吳 也，凌保東,2，宋 麗，莫金秋，廖洪利,2△

1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610083)；2.四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點實驗室(成都 610083)

花椒屬環(huán)八肽Zanriorb A1的固相合成*

吳 也1，凌保東1,2，宋 麗1，莫金秋1，廖洪利1,2△

1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610083)；2.四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點實驗室(成都 610083)

目的 合成能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞凋亡的花椒屬環(huán)八肽Zanriorb A1。 方法 通過9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法，以2-氯三苯基氯樹脂(CTC)為載體，F(xiàn)moc-Gly-OH為起始原料，N,N-二異丙基乙胺(DIEA)/6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)為縮合體系，在液相經(jīng)1-羥基苯并三氮唑(HOBt)/苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸(PyBOP)/DIEA實現(xiàn)環(huán)合，所得化合物通過RP-HPLC、MS等光譜表征。 結(jié)果 通過本法順利得到純度>98%的花椒屬環(huán)八肽Zanriorb A1，總收率為48%。 結(jié)論 該合成方法具有可行性，操作簡單，總收率高，目標(biāo)化合物可用于抗Jurkat細(xì)胞的藥物研究。

Zanriorb A1；花椒屬；Jurkat細(xì)胞；固相合成；環(huán)肽

蕓香科花椒屬，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，有250多個種類。該類植物的樹葉和樹皮化學(xué)成分主要包括生物堿、酰胺、香豆素、木酚素及萜類等化合物[1]，具有消炎[2]、鎮(zhèn)痛[3]、解痙[4]和驅(qū)蟲[5]等藥理活性。Dos等[6]從花椒屬riedelianume的枯葉中分離得到一種新型環(huán)八肽Zanriorb A1，其能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞的凋亡(IC50 218 nM)，這是繼柑橘屬[7]、吳茱萸屬[8]和黃皮屬[9]之后，又一個蕓香科中具有生物活性的環(huán)肽，隨著環(huán)肽的重新定義[10],這一類分子正逐漸成為有前景的藥物研發(fā)途徑。

Zanriorb A1由8個氨基酸殘基構(gòu)成，結(jié)構(gòu)為：Cyclic[Gly-Phe-Phe-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly](圖 1)，相對分子質(zhì)量為806.38 Da。國內(nèi)外關(guān)于Zanriorb A1的化學(xué)合成未見文獻(xiàn)報道，本研究旨在通過Fmoc固相合成法，獲得目標(biāo)產(chǎn)物，為其進(jìn)一步的藥物開發(fā)提供原料，以及規(guī)模化制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：氣浴恒溫振蕩器(常州國宇儀器制造有限公司)；低溫冷卻循環(huán)泵(上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司)；LC-6A制備液相色譜儀、Prominence LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；6538 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)。試劑：Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)、Fmoc-Phe-OH(苯丙氨酸)、Fmoc-Pro-OH(脯氨酸)、2-氯三苯基氯樹脂、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(上海吉爾生化有限公司)；N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸(PyBOP)、三氟乙酸(TFA)，乙腈(色譜純)(北京百靈威科技有限公司)；茚三酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、哌啶、甲醇均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)。

圖1 Zanriorb A1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2 方法

1.2.1 Zanriorb A1的直鏈合成 本研究首先合成Zanriorb A1的前體直鏈肽(圖2)。取2-氯三苯基氯樹脂500 mg(載樣量為0.20 mmol/g)加入到固相合成反應(yīng)管中，用DCM浸泡20 min使樹脂充分溶脹，抽干待用。將Fmoc-Gly-OH(297 mg，1 mmol)和DIEA(365.0 μL，2 mmol)混溶于7 mL DMF，加入到樹脂中搖晃3 h，依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次，然后加入7 mL MeOH反應(yīng)20 min，封閉未反應(yīng)的樹脂。樹脂洗凈后，加入20 %哌啶-DMF溶液10 mL，振蕩10 min×2脫去Gly上的Fmoc保護(hù)基，依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次。隨后根據(jù)多肽序列將Fmoc-氨基酸(1 mmol)、HCTU(0.9 mmol)和DIEA(2 mmol)混溶于7 mL DMF，加入到樹脂中，分別振蕩1 h，重復(fù)脫保護(hù)→縮合→脫保護(hù)的操作步驟，依次偶聯(lián)Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH，直到所有氨基酸連接完成。縮合反應(yīng)中通過Kaiser試劑(茚三酮定性顯色)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。

圖2 Zanriorb A1的合成路線

1.2.2 直鏈肽的游離 直鏈完成后，將樹脂洗凈抽干，加入TFA∶DCM =1∶1(V/V)15 mL，室溫振蕩1 h，使直鏈肽與樹脂分離，過濾，用少許TFA洗滌樹脂，減壓濃縮濾液得直鏈肽粗品，對其進(jìn)行HR-Q-TOF-MS(高分辨基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)測試。

1.2.3 液相環(huán)合 將HOBt(5 eq)、PyBOP(5 eq)、DIEA(10 eq)和DMF(1 mL)溶于適量DCM中，氬氣置換3遍，于0 ℃緩慢滴入直鏈肽的DCM溶液，使得肽液的最終濃度為0.5 mg/mL。滴畢自然升至室溫攪拌，1 h后濃縮反應(yīng)液即得Zanriorb A1粗品。

1.2.4 Zanriorb A1的分離純化和質(zhì)譜鑒定 將粗肽用甲醇溶解，通過制備型反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)純化。制備柱色譜條件：Grace Vydac “Peptide C18”柱(250×10 mM，10 μM)；檢測波長214 nm；流動相A為0.1% TFA乙腈溶液，流動相B為0.1% TFA水溶液，梯度洗脫(0～40 min，流動相B：90%～0%)；流速4.0 mL/min。制備過程中收集主峰，冷凍干燥后即得目標(biāo)產(chǎn)物，然后對Zanriorb A1純品進(jìn)行HPLC分析和HR-Q-TOF-MS鑒定。

2 結(jié)果

2.1 Zanriorb A1純品的分析

所得Zanriorb A1純品39 mg，狀態(tài)為白色粉末，總收率為48%。采用RP-HPLC對其進(jìn)行純度和含量的測定，并對液相流出曲線中的色譜峰面積定量積分。結(jié)果顯示：除去5 min以前的溶劑峰，另外3個色譜峰的保留時間分別為17.422、20.734和21.799 min，峰面積比分別為0.434%、98.979%和0.595%(圖3、表1)，故樣品純度>98%。HPLC分析條件：分析柱：Grace Vydac “Protein & Peptide C18”(250 × 4.6 mM, 5 μM)；檢測波長214 nm；流動相A為0.1% TFA乙腈溶液，流動相B為0.1% TFA水溶液，梯度洗脫(0～35 min，流動相B：90%～0%)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

>圖3 Zanriorb A1純品的HPLC圖

表1 Zanriorb A1純品的HPLC定量分析

2.2 Zanriorb A1環(huán)合前后的質(zhì)譜分析

經(jīng)HR-Q-TOF-MS鑒定，環(huán)合前的Zanriorb A1直鏈肽的理論分子量為[M+H]+=825.39，[M+Na]+=847.39，實際分子離子峰為[M+H]+=825.3946，[M+Na]+=847.3766(圖4)，理論分子量和實際分子量相差在正負(fù)1之間，故可認(rèn)為所合成的Zanriorb A1直鏈肽正確。同理，環(huán)合后化合物脫去一分子水，分子量減少18，計算終產(chǎn)物理論分子量為[M+H]+=807.38，而上述所測純度>98%的Zanriorb A1純品質(zhì)譜實際觀測值為[M+H]+=807.3836(圖5)，與理論值相符，說明所得即為Zanriorb A1。

圖4 Zanriorb A1直鏈肽的HR-Q-TOF-MS圖

圖5 Zanriorb A1純品的HR-Q-TOF-MS圖

3 討論

以富集脯氨酸為代表的生物活性環(huán)肽可以作為一種潛在的新型抗腫瘤候選藥物，研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，脯氨酸基團(tuán)在定義環(huán)肽構(gòu)象和提供細(xì)胞毒機(jī)制方面有著重要的意義，這類化合物能夠直接作用于Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。Zanriorb A1是該類細(xì)胞毒性和凋亡活性較高的新型環(huán)肽，但由于自然界中花椒屬riedelianume體內(nèi)含有的Zanriorb A1非常少(3 kgriedelianume枯葉中僅分離得到16 mg的Zanriorb A1[6])，且成分復(fù)雜，如何提取分離成為研究Zanriorb A1前期必須解決的一道難題。

本研究首次采用Fmoc多肽固相合成法，對Zanriorb A1的全合成進(jìn)行了研究。在Zanriorb A1的序列中，苯丙氨酸和脯氨酸所在位置均是環(huán)合位阻較大的位點，而2個甘氨酸之間位阻最小，更加容易環(huán)合；并且選用沒有光學(xué)活性的甘氨酸為C端殘基，能夠減小多肽合成中消旋的風(fēng)險，提高合成產(chǎn)率。Zanriorb A1的合成載體采用了CTC樹脂。該樹脂滿足以下條件：負(fù)載在其上的多肽分子切割后可直接生成端基為羧基的多肽，符合環(huán)肽的合成需要；甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和絲氨酸等如果處在C端第1位或第2位時，發(fā)生分子內(nèi)胺解環(huán)化的傾向極強(qiáng)，繼而導(dǎo)致載體的連接基團(tuán)發(fā)生斷裂，肽鏈合成無法繼續(xù)進(jìn)行，而CTC樹脂結(jié)構(gòu)上的位阻效應(yīng)可以避免這種情況的發(fā)生[13]；以CTC樹脂作為載體，省時省力，經(jīng)濟(jì)實惠，適合工業(yè)化生產(chǎn)。 氨基酸縮合常用的體系有DCC-HOBt、DIC-HOBt、TBTU-DIEA、HATU-DIEA、HCTU-DIEA、PyAOP-HOAt-DIEA和PyBOP-HOBt-DIEA等。其中HCTU和PyBOP體系縮合效率高，反應(yīng)速度快，不易發(fā)生消旋，且廉價易得，有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值，故在本研究直鏈合成的過程中選擇HCTU-DIEA，環(huán)合反應(yīng)的關(guān)鍵步驟優(yōu)選PyBOP-HOBt-DIEA為縮合試劑，并且取得了良好的效果。

綜上所述，在本研究的合成工藝下，所得Zanriorb A1純度>98%，總收率為48%。其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜確證，合成方法簡單易行，反應(yīng)條件溫和，總收率高，合成得到的目標(biāo)化合物為其進(jìn)一步的藥理學(xué)、藥效學(xué)研究提供原料，并為其規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

[1]孫小文, 段志興. 花椒屬藥用植物研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 1996, 31(3): 231-240.

[2]Chen J J, Wang T Y, Hwang T L. Neolignans, a coumarinolignan, lignan derivatives, and a chromene: anti-inflammatory constituents from Zanthoxylum avicennae[J]. J Nat Prod, 2008, 71(2): 212-217.

[3]Lima L M, Perazzo F F, Tavares Carvalho J C,etal. Anti-inflammatory and analgesic activities of the ethanolic extracts from Zanthoxylum riedelianum (Rutaceae) leaves and stem bark[J]. J Pharm Pharmacol, 2007, 59(8): 1151-1158.

[4]Jullian V, Bourdy G, Georges S,etal. Validation of use of a traditional antimalarial remedy from French Guiana, Zanthoxylum rhoifolium Lam[J]. J Ethnopharmacol, 2006, 106(3): 348-352.

[5]Navarrete A, Hong E. Anthelmintic properties of alpha-sanshool from Zanthoxylum liebmannianum[J]. Planta Med, 1996, 62(3): 250-251.

[6]Dos S Beirigo P J, Torquato H F, Dos Santos C H,etal. [1-8-NαC]-Zanriorb A1, a Proapoptotic Orbitide from Leaves of Zanthoxylum riedelianum[J]. J Nat Prod, 2016, 79(5): 1454-1458.

[7]Morita H, Takeya K. Bioactive Cyclic Peptides from Higher Plants[J]. Heterocycles , 2010, 80(2): 739-764.

[8]Eggleston D S, Baures P W, Peishoff C E,etal. Conformations of cyclic heptapeptides: crystal structure and computational studies of evolidine[J]. J Am Chem Soc, 1991, 113(12): 4410-4416.

[10] Arnison P G, Bibb M J, Bierbaum G,etal. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature[J]. Nat Prod Rep, 2013, 30(1): 108-160.

[11] Napolitano A, Rodriquez M, Bruno I,etal. Synthesis, structural aspects and cytotoxicity of the natural cyclopeptides yunnanins A, C and phakellistatins 1, 10[J]. Tetrahedron, 2003, 59(51): 10203-10211.

[12] Pettit G R, Lippert J W 3rd, Taylor S R,etal. Synthesis of phakellistatin 11: a micronesia (Chuuk) marine sponge cyclooctapeptide[J]. J Nat Prod, 2001, 64(7): 883-891.

[13] 林浩, 王德心. 哌嗪二酮衍生物的合成研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2003, 38(5): 395-400.

The Solid-phase Synthesis of Zanriorb A1 of Zanthoxylum Cyclic Octapeptide

WuYe1，LingBaodong1,2,SongLi1,MoJinqiu1，LiaoHongli1,2△.

1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.KeyLaboratoryofSmallMoleculeSpecialStructureDrugsofSichuanInstitutionofHigherEducation,Chengdu610083,China

Objective To synthesize the Zanriorb A1 of zanthoxylum cyclic octapeptide which can induce the apoptosis of Jurkat cells. Methods The Fmoc solid-phase polypeptide synthesis (SPPS) was used with 2-chlorotrityl chloride resin as a solid support, Fmoc-Gly-OH as the starting material, and DIEA/HCTU as a condensation system. The cyclization was achieved in the liquid phase by HOBt/PyBOP/DIEA, and the target peptide was confirmed by RP-HPLC and MS. Results The Zanriorb A1 of zanthoxylum cyclic octapeptide was synthesized with the final purity of over 98% and the overall yield of 48%. Conclusion The synthetic method was feasible, simple and practical with high yield, and the desired target peptide could be used for drug screening of anti-Jurkat cells.

Zanriorb A1; Zanthoxylum; Jurkat cells; Solid-phase synthesis; Cyclic peptide

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170111.1045.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.010

四川省高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊項目資助(No:13TD0028)

R79；R914.5

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△通信作者：廖洪利，E-mail：liaohl213@126.com