郝少娟 金蕾 李辰龍 王慧君 鄭楓蕓 馬端 張?zhí)煊?/p>

·基礎(chǔ)研究·

先天性小耳畸形候選致病基因的篩選△

郝少娟 金蕾＊李辰龍 王慧君 鄭楓蕓 馬端＊＊張?zhí)煊?/p>

目的 應(yīng)用Affymetrix SNP 6.0芯片技術(shù)篩選先天性小耳畸形的候選致病基因。方法 對(duì)3例小耳畸形患者血液基因組進(jìn)行Affymetrix SNP 6.0芯片分析, 采用Birdseed軟件分析樣本的芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)Minor Allele Frequency對(duì)在患者和漢族人參考樣本中有顯著差異的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行篩選。結(jié)果 得到SNP相關(guān)基因4 180個(gè)，根據(jù)已知文獻(xiàn)收集和耳部發(fā)育相關(guān)并被SNP 6.0注釋的基因共5個(gè)，包括MSX1，MSX2，GSC，HOXA2和PRKRA。結(jié)論 應(yīng)用Affymetrix SNP 6.0芯片技術(shù)篩選出5個(gè)先天性小耳畸形的候選致病基因，分別是MSX1，MSX2，GSC，HOXA2和PRKRA。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2017，17：113-115)

先天性小耳畸形；芯片；GSC；HOXA2；PRKRA；MSX1；MSX2

先天性發(fā)育不良是一類由于發(fā)育相關(guān)基因改變或者基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制異常而導(dǎo)致的疾病，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。先天性小耳畸形是發(fā)病率僅次于唇腭裂的頜面部發(fā)育異常，目前認(rèn)為是由多個(gè)基因和環(huán)境因素共同作用而引起的復(fù)雜遺傳病。由于先天性小耳畸形的表型多樣性和遺傳異質(zhì)性，使得定位和克隆先天性小耳畸形致病基因十分困難。隨著基因分型技術(shù)的成熟、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)的迅速發(fā)展以及人類基因組單倍體圖譜的構(gòu)建和不斷升級(jí)，應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析尋找先天性發(fā)育異常疾病的遺傳學(xué)病因已經(jīng)成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。

候選基因關(guān)聯(lián)性研究可以從基因的分子水平和動(dòng)物水平分別進(jìn)行探索，但是基因多態(tài)性的研究效率相對(duì)較低，故需要應(yīng)用芯片技術(shù)進(jìn)行高通量分析。全基因組關(guān)聯(lián)研究就是通過(guò)大量樣本的征集并對(duì)其進(jìn)行全基因組水平上的基因分型，從基因分型結(jié)果中挑選出與疾病性狀相關(guān)聯(lián)的序列變異。由于高通量SNP分型技術(shù)的發(fā)展，使應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定復(fù)雜遺傳病的相關(guān)基因成為可能，已被證明是一種有效的研究手段[1-2]，并且已經(jīng)應(yīng)用到糖尿病、精神分裂癥、冠心病等疾病候選致病基因的篩選研究中?；诖饲疤幔狙芯坷肁ffymetrix SNP 6.0芯片對(duì)先天性小耳畸形候選致病基因和易感位點(diǎn)進(jìn)行篩查。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究在通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)后進(jìn)行。所有患者均自愿參加研究，簽署知情同意書后進(jìn)行詳細(xì)的病例信息登記?；颊咧橇?、眼、心、腦、腎和四肢等其他系統(tǒng)無(wú)明顯異常。進(jìn)行Affymetrix SNP 6.0芯片檢測(cè)的3例患者臨床信息見表1。

表1 Affymetrix SNP 6.0芯片檢測(cè)3例樣本病例信息

注：“-”表示無(wú)

1.2 方法 抽取患者外周靜脈血約5 mL于EDTA抗凝管中，來(lái)回顛倒數(shù)次后分裝至2 mL的EP管中，其中一管分裝400 μL保存于-20 ℃冰箱備用，余樣本于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。按照標(biāo)準(zhǔn)步驟抽提血液基因組DNA，采用Thermo Nanodrop DNA純度濃度測(cè)量?jī)x測(cè)定DNA純度和濃度，確保OD260/OD280在1.7～1.9之間，濃度>50 ng/μL。由于Affymetrix SNP 6.0芯片技術(shù)對(duì)雙鏈DNA質(zhì)量要求較高，因此用瓊脂糖凝膠電泳和紫外線凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)DNA是否發(fā)生降解。合格的樣本進(jìn)行Affymetrix SNP 6.0芯片檢測(cè)差異性SNP，由北京博奧生物有限公司生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室完成。

2 結(jié)果

采用Birdseed軟件分析樣本的芯片數(shù)據(jù)，得到每個(gè)樣本中所有SNP探針的分型信息。通過(guò)Minor Allele Frequency對(duì)在患者和漢族人參考樣本中有顯著差異的SNP進(jìn)行篩選，如果一個(gè)探針在2個(gè)以上樣本中沒(méi)有信號(hào)值，或在漢族人群中分型頻率未知，不做計(jì)算。

經(jīng)過(guò)此處理，最后得到大約783 746個(gè)SNP探針。這些探針上下游相對(duì)應(yīng)的基因有25 018個(gè)，計(jì)算每個(gè)SNP探針相對(duì)應(yīng)的在各個(gè)樣本中Minor Allele的頻率值，并將其與漢族人群中的頻率值進(jìn)行比較得到一個(gè)差異值。取P值顯著性水平為1%，得到兩尾區(qū)間顯著的SNP約19 365個(gè)，這些SNP相關(guān)的基因有4 180個(gè)。根據(jù)已知文獻(xiàn)收集和耳部發(fā)育相關(guān)并被SNP 6.0注釋的基因共5個(gè)，包括MSX1，MSX2，GSC，HOXA2和PRKRA。

3 討論

先天性小耳畸形的遺傳特點(diǎn)不符合孟德爾遺傳規(guī)律，故對(duì)其遺傳分析和致病基因的定位存在一定難度。現(xiàn)認(rèn)為參與先天性小耳畸形發(fā)生的基因可能有多個(gè)，對(duì)多個(gè)微顯性SNP的篩選需要高通量芯片的支持。目前芯片技術(shù)種類繁多，可以滿足不同研究層面的需求，包括SNP芯片、DNA甲基化芯片、miRNA表達(dá)譜芯片等，廣泛應(yīng)用于關(guān)聯(lián)研究、連鎖分析、拷貝數(shù)變異分析、基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域，成為篩選疾病候選致病基因和探索疾病發(fā)生機(jī)制的重要手段?；赟NP芯片技術(shù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析是目前研究復(fù)雜疾病遺傳學(xué)的主要手段[3-5]。本研究采用的Affymetrix SNP 6.0芯片覆蓋位點(diǎn)包括906 600個(gè)SNP探針，同時(shí)還包含946 000個(gè)拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)探針。SNP和CNV 2種探針緊密均勻地分布在整個(gè)基因組，與其他同類芯片相比在性能、準(zhǔn)確性和檢測(cè)范圍方面都有提高，這給疾病易感性高通量研究帶來(lái)極大的方便。

通過(guò)對(duì)3例先天性小耳畸形患者血液基因組進(jìn)行Affymetrix SNP 6.0芯片掃描分析后獲得5個(gè)候選致病基因，分別是MSX1，MSX2，GSC，HOXA2和PRKRA。MSX1,MSX2屬于同源核轉(zhuǎn)錄因子，兩者在遷移前后的神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cell，NCC)、咽弓和中鼻突間充質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)[6]，影響脊椎動(dòng)物顱面部各器官的發(fā)育[7]。小鼠模型結(jié)果顯示MSX1和MSX2表達(dá)異常導(dǎo)致小鼠第一腮弓分化區(qū)域畸形[8-9]。GSC基因表達(dá)在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有時(shí)相性，并對(duì)NCC的遷移有很重要的作用[10]。小鼠模型實(shí)驗(yàn)證明，GSC的缺失或突變可以導(dǎo)致頜面部復(fù)合畸形，如中外耳發(fā)育缺陷和下頜骨發(fā)育不良[11]；先天性小耳畸形家系研究發(fā)現(xiàn)，HOXA2功能異?；蛉笔Э梢砸鹇犛X(jué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)畸形，可以累及中外耳甚至內(nèi)耳[12]。HOXA2基因敲除小鼠表現(xiàn)為寬大的腭裂和中外耳發(fā)育畸形，并且由于無(wú)法進(jìn)行正常喂養(yǎng)多數(shù)在出生后24 h內(nèi)死亡[13-15]。PRKRA基因含有多個(gè)重要的功能區(qū)，參與了細(xì)胞周期阻滯、mRNA前體剪接和加工等重要的生理過(guò)程[16]。小鼠PRKRA基因單拷貝破壞后發(fā)現(xiàn)小鼠體積減小，明顯的小耳畸形和中耳發(fā)育異常[17]。由此我們認(rèn)為，此5個(gè)基因與耳部發(fā)育密切相關(guān)，它們的改變可能引起先天性小耳畸形的發(fā)生。

在基因組水平，由單個(gè)核苷酸變化引起的DNA序列多態(tài)性被稱為SNP。SNP通常只涉及單個(gè)堿基的改變，可以由于轉(zhuǎn)換或顛換引起，也可由于插入或缺失所致?；蚪MDNA中任何堿基均有可能發(fā)生變異，而位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP比較少，但它們?cè)谶z傳病研究中卻具有重要意義。本研究對(duì)芯片篩查的候選致病基因所有編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)大樣本測(cè)序驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)先天性小耳畸形的相關(guān)致病突變。

應(yīng)用Affymetrix SNP 6.0芯片技術(shù)對(duì)3例先天性小耳畸形患者基因組進(jìn)行掃描并分析，篩選出5個(gè)先天性小耳畸形的候選致病基因MSX1，MSX2，GSC，HOXA2和PRKRA。這5個(gè)基因的何種方式改變導(dǎo)致了先天性小耳畸形的發(fā)生仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本檢測(cè)驗(yàn)證。

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(本文編輯 楊美琴)

Screening of candidate genes for congenital microtia

HAOShao-juan,JINLei＊,LIChen-long,WANGHui-jun,ZHENGFeng-yun,MADuan＊＊,ZHANGTian-yu.

DepartmentofOtorhinolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

ZHANG Tian-yu，Email: ty.zhang2006@aliyun.com

Objective To screen the candidate genes for congenital microtia by using Affymetrix SNP 6.0. Methods Genome-wide scan in 3 patients of microtia was performed by using Affymetrix SNP 6.0 array. The data were analyzed by using Birdseed software, and SNPs were selected through Minor Allele Frequency. Results A total of 4 180 genes associated to the SNPs were acquired, and 5 of the genes played an important role in the development of ear according to the literatures, includingMSX1，MSX2，GSC，HOXA2 andPRKRA. Conclusions Five candidate genes have been identified by using Affymetrix SNP 6.0, includingMSX1，MSX2，GSC，HOXA2 andPRKRA. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:113-115)

Congenial microtia; Affymetrix;GSC;HOXA2;PRKRA;MSX1;MSX2

國(guó)家自然科學(xué)基金(81570934)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031；＊上海市兒童醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200062；＊＊復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院分子遺傳 研究室 上海 200032

張?zhí)煊?Email：ty.zhang2006@aliyun.com)

現(xiàn)在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科 鄭州 450000

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.02.010

2016-09-18)