曾慶華++宋偉華++樊琛++孫小凡

摘要：參照GB/T5009 199-2003，采用酶抑制-比色法進(jìn)行檢測(cè)，分析山東省聊城市水果、蔬菜的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留狀況。結(jié)果表明，有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留以水果類為最多，其次是根莖類和果菜類，葉菜最少；在蔬菜中農(nóng)藥殘留較多的是蘿卜、蒜薹，較少的3種是菜花、辣椒、白菜；水果中農(nóng)藥殘留較多的為柑橘，較少的為山楂；未檢測(cè)出農(nóng)藥殘留超標(biāo)樣品，證明果蔬安全狀況已經(jīng)大為改善。酶抑制-比色法存在一定的誤差，還需提高酶源穩(wěn)定性和靈敏性，改進(jìn)樣品提取工藝。

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留；有機(jī)磷；氨基甲酸酯；果蔬；酶抑制-比色法；山東省聊城

中圖分類號(hào)：O656.31；S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）21-5634-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.051

Detection on Organophosphorus and Carbamate Pesticide Residues of Fruits and Vegetables with Enzyme Inhibition-colorimetry

ZENG Qing-hua， SONG Wei-hua， FAN Chen， SUN Xiao-fan

（Department of Food Science and Engineering， Liaocheng Univercity， Liaocheng 252059， Shandong， China）

Abstract： The GB5009/199-2003 was used as testing standard， the enzyme inhibition-colorimetric method was adopted to detect and analyze the organophosphorus and carbamate pesticide residues of fruits and vegetables in Liaocheng of Shandong province. The results showed that， there were the most organophosphorus and carbamate pesticide residues in the fruit category， followed by the root and fruit vegetables， while the least of which was the leaf vegetables. The maximum pesticide residues were found in radish and garlic， while the minimum were in cauliflower， pepper and cabbage in the vegetable category. The maximum pesticide residue was found in citrus， while the minimum was in hawthorn in the fruit category. No excessive residual sample was detected， which indicated that the security situation had been significantly improved in fruits and vegetables. There were a certain errors in enzyme inhibition-colorimetry， greater efforts should be made to improve the stability and sensitivity of the enzyme source， and the sample extraction process.

Key words： pesticide residues； fruits； vegetables； enzyme inhibition-colorimetry

農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在為人類帶來經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)，也對(duì)人類健康和環(huán)境安全造成一定的威脅。中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，糧食、蔬菜和水果種植面積大、品種多，不合理使用農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)相當(dāng)嚴(yán)重[1，2]。全國(guó)蔬菜每年使用殺蟲劑達(dá)到8.25萬t以上[3]，農(nóng)藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象普遍存在[4-12]，常用的高毒殺蟲劑以有機(jī)磷和氨基甲酸酯類為主[13]，對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)在實(shí)踐中尤為重要。

農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法較多，各有利弊。氣相色譜法精確度和靈敏度高，但檢測(cè)成本高，不適合快速檢測(cè)，不能檢測(cè)熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥；液相色譜法可以用于分析熱穩(wěn)定性差的液體化合物，也可以分析高沸點(diǎn)、難揮發(fā)化合物，但檢測(cè)成本高，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)；薄層色譜法操作難度較大；免疫法檢測(cè)（酶聯(lián)免疫法、熒光免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法等）檢測(cè)精確度高、耗時(shí)短，但需要使用抗體試劑，價(jià)格昂貴，不適宜大批量樣品的篩選檢測(cè)。常見的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法還有酶抑制法、生物傳感器法、活體檢測(cè)法、免疫分析法和化學(xué)法-速測(cè)靈法[14]等，其中酶抑制法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，已成為蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥快速檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法[15]。市面上的膽堿酯酶主要是乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶[16]，本研究采用乙酰膽堿酯酶酶抑制-比色法檢測(cè)果蔬農(nóng)殘。

同一種酶因來源不同，提取、保存方法不同，檢測(cè)靈敏度也不同[17，18]；酶源不同，其最適反應(yīng)溫度、pH及反應(yīng)時(shí)間也會(huì)有所差別[19-21]。對(duì)酶抑制比色檢測(cè)法來說，酶反應(yīng)初始階段吸光度上升快，基本呈線性增加，農(nóng)藥殘留的濃度對(duì)吸光度作用效果明顯，宜采用反應(yīng)開始3～5 min吸光度的變化值來計(jì)算抑制率[22]；而膽堿酯酶在20～40 ℃時(shí)活性較強(qiáng)，靈敏度高；溶液pH為7.0～8.0是最佳測(cè)試條件。因此，本研究酶反應(yīng)條件設(shè)為溫度20～30 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 min、溶液pH 8.0。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果蔬共30個(gè)批次，398個(gè)樣品，取樣時(shí)間為2014年11月。蔬菜包括葉（花）菜類、鱗（根）莖類、甘藍(lán)類、果菜類和豆類，水果包括漿果類、核果類、柑橘類等。大部分樣品是從亞太農(nóng)都交易市場(chǎng)隨機(jī)抽取，少量由個(gè)體戶、家庭農(nóng)場(chǎng)或政府部門送檢。

檢測(cè)所用試劑購自深圳市安鑫寶科技發(fā)展有限公司。試劑配制方法和保存條件如下：

緩沖溶液，1包磷酸緩沖劑加1 000 mL去離子水，攪拌溶解，制成pH 8.0緩沖溶液，室溫保存。顯色劑，1瓶顯色劑加25 mL緩沖溶液，4 ℃冰箱保存。底物，1瓶底物加入10 mL緩沖溶液，4 ℃冰箱保存。乙酰膽堿酯酶，1瓶酶液加18 mL緩沖溶液，4 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與設(shè)備

SPR-88C型高速大容量農(nóng)殘檢測(cè)儀，深圳市安鑫寶科技發(fā)展有限公司；HY-5型回旋式振蕩器，金壇市科興儀器廠；JY/YP2002型電子天平，精確度0.01 g，上海上天精密儀器有限公司；KQ-100B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；微量移液器，規(guī)格0～5 mL、20～200 μL、5～50 μL；定性濾紙、燒杯、秒表、溫度計(jì)、濕度計(jì)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)步驟 試驗(yàn)步驟如下：待檢樣品處理→檢測(cè)板加樣→抑制反應(yīng)→顯色反應(yīng)→檢測(cè)→結(jié)果判定→復(fù)檢。

1.3.2 檢測(cè)方法 參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。

1）樣品的提取。對(duì)于體積較大的水果、果實(shí)類蔬菜，去掉表面泥土，用削皮器取皮，剪成1 cm2左右的小塊，稱取2 g放入燒杯中，加入10.00 mL緩沖液，振蕩器振蕩提取2 min，過濾取濾液，靜置3～5 min待用。對(duì)于蒜、山楂、棗、葡萄等較小的樣品采用整顆浸泡的方法，對(duì)于蔥、韭菜等容易出現(xiàn)假陽性的樣品用分段提取的方法。

2）樣品的檢測(cè)。用微量移液器在安鑫寶專用的檢測(cè)板的A1、A2、A3、A4 4個(gè)孔位分別加入150 μL緩沖溶液為空白對(duì)照，其余孔位分別用移液器加入150 μL的樣品提取液。各孔位均加入50 μL酶液、50 μL顯色劑。檢測(cè)板放入通道內(nèi)設(shè)置振板速度為中速，振動(dòng)10 s，靜止10 min，加入20 μL底物，迅速放到通道內(nèi)振動(dòng)10 s，點(diǎn)擊開始檢測(cè)，儀器便開始自動(dòng)檢測(cè)，3 min后儀器顯示吸光度變化和抑制率等結(jié)果。

1.4 結(jié)果判斷

以吸光度變化或抑制率判斷結(jié)果。樣品提取液對(duì)酶的抑制率在40%～50%之間時(shí)為弱陽性，樣品提取液抑制率大于50%時(shí)為陽性，小于40%為陰性。對(duì)于陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上。

抑制率=×100%；式中，ΔA0為對(duì)照溶液反應(yīng)3 min吸光度變化值；ΔAt為樣品溶液反應(yīng) 3 min吸光度變化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白組對(duì)果蔬農(nóng)藥殘留影響試驗(yàn)

2.1.1 同一空白對(duì)照組樣品吸光度與抑制率的關(guān)系 對(duì)外部送檢的22份樣品分兩批次進(jìn)行檢測(cè)，選擇同一空白對(duì)照組的部分原始檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，見表1和圖1。有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥濃度呈正相關(guān)。即在一定條件下，樣品農(nóng)藥殘留濃度越高，其吸光度變化值越小，抑制率越大。

2.1.2 不同空白對(duì)照組對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響 以所抽檢的娃娃菜為研究對(duì)象進(jìn)行平行與對(duì)照檢測(cè)[24]，選擇符合要求的空白對(duì)照組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（圖2），1-3孔位為同一空白對(duì)照組，4-6為同一空白對(duì)照組。可見，樣品平行測(cè)定結(jié)果在誤差允許范圍之內(nèi)，抑制率變化幅度較吸光度變化值大。在不同批次不同樣品農(nóng)殘比較時(shí)，用吸光度變化值判斷要比抑制率更準(zhǔn)確。

2.2 果蔬樣品農(nóng)藥殘留檢測(cè)

統(tǒng)計(jì)30個(gè)批次398個(gè)樣品的農(nóng)藥殘留情況，未檢出農(nóng)藥超標(biāo)樣品。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（表2）并比較農(nóng)藥殘留（圖3）。樣品種類中，農(nóng)藥殘留為葉菜類<果菜類<根莖類<水果類；在蔬菜中，農(nóng)藥殘留為蘿卜>蒜薹>芫荽>菠菜>芹菜>黃瓜>胡蘿卜>娃娃菜>西紅柿>扁豆>菜花>辣椒>白菜；水果農(nóng)藥殘留為柑橘>蘋果>梨>山楂。蘿卜、蒜薹、芫荽農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果偏高，可能是其次生物質(zhì)干擾所致。

3 小結(jié)與討論

3.1 結(jié)論

樣品農(nóng)藥殘留為葉菜類<果菜類<根莖類<水果類，在蔬菜中農(nóng)藥殘留為蘿卜>蒜薹>芫荽>菠菜>芹菜>黃瓜>胡蘿卜>娃娃菜>西紅柿>扁豆>菜花>辣椒>白菜，水果中農(nóng)藥殘留為柑橘>蘋果>梨>山楂。并未檢出農(nóng)藥殘留超標(biāo)樣品。

3.2 注意事項(xiàng)

酶抑制-比色法進(jìn)行農(nóng)藥殘殘留檢測(cè)，需要注意一些問題，控制不確定因素的影響[25]。

3.2.1 膽堿酯酶的影響 ①為確保酶的活性，酶試劑及底物要在低溫條件下保存。②檢測(cè)前需將試劑從冰箱取出，恢復(fù)至室溫后再進(jìn)行檢測(cè)，避免因低溫影響酶的活性。③如環(huán)境溫度變化較大，檢測(cè)時(shí)間對(duì)結(jié)果影響較大，需重新進(jìn)行對(duì)照測(cè)量。④加入的各種試劑量必須準(zhǔn)確，多加或少加都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。⑤加入底物時(shí)動(dòng)作要迅速，否則檢測(cè)時(shí)間出現(xiàn)偏差，影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

3.2.2 樣品處理的影響 樣品含有大量色素，如紫甘藍(lán)、胡蘿卜；或大量汁液，如山藥、檸檬；或豐富的膠質(zhì)和纖維素，若處理不當(dāng)，會(huì)干擾顯色，影響檢測(cè)結(jié)果。制樣時(shí)，樣品表面泥土較多應(yīng)擦去而不能用水沖洗。取樣要具有代表性，葉菜最好選取不同植株葉片的葉尖部分，樣品不能太碎，以免色素釋放。削皮取樣要防止將汁水帶入。除此之外，要嚴(yán)格控制提取時(shí)間，時(shí)間過短不能充分提取，過長(zhǎng)會(huì)將色素浸出。樣品混濁時(shí)使用定性濾紙過濾或者延長(zhǎng)靜置時(shí)間。部分果蔬如蔥、姜、蒜、韭菜、辣椒、胡蘿卜、芹菜、芫荽、茭白、蘑菇中含有酶抑制物質(zhì)，與農(nóng)藥作用效果相似，應(yīng)針對(duì)不同情況采取措施[26]。

3.3.3 操作者的影響 檢測(cè)過程主要是微量試劑間進(jìn)行反應(yīng)，注意移液槍的使用，吸取液體之前要進(jìn)行潤(rùn)洗。試驗(yàn)中配液用水均為一級(jí)純凈水，不可用桶裝純凈水代替，容器使用前要嚴(yán)格按照自來水沖洗→超聲波清洗→自來水蕩洗→純凈水沖洗2～3遍→倒置晾干步驟進(jìn)行清洗，防止殘留污染待檢測(cè)液。

3.2.4 酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥種類有限 酶抑制法只能檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留，對(duì)某些硫代磷酸酯類農(nóng)藥（如伏殺硫磷）和菊酯類農(nóng)藥靈敏度不高，只能用于蔬菜的初篩。后續(xù)需對(duì)農(nóng)藥超標(biāo)量進(jìn)行定性定量分析，方能作出結(jié)論。

3.3 展望

酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留技術(shù)減少了工作量，提高了分析效率，保證流通蔬菜的安全性。酶試劑對(duì)快檢儀的檢測(cè)結(jié)果有直接影響，在應(yīng)用農(nóng)殘快檢儀進(jìn)行快速篩查檢測(cè)時(shí)，對(duì)同一批樣品最好使用同一批次、同一來源的酶試劑，以避免酶差異對(duì)結(jié)果的影響。植物的某些成分會(huì)對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此在提高酶源穩(wěn)定性和靈敏性，改進(jìn)樣品提取工藝等方面，還需進(jìn)一步研究探討，使快速農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)更便捷、更準(zhǔn)確。

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