::AvrPtoI96T后，在不親和互作中觀測(cè)到在接種的葉片上出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，局部性壞死發(fā)展為相同尺寸的壞死性暈圈。這些癥狀隨后遍布整個(gè)植株（圖1A中Ⅴ, Ⅵ）。由于PVX抗原的存在（數(shù)據(jù)未顯示）和上部未接種葉片的總RNA與PVX-和AvrPto-同源探針的雜交證實(shí)系統(tǒng)感染（圖1B）。

總之，只有兩種辣椒品種表達(dá)AvrPto的PVX載體限于接種組織。其他所有PVX載體全身移動(dòng)，這與辣椒中Pto同系物可以在體內(nèi)識(shí)別AvrPto假設(shè)一致。

3.2 Pto和PLPK的鑒定、分類和進(jìn)化關(guān)系

為鑒定AvrPto可能的互作因子，我們對(duì)栽培種CM334進(jìn)行全基因組分析，尋找辣椒中的番茄Pto同系物。我們用許多植物的Pto同源物和擬南芥的PLK構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[42]，將Pto同系物與含STK結(jié)構(gòu)域的其他類型的蛋白區(qū)分開(kāi)。只有在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中包括STK結(jié)構(gòu)域亞域Ⅰ和Ⅺ之間的區(qū)域，包括PLPK在內(nèi)的Pto同系物清晰地形成了擬南芥PLK和其他蛋白激酶的獨(dú)立簇（附圖S2）。根據(jù)序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析，我們?cè)诶苯坊蚪M中鑒定出25個(gè)Pto類蛋白激酶基因（表1）。

為了確定Pto和PLPK同源物之間的進(jìn)化關(guān)系，并對(duì)辣椒PLPK進(jìn)行分類，我們用預(yù)測(cè)的辣椒PLPK序列和許多植物（比如番茄、煙草、馬鈴薯、擬南芥和水稻）的全長(zhǎng)Pto和PLPK同源物構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示在Pto同系物之間，Pto和PLPK存在兩個(gè)不同的簇（圖2）。茄科植物的Pto進(jìn)化枝不同，并且在這個(gè)進(jìn)化枝中番茄Pto同源物聚在一起。然而，在辣椒中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Pto進(jìn)化枝成員，這表明Pto的起源發(fā)生在茄科亞系的早期進(jìn)化階段。辣椒PLPK進(jìn)一步分成八個(gè)亞族（PLPKⅠ至PLPKⅧ）。在PLPKⅠ和PLPKⅣ亞族中，許多雙子葉植物的PLPK聚集在一起，而PLPKⅡ、PLPK Ⅲ、PLPKⅤ、PLPKⅥ 和PLPKⅦ亞族中，雙子葉植物和單子葉植物PLPK成員都存在。然而，在PLPKⅡ和PLPKⅢ亞族中，單子葉和雙子葉植物形成了不同的進(jìn)化枝。除了在茄科中比較特別的PLPKⅧ亞族，其他所有的PLPK亞族中都觀測(cè)到了至少一個(gè)擬南芥的PLPK成員?？傊到y(tǒng)進(jìn)化分析表明辣椒PLPK基因簇模式與其他雙子葉植物相似。此外，在進(jìn)化樹(shù)中的雙子葉植物成員中間發(fā)現(xiàn)來(lái)自水稻的PLPK成員，這意味著PLPK蛋白家族是在單子葉和雙子葉植物的共同祖先中進(jìn)行進(jìn)化。

3.3 辣椒PLPK蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

我們單獨(dú)構(gòu)建了辣椒PLPK蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，來(lái)確定辣椒PLPK蛋白之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。從這個(gè)進(jìn)化分析來(lái)看，辣椒PLPK蛋白可以分為 PLPKⅠ和 PLPK Ⅷ 8個(gè)亞族（圖3）。亞族PLPKⅠ和PLPKⅥ包括2個(gè)成員，PLPKⅢ和PLPKⅤ包括3個(gè)成員，PLPKⅡ、PLPKⅣ、PLPKⅦ和PLPKⅧ分別包括1、3、6、5個(gè)成員。

3.4 辣椒PLPKs和番茄Pto與PLPK的比較系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了確定辣椒和番茄Pto同源物的進(jìn)化關(guān)系，我們生成了一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖F3），這表明辣椒中不存在類Pto成員。除了PLPKⅥ族在番茄中沒(méi)有存在外，其他所有的PLPK同源物在辣椒和番茄中都顯示出相同的聚類模式。辣椒和番茄的PLPKⅠ、 PLPKⅡ和PLPKⅣ族成員數(shù)量是一樣的，分別是1、2和3個(gè)。番茄和辣椒的PLPKⅦ族中分別鑒定到5和6個(gè)成員。在PLPKⅧ族中，在辣椒中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)成員，而在番茄中只有1個(gè)成員。這些觀測(cè)結(jié)果表明，茄科植物中存在Pto和PLPK亞系擴(kuò)大和分化。

表1 辣椒中類Pto基因和其他與Pto途徑相關(guān)基因

3.5 辣椒PLPK和Pto通路基因的染色體分布和結(jié)構(gòu)

我們根據(jù)基因在染色體上的順序?qū)⒗苯稰LPK基因命名為PLPK1到PLPK25。表1中列出了辣椒基因名稱和其ID的詳細(xì)信息。25個(gè)PLPK基因中有7個(gè)未被定位到染色體上。其余的18個(gè)PLPK基因定位到6條染色體上。Chr1、Chr4、Chr5、Chr8和Chr12上的染色體數(shù)差別很大，Chr2上最多有7個(gè)，Chr3和Chr6各有3個(gè)PLPK基因。Chr9和Chr10分別觀測(cè)到了2個(gè)PLPK基因，然而Chr7只有1個(gè)基因（附圖S4A）。基于連鎖圖譜分析，在未分配到任何染色體的7個(gè)PLPK基因中，至少有一個(gè)PLPK基因能分配到Chr12，并且2個(gè)PLPK基因（HPto-a和HPto-d）與Prf同系物Prf1.2（HPrf-c）和Prf1.3（HPrf-b）可以定位到Chr11（附圖S4B）。HPto-a和HPrf-b（Prf1.3）被定位在番茄Pto進(jìn)化枝的對(duì)應(yīng)位置，這表明HPto-a是番茄Pto的直系同源物。然而，與嵌入Pto簇的番茄Prf相比，HPrf-b與HPto-a距離約2 cM。

圖2 番茄Pto旁系同源基因與PLPK基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在 4個(gè) Prf同 源 物 中，Prf1.1位 于 Chr4，Prf1.2和Prf1.3位于Chr11，Prf1.4不與任何染色體相關(guān)。在4個(gè)Pti1同源基因中，Pti1.1、Pti1.2（HPti1-a）和Pti1.3分別位于Chr3、Chr5和Chr12，基于連鎖圖，Pti1.4（Hpti1-b）可能位于Chr5（附圖S4B）。在辣椒中檢測(cè)到的2個(gè)Pti1同系物HPti1-a和Hpti1-b與番茄Chr5具有共線性，且Pti4、Pti5和Pti6.1分別位于Chr5、Chr2和Chr6。Pti6.2不位于任何染色體。

外顯子－內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明，辣椒大多數(shù)PLPK基因的內(nèi)含子較少，少數(shù)例外；PLPK3、PLPK5、PLPK6、PLPK7和PLPK18顯示有 1個(gè)內(nèi)含子，PLPK4顯示有2個(gè)內(nèi)含子（圖3B）。相反，辣椒Prf基因顯示有3到6個(gè)不同長(zhǎng)度和位置的內(nèi)含子（附圖S5）。同樣，Pti基因也被發(fā)現(xiàn)是高度分散的，并且顯示具有0到7個(gè)內(nèi)含子的復(fù)雜結(jié)構(gòu) （附圖 S5）。

3.6 辣椒PLPK基因的保守基序分析

使用Clustal Omega程序?qū)?5個(gè)辣椒PLPK蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列和番茄Pto的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行多序列比對(duì)。辣椒PLPK序列預(yù)測(cè)長(zhǎng)度從683到898個(gè)氨基酸不等。辣椒的PLPK蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列分析顯示，其與番茄Pto有54%～71%的序列同源性。在辣椒PLPK進(jìn)化組中，氨基酸序列的同源性變化范圍從35%～96%。所有辣椒PLPK蛋白都顯示出約275個(gè)氨基酸的高度保守的STK結(jié)構(gòu)域（圖4）。8個(gè)亞族都含有在大多數(shù)植物的STK結(jié)構(gòu)域亞域Ⅰ至Ⅺ中發(fā)現(xiàn)的保守氨基酸殘基。氨基酸序列比對(duì)表明高度保守的Pto同源物PLPK的幾個(gè)顯著特征，如STK結(jié)構(gòu)域，位于亞域Ⅶ和Ⅷ之間的激活域，以及負(fù)責(zé)與AvrPto效應(yīng)器特異性結(jié)合的內(nèi)部P+1環(huán)結(jié)合位點(diǎn)[50]。STK結(jié)構(gòu)域也包含幾個(gè)分散的可變氨基酸位點(diǎn)。另外，Pto激活域的4個(gè)自磷酸化位點(diǎn)（Ser或Thr）中的3個(gè)保留在所有辣椒的相應(yīng)區(qū)域中[51]。據(jù)報(bào)道，高度保守的Val55和His94的突變破壞了酵母中的Pto-AvrPto的相互作用，并抑制Pto介導(dǎo)的抗性[52]。

圖3 辣椒PLPK蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

我們用SMART程序來(lái)確認(rèn)PLPK的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)大部分PLPK蛋白包含4個(gè)功能域：信號(hào)肽區(qū)、麥角蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和STK結(jié)構(gòu)域（圖3C）。相比之下，番茄Pto只包含STK結(jié)構(gòu)域。PLPKⅤ成員PLPK18在其C端具有額外的激酶結(jié)構(gòu)域。PLPKⅧ成員PLPK7在其N端有2個(gè)抗病性的stress-antifung結(jié)構(gòu)域。另外，幾種辣椒PLPK蛋白區(qū)域顯示出低復(fù)雜度區(qū)域（low complexity regions）。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)工具EuLoc[45]表明，所有辣椒的PLPK蛋白質(zhì)都預(yù)測(cè)定位到質(zhì)膜上。所有的Pti1蛋白也都預(yù)測(cè)定位在質(zhì)膜上，而Pti4、Pti5和Pti6都預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核，Prfs被預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)。

為鑒定辣椒的PLPK激活域中保守的Pto自磷酸化位點(diǎn)和其他關(guān)鍵殘基，我們用辣椒和番茄的Pto序列進(jìn)行了多重序列比對(duì)分析（圖4）。 5個(gè)Pto自磷酸化位點(diǎn)中的3個(gè)，包括Thr195、Ser198和Thr199[51]在辣椒PLPKs中高度保守，有少數(shù)例外。Thr195被PLPK24和PLPK25中的Gly取代，Ser198被 PLPK10和 PLPK13中 的 Val、PLPK24和PLPK25序列中的Thr取代。 Ser198是AvrPto-Pto介導(dǎo)的超敏反應(yīng)所必需的，并且在辣椒PLPKs中高度保守。Pto自磷酸化位點(diǎn)Thr190在大多數(shù)辣椒PLPK中被Pro取代。在一些PLPK中，例如PLPK3、PLPK4、PLPK5 和 PLPK7，Ser被 Thr取代，產(chǎn)生了另一個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在PLPK22中，Thr190被Leu取代。另外兩個(gè)Pto磷酸化殘基Thr204和Tyr207對(duì)于Pto功能至關(guān)重要，但不是對(duì)體外自體磷酸化[14,53]。這兩個(gè)Pto磷酸化殘基高度保守；然而，在所有辣椒PLPK中Thr204被Ser取代。

3.7 選擇壓力分析

我們對(duì)選擇壓力的變化進(jìn)行了分析，檢驗(yàn)類Pto和PLPK基因在基因倍增之后是否經(jīng)歷了適應(yīng)性進(jìn)化。通過(guò)使用Datamonkey網(wǎng)站中的各種模型多序列比對(duì)，我們基于密碼子來(lái)檢測(cè)選擇壓力[47]。我們還使用GARD分析比對(duì)以排除重組斷裂點(diǎn)，分析顯示沒(méi)有任何重組事件的證據(jù)。

為鑒定單個(gè)密碼子過(guò)去的選擇，我們使用基于密碼子的似然方法（FEL、IFEL和SLAC）計(jì)算每個(gè)密碼子位點(diǎn)上的非同義（dN）和同義（dS）替換率以及dN/dS（ω）值。有趣的是，這些方法并沒(méi)有顯示在任何位點(diǎn)正向選擇的證據(jù)（表2和附圖S6）。大部分位點(diǎn)都顯示為負(fù)（凈化）選擇，而位點(diǎn)13和22 （取決于使用哪種模式）是以中性速率進(jìn)化。有趣的是，進(jìn)化混合效應(yīng)模型（MEME）確定了16個(gè)氨基酸位點(diǎn)（附圖S6）是處于偶發(fā)性正選擇（0.1顯著水平）。其中，位于STK結(jié)構(gòu)域的N末端有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ-b和Ⅶ亞結(jié)構(gòu)域各有一個(gè)氨基酸位點(diǎn)，Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ亞基有兩個(gè)位點(diǎn)，在Ⅺ亞基有3個(gè)位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，除純化作用之外，正向選擇在植物Pto同源物的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并在適應(yīng)性抗病性的進(jìn)化中也發(fā)揮了重要作用。

3.8 Pto通路基因表達(dá)圖譜

Pto通路基因的表達(dá)譜是用來(lái)自5種不同辣椒種質(zhì)的RNA-seq數(shù)據(jù)生成的[48]。為分析不同材料間辣椒PLPK基因的表達(dá)圖譜，我們根據(jù)log2轉(zhuǎn)化的RPKM值生成熱圖和層次聚類（圖5）。根據(jù)表達(dá)模式，我們將辣椒PLPK基因分為3組：C1、C2和C3（圖5）。在C1組中，相對(duì)高表達(dá)的PLPK1，PLPK12-PLPK13和PLPK16-PLPK20聚集在一起。有趣的是，除了Ⅷ亞族以外，在C1中觀測(cè)到每個(gè)辣椒至少一個(gè)PLPK亞族的基因。所有的亞族Ⅷ成員（PLPK3-PLPK7）和分別屬于亞族Ⅴ和Ⅶ的PLPK22、PLPK23都聚類到C2組，并且都是溫和水平表達(dá)。辣椒PLPK基因PLPK2、PLPK8 -PLPK11和PLPK14 - PLPK15都聚類到C3組，并以低水平表達(dá)。有趣的是，除了PLPKⅡ和PLPKⅧ亞族，每個(gè)亞族中至少有一個(gè)基因在C3組中。包括Pti和Prf的許多Pto通路基因也表現(xiàn)出中等到低的表達(dá)水平。一般來(lái)說(shuō)，植物R基因在感染或未感染的植物中表現(xiàn)出低水平的組成型表達(dá)，這與其在病原體中識(shí)別一般規(guī)律一致[54-55]。總之，5種辣 椒 種 質(zhì)（C.annuum'PI201234'，'YCM334'，C.chinense'Aji Dulce'，'PI152225'和C.chacoense'PI260429'）基因型中Pto通路基因的表達(dá)譜非常相似（圖5），這表明辣椒物種中Pto信號(hào)基因調(diào)控機(jī)制是高度保守的。

4 討論

在番茄中，Pto位點(diǎn)由5個(gè)存在于5號(hào)染色體上的Pto同源物組成，這些Pto同源物可能是通過(guò)連續(xù)的基因復(fù)制和缺失進(jìn)化的[10,34]。Pto位點(diǎn)及其在AvrPto識(shí)別特異性中的基因?qū)蚰Ｊ皆谇芽莆锓N是保守的[19,54]。然而，Pto的識(shí)別在許多茄科物種（包括辣椒和馬鈴薯）中是否是具有特異性還是未知的。盡管許多植物物種中的AvrPto已經(jīng)被鑒定了，但其識(shí)別是否由類Pto激酶介導(dǎo)尚不清楚。另外，除了番茄和煙草之外，在其他植物物種中沒(méi)有鑒定出識(shí)別AvrPto的功能性類Pto蛋白。辣椒PVX載體系統(tǒng)的結(jié)果為AvrPto的體內(nèi)識(shí)別提供了證據(jù)。當(dāng)然，我們不能排除辣椒中識(shí)別AvrPto的是類Pto基因或者其他PLKs基因的可能性，除非使用反向遺傳方法來(lái)驗(yàn)證該結(jié)果。Pto通過(guò)與NBLRR和Prf相互作用介導(dǎo)番茄中AvrPto/AvrPtoB的識(shí)別[56]。然而，AvrPto/AvrPtoB的靶點(diǎn)是各種RLK[57-60]的激酶結(jié)構(gòu)域，而不是Pto的STK結(jié)構(gòu)域。Pto被Rrf當(dāng)作分子誘餌來(lái)與病原效應(yīng)蛋白相互作用[61-62]。AvrPto/AvrPtoB效應(yīng)物與幾種植物分子互作，如擬南芥GTPase RabE[63-64]和幾種PLK激酶結(jié)構(gòu)域，如 CERK1，BAK1，EFR1 和 FLS2[57-60,65]。

圖4 STK結(jié)構(gòu)域的多重序列比對(duì)

為了鑒定辣椒中可能與AvrPto相互作用的番茄Pto同系物，我們進(jìn)行了全基因組分析，共鑒定了25個(gè)全長(zhǎng)的類Pto（PLPK）基因。大多數(shù)R基因是多基因家庭的成員，并且在植物基因組中以簇的形式出現(xiàn)?；蛑貜?fù)和多樣化被認(rèn)為是R基因簇進(jìn)化擴(kuò)張的原因[5]。一些植物物種的Pto同系物的進(jìn)化分析鑒定出了Pto同源物的幾個(gè)亞族[27,30,32]。在趣的是，辣椒中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Pto進(jìn)化枝成員。我們利用3個(gè)不同的辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)“CM334”、“Chiltepin”和“Zunla-1”（http://cab.pepper.snu.ac.kr/） 和NCBI中的辣椒表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）證實(shí)了辣椒基因組中沒(méi)有番茄Pto同系物（Pto 進(jìn)化枝）。Wan等人[66]在使用針對(duì)Pto基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物時(shí)，未在辣椒中擴(kuò)增出真正的Pto同系物。此外，在番茄中進(jìn)行R基因定位實(shí)驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)出番茄類Pto的同源物[67]。除Pto進(jìn)化枝外，辣椒和其他植物的茄科PLPK蛋白在進(jìn)化樹(shù)枝干中均勻分布，這表明PLPK蛋白是先于單子葉和雙子葉分化由共同的祖先基因產(chǎn)生。辣椒中番茄Pto同源物的缺失進(jìn)一步表明茄科的分支特異性擴(kuò)大了Pto進(jìn)化枝。這一觀察結(jié)果也表明，Pto基因在病原識(shí)別和抗病中的作用可能是茄科早期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的[27,35]，或者是從辣椒中喪失的。

表2 多物種類Pto基因STK結(jié)構(gòu)域正選擇分析

圖5 5個(gè)不同辣椒品種的PLPK基因表達(dá)譜

可能導(dǎo)致辣椒和一些番茄基因型中Pto進(jìn)化枝缺失的潛在機(jī)制尚不清楚[34-35]。一些栽培番茄（S.lycopersicum）品種表現(xiàn)出對(duì)AvrPto特異的，從番茄（S.pimpinellifolium）引入的Pto介導(dǎo)的Pst抗性[10,36]。有2個(gè)可能的原因來(lái)解釋Pto特異識(shí)別在一些番茄品種中保留，并在一些親緣關(guān)系很近的物種中喪失的現(xiàn)象。第一，在野生番茄（S.lycopersicum）的馴化過(guò)程中，可能發(fā)生了強(qiáng)烈的遺傳瓶頸效應(yīng)，并導(dǎo)致缺乏Pto基因的番茄品系的選擇[35]。第二，在缺乏具有AvrPto和Pst的基因的情況下，與Pto位點(diǎn)相關(guān)的適合度代價(jià)可能導(dǎo)致對(duì)含有Pto基因的番茄品系的選擇[35]。雖然Pto基因位點(diǎn)的有毒效應(yīng)可能難以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定[35]，但是沒(méi)有證據(jù)顯示在含有Pto位點(diǎn)和不含有Pto位點(diǎn)的番茄的近等基因與Pst抗性有相關(guān)的適合度代價(jià)[35,68]。

盡管對(duì)番茄進(jìn)行了廣泛的研究，但其他茄科植物中Pto同系物的功能特異性還不太清楚。Pto同源物與番茄Pto有78%～91%的核苷酸相似性，并且其具有功能性蛋白激酶活性，但都不能與AvrPto和AvrPtoB效應(yīng)子互作[12,69]。Pto基因家族的基因復(fù)制以及隨后的多樣化可能導(dǎo)致了可變的特異識(shí)別性[70]。Pto和Pto同系物僅在幾個(gè)氨基酸殘基上變化，這可能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，導(dǎo)致與其他蛋白質(zhì)物理性相互作用能力的改變[36]。Fen基因是5個(gè)Pto旁系同源物之一，與Pto基因有87%的相似度，并參與共同的導(dǎo)致超敏反應(yīng)的信號(hào)事件。但是，它是由一個(gè)不同的信號(hào)激活的[70-71]。相反，LhirPto顯示出與Pto基因97%的相似度，只有17個(gè)氨基酸的不同使其與Pto區(qū)分開(kāi)來(lái)，但是LhirPto不能取代Pto的抗病性[35]。這些觀察結(jié)果進(jìn)一步表明在Pto-AvrPto的識(shí)別特異性上有選擇壓力[72]。

多樣化選擇和適應(yīng)性選擇被假定在R基因的進(jìn)化中起關(guān)鍵作用。適應(yīng)性選擇被認(rèn)為是推動(dòng)寄主－病原體識(shí)別功能基因區(qū)進(jìn)化的重要力量[5,73]。有趣的是，純化選擇似乎是對(duì)含有STK結(jié)構(gòu)域以保持其祖先狀態(tài)的基因的主要選擇性壓力[32]。然而前人的研究認(rèn)為是偶發(fā)性正選擇，這表明在進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力可能發(fā)生了變化。有報(bào)道稱，適應(yīng)性進(jìn)化常常涉及在某個(gè)基因的少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)上偶發(fā)的突變，并可能只影響系統(tǒng)進(jìn)化的一部分基因[74]。與此一致的是，MEME分析顯示一些密碼子屬于偶發(fā)性正選擇。Pto的激活結(jié)構(gòu)域（氨基酸182和211之間的區(qū)域），在AvrPto識(shí)別中起重要作用[27]。有趣的是，我們結(jié)果顯示Ser198和Ile208這兩個(gè)位置都經(jīng)歷了片段正選擇，這意味著它們?cè)谶m應(yīng)性進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用。最近的文獻(xiàn)顯示，已被用作Pto/AvrPto反應(yīng)的陰性對(duì)照的本氏煙草（N.benthamiana）也可以用基因?qū)虻姆绞阶R(shí)別AvrPto，并且這種識(shí)別依賴于Prf[19]。AvrPto的識(shí)別使植物產(chǎn)生抗性也在遠(yuǎn)距離的分類群中觀察到，例如在大豆中[28]。這些觀察結(jié)果進(jìn)一步表明，除了進(jìn)化和平衡選擇外[72]，適應(yīng)性選擇也可能影響Pto位點(diǎn)的進(jìn)化。

總之，在不同辣椒基因型中觀察到來(lái)自于Pst的AvrPto效應(yīng)子的識(shí)別相關(guān)的非寄主應(yīng)答。AvrPto的識(shí)別可能是由Pto同源物或其他RLK蛋白介導(dǎo)的。我們通過(guò)全基因組分析鑒定了25個(gè)辣椒PLPK基因，發(fā)現(xiàn)它們分為8個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化亞族。Pto進(jìn)化枝代表茄科植物最近起源的基因家族，但PLPK基因代表了古代共同起源的分歧基因。在辣椒基因組中沒(méi)有番茄Pto旁系同源物，這表明Pto基因家族經(jīng)歷了對(duì)Pst抗性的不同適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程。辣椒PLPK基因的特點(diǎn)是存在高度保守的STK結(jié)構(gòu)域。PLPK基因中與碳水化合物結(jié)合的麥芽糖結(jié)合蛋白類似結(jié)構(gòu)域的存在暗示糖代謝與疾病抗性信號(hào)傳導(dǎo)通路可能具有某種聯(lián)系[75]。在全部5種的辣椒基因型中觀察到Pto通路基因的類似表達(dá)譜，這些觀察結(jié)果表明具有高度保守功能域的PLPK基因與辣椒基因型中的Pto信號(hào)傳導(dǎo)通路有共同的高度保守的基因調(diào)控機(jī)制。對(duì)于Pto和PLPK，以及它們與AvrPto或其他效應(yīng)物的相互作用的進(jìn)一步研究將對(duì)植物－病原體共同進(jìn)化過(guò)程提供更多思路，對(duì)于辣椒PLPK基因的全基因組分析為進(jìn)一步功能研究提供了重要的基因資源，也為揭示辣椒非寄主抗病性提供了分子基礎(chǔ)。

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（文獻(xiàn)來(lái)源：PLoS ONE 11（8）： e0161545）華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 胡震竺 劉越 孔秋生 譯