陳孟毅++林帥++杜朋++李程程++孟愛民

[摘要] 目的 建立小鼠博來霉素氣管多次給藥肺纖維化模型。 方法 SPF級雄性C57BL/6J小鼠45只，按體重隨機分為未處理組（5只）和處理組（40只），未處理組小鼠不經(jīng)處理，處理組小鼠博來霉素氣管給藥（0.4 mg/mL），2周給藥1次，共8次。處理組小鼠在初次給藥后2周、1個月、2個月、4個月時分別取出肺組織稱重計算肺系數(shù)、固定做HE染色和Masson染色，制備冰凍切片進行細胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色。 結(jié)果 與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在給藥2周時肺系數(shù)顯著升高（P < 0.05）；同時，肺組織病理觀察結(jié)果顯示，給藥2周時，小鼠肺泡腔內(nèi)滲出和血管周圍炎細胞浸潤較為嚴重，病理評分與未處理組小鼠比較顯著升高（P < 0.05）。此外，處理組小鼠在給藥2周、2個月與4個月時肺泡間隔增寬相對穩(wěn)定，與未處理組小鼠比較，病理評分顯著升高（P < 0.05），但胞漿滲出逐漸減少、炎細胞浸潤減輕，評分接近未處理組小鼠水平；膠原染色結(jié)果顯示處理組小鼠在給藥2周時出現(xiàn)藍綠色的膠原纖維，并在1、2、4個月時膠原纖維持續(xù)存在；SA-β-Gal染色結(jié)果表明，與未處理組小鼠比較，博來霉素氣管給藥4個月時小鼠的肺組織中衰老細胞明顯增多。 結(jié)論 博來霉素氣管多次給藥可以建立小鼠肺纖維化模型，且模型小鼠具有肺纖維化進展不可逆、炎性反應明顯減少兩個重要特點，并提示肺纖維化與衰老細胞有一定關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 博來霉素；纖維化；肺；模型

[中圖分類號] R563.02；R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（b）-0008-04

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明、以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導致肺間質(zhì)纖維化為特征的慢性疾病[1-2]。臨床上除肺移植外無有效的治療手段[3-4]，且預后極差，動物肺纖維化模型在肺纖維化機制及其防治研究中非常重要。二氧化硅[5]、石棉、博來霉素[6]（BLM）等都能誘導肺纖維化，常用BLM誘導肺纖維化模型[7]，BLM氣管給藥是最常用的方式[8]，氣管給藥又分為氣管插管和氣管滴注。有文獻報道BLM單次給藥模型在給藥6周后，小鼠肺損傷部位有明顯修復[9]，與人類肺纖維化疾病的發(fā)展過程不同；病理學表現(xiàn)也不相同，人肺纖維化疾病的肺損傷部位細胞外基質(zhì)的沉積增多，中性粒細胞炎性反應不突出[10]，而單次給藥肺纖維化模型中常有明顯的嗜中性粒細胞的炎性反應[11]，并有文獻顯示經(jīng)單次給藥肺纖維化模型篩選出的藥物治療方案，在臨床上多數(shù)是無效的[12]?；谝陨弦蛩?，筆者在參閱相關(guān)文獻后，擬采用BLM氣管滴注多次給藥方式造成小鼠肺持續(xù)性損傷，希望制備更符合人體IPF發(fā)病情況的BLM肺纖維化模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠45只（SPF級），體重20～22 g，10～12周，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[動物合格證：SCXK（京）2015-0035]，動物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物房屏障環(huán)境內(nèi)，溫度20～26℃，相對濕度50%～60%。

1.2 試劑

注射用鹽酸BLM：日本化藥株式會社；鹽酸氯胺酮注射液：沈陽市獸藥廠；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒：碧云天；核固紅染色液（0.5%）：北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型建立

14周齡C57BL/6J雄性小鼠按體重隨機分為未處理組（5只）和處理組（40只），處理組氣管滴注BLM溶液（0.4 mg/mL，每只100 μL），未處理組小鼠不經(jīng)處理，處理組小鼠用注射用鹽酸氯胺酮150 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露聲門，用接套管的1 mL注射器氣管給藥。2周給藥1次，共8次，初次給藥后2周（0.5個月）、1個月、2個月、4個月時取肺組織。

1.4 HE染色

肺組織10%中性甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，切片5 μm，進行蘇木精-伊紅染色，普通光學顯微鏡（BX50，Olympus，Japan）觀察肺組織病變，病理學鏡檢人員單盲評分。

1.5 Masson染色

石蠟切片脫蠟，水洗，Masson染色復合液染色5 min，水洗，0.2%醋酸浸洗，1%磷鎢酸浸洗，亮綠染色液染色15 min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻脫水、透明、固封。

1.6 肺系數(shù)

肺系數(shù)=肺組織重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.7 冰凍切片

小鼠在BLM初次給藥0.5、1、2、4個月取右肺中葉，速凍后將肺組織浸沒在適量包埋劑中，冰凍切片機制作8 μm的切片。

1.8 細胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法

冰凍切片固定液固定15 min，PBS洗3次，每次3 min，配染色液，滴加到切片上，37℃培養(yǎng)箱（無CO2）過夜，PBS洗后核固紅（0.5%）復染15 min。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 博來霉素多次給藥對小鼠體重的影響

處理組小鼠第1次BLM給藥為0周，小鼠每周稱重1次。未處理組小鼠整體上體重呈逐漸上升趨勢。與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在BLM第1次給藥（0周）后體重下降，初次給藥1周時體重處于最低點，隨后體重逐漸增加，在第5周時接近未處理組小鼠體重，之后與未處理組小鼠體重增長趨勢一致，在12周時體重超過未處理組小鼠（圖1）。

2.2 博來霉素多次給藥過程中肺系數(shù)的變化

處理組小鼠在0.5、1、2、4個月時的肺系數(shù)有高于未處理組小鼠的趨勢，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠0.5個月時肺系數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；且處理組小鼠在0.5個月時具有高于1、2、4個月時肺系數(shù)的趨勢（圖2）。

2.3 博來霉素多次給藥肺組織病理學改變

根據(jù)HE染色結(jié)果，對肺組織病理學評分：由0～12分組成，3個分類評價指標[13]：肺泡間隔增寬、肺泡腔內(nèi)纖維化滲出的嚴重度、血管周圍炎細胞浸潤的程度，每種分類分為：0分正常；1分輕度；2分中度；3分重度；4分極重度。合并后記分。

圖3顯示，BLM給藥過程中，小鼠在給藥后0.5、1、2、4個月時肺組織肺泡腔胞漿滲出逐漸減少，炎細胞浸潤依次減弱，但肺泡間隔增寬沒有明顯變化。

A.未處理組；B.0.5個月；C.1個月；D.2個月；E.4個月

圖3 小鼠肺組織HE染色（100×）

從總分來看，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在BLM初次給藥后0.5、1、4個月的評分顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。從單項評分來看，①肺泡間隔增寬：與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在0.5、2、4個月評分顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）；②肺泡腔內(nèi)滲出：0.5個月時處理組小鼠分數(shù)高于其他三個時間點，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在0.5、4個月時評分顯著升高（P < 0.01）；③血管周圍炎細胞浸潤：處理組小鼠0.5個月時與未處理組小鼠比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），4個月時處理組小鼠與未處理組小鼠炎細胞浸潤水平接近。見表1。

2.4 博來霉素多次給藥肺組織膠原沉積的變化

與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在初次給藥后0.5個月時出現(xiàn)藍綠色的膠原纖維，在繼續(xù)給藥1、2、4個月時膠原纖維持續(xù)存在（圖4，封四）。

2.5 博來霉素多次給藥對肺組織衰老細胞的影響

小鼠初次給藥4個月時肺組織冰凍切片進行SAβ-Gal染色，衰老細胞胞漿為藍色。在BLM初次給藥4個月后，處理組小鼠冰凍切片中藍色細胞明顯比未處理組小鼠多，說明處理組小鼠在4個月時肺組織中存在較多衰老細胞（圖5，封四）。

3 討論

BLM單次給藥肺纖維化模型易于操作，在闡明肺纖維化與細胞因子、生長因子[6]信號通路上具有重要作用，如TGF-β在肺纖維化過程中的作用[14]。但該模型并沒有復制出人IPF進展慢、不可逆這兩個重要特點[15]，且炎性反應較為明顯[11]，利用此模型篩選出的200多種治療手段，在臨床轉(zhuǎn)化后沒有取得預期結(jié)果[8]，該模型需要進一步優(yōu)化。

BLM多次給藥能造成小鼠肺持續(xù)性損傷，本研究觀察了BLM多次給藥造模過程中小鼠的動態(tài)變化，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠體重相對穩(wěn)定，肺局部反應持續(xù)存在。實驗結(jié)果證明，多次給藥肺纖維化模型具有肺纖維化不可逆、炎性反應明顯減弱等優(yōu)勢，多次給藥模型更接近臨床人類肺纖維化疾病的發(fā)展進程。因此，我們希望能利用多次給藥模型進行抗纖維化藥物篩選及藥效學評價，為臨床有效治療肺纖維化提供更多的參考。

目前肺纖維化發(fā)病機制尚不明確[16]，之前認為是由慢性炎癥引起肺纖維化[17]，但抑制炎性反應阻止肺纖維化的發(fā)展未取得預期效果。近年來研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細胞損傷在肺纖維化發(fā)生過程中起重要作用[18]，相比單次給藥，多次給藥模型小鼠炎性反應減少且有明顯的肺泡上皮細胞增生[11，19]，這是多次給藥模型又一優(yōu)勢，在肺纖維化機制研究中具有重要意義，并能用于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、肺重塑和修復的評估[11]。

關(guān)于BLM肺纖維化模型的機制，之前觀點是BLM誘導DNA斷裂產(chǎn)生自由基誘導氧化應激反應[12]，引起細胞凋亡或壞死，產(chǎn)生炎性反應和纖維化。Aoshiba等[20]認為BLM誘導肺泡Ⅰ型細胞死亡，具有干細胞特性的肺泡Ⅱ型細胞增殖分化進行修復，但BLM造成Ⅱ型細胞損傷，修復過程受阻，纖維母細胞被激活遷移到上皮細胞間缺陷處，從而導致肺纖維化。肺泡Ⅱ型細胞的損傷及過度增殖導致細胞衰老，可能是肺纖維化發(fā)生的一種新機制。SAβ-Gal染色結(jié)果也證明BLM處理組4個月的小鼠肺組織中出現(xiàn)細胞衰老的現(xiàn)象。通過清除衰老細胞是否可以治療肺纖維化疾病，這將是我們下一步研究的重點，也許是肺纖維化疾病的一個新的治療方向。

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（收稿日期：2016-10-13 本文編輯：張瑜杰）