劉之熙，朱克永，趙 楊，陳彥成

（湖南省水稻研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

5個(gè)常規(guī)香稻品種的指紋圖譜及遺傳相似性分析

劉之熙，朱克永，趙 楊，陳彥成

（湖南省水稻研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

利用48對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)源于同一優(yōu)質(zhì)香型材料80-66的5個(gè)常規(guī)香稻品種進(jìn)行了指紋分析及品種相似性和特異性分析，發(fā)現(xiàn)玉針香與玉柱香的遺傳差異最小，農(nóng)香18與玉針香、玉柱香的遺傳差異次之，創(chuàng)香5號(hào)與玉針香、玉柱香、農(nóng)香18的遺傳差異第三，而板倉(cāng)香糯為糯稻品種，與其它品種的遺傳差異均較大。結(jié)果表明：將數(shù)字身份證、指紋圖譜和坐標(biāo)圖形式的數(shù)字指紋三者結(jié)合，作為品種的指紋信息，可以更全面的反映該品種的特異性。

常規(guī)香稻品種；SSR標(biāo)記；指紋圖譜；品種相似性；品種特異性

水稻(Oryza sativa L)是世界上重要的糧食作物之一，全世界大約有1/3的人以水稻為主食。隨著水稻產(chǎn)量的提高及人們生活水平、生活質(zhì)量的提升，人們?cè)诔燥柕耐瑫r(shí)又提出了新的要求，更加注重稻米的食味品質(zhì)。自漢代以來(lái)，“江永香米”就是湖南永州地方的一張名片，香米不但清香可口，而且有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。近年來(lái)，湖南省高檔優(yōu)質(zhì)香稻的研究開(kāi)發(fā)成效顯著， 隨處可聞“湘米飄香”，一批新育成并通過(guò)審定的雙季、一季晩秈優(yōu)質(zhì)香稻品種，諸如玉針香 、玉柱香、農(nóng)香18、創(chuàng)香5號(hào)和板倉(cāng)香糯等，由于加工品質(zhì)及外觀品質(zhì)較好，具有濃郁的茉莉花香味，且食口性好，受到越來(lái)越多的消費(fèi)者歡迎，需求量也逐漸增加。近年來(lái)，鑒定和搜集發(fā)掘香稻種質(zhì)資源，將常規(guī)手段和分子生物學(xué)方法相結(jié)合進(jìn)行香稻育種研究已成為育種家們的研究熱點(diǎn)。而利用DNA分子標(biāo)記，是鑒定和發(fā)掘優(yōu)異種質(zhì)資源最為有效和快捷的方法。SSR (Simple Sequence Repeats)標(biāo)記由于具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[1-2]、種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性的研究[3-4]、基因的定位與分離[5-6]、品種純度鑒定[7-9]等方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。利用SSR標(biāo)記構(gòu)建水稻品種的DNA指紋圖譜，具有高度的個(gè)體特異性和遺傳穩(wěn)定性，有助于對(duì)不同品種進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)、合理利用，同時(shí)對(duì)優(yōu)異品種或材料實(shí)施知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)也具有十分重大的意義。

研究利用簡(jiǎn)單的DNA提取方法，優(yōu)化的PCR體系與程序，以及一套篩選的SSR標(biāo)記構(gòu)建了5個(gè)湖南省已經(jīng)通過(guò)審定的常規(guī)香稻品種的DNA指紋圖譜，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋進(jìn)行品種相似性和特異性分析，以期為常規(guī)香稻品種在分子水平上進(jìn)行實(shí)時(shí)高效鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

選用來(lái)源于同一優(yōu)質(zhì)香型材料80-66的5個(gè)常規(guī)香稻品種——玉針香、玉柱香、農(nóng)香18、創(chuàng)香5號(hào)和板倉(cāng)香糯為材料，均由湖南省水稻研究所培育而成，通過(guò)湖南省品種審定委員會(huì)審定，正在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。

1.2 SSR檢測(cè)

選取48對(duì)SSR核心引物，每條染色體上4對(duì)，均勻分布于染色體的長(zhǎng)、短臂或同一染色體臂的非緊密連鎖區(qū)。按推薦類型可分為首選核心引物(Ⅰ型)24個(gè)，分別是RM 297，RM 212，RM 208，RM 110，RM 232，RM 7，RM 273，RM 317，RM 274，RM 267，RM 253，RM 30，RM 336，RM 214，RM 310，RM 264，RM 219，RM 278，RM 304，RM330A，RM 224，RM 286，RM 17和RM l9；候補(bǔ)核心引物(Ⅱ型)24個(gè)，分別是RM 1195，RM 1，RM 71，RM 341，RM 85，RM 251，RM 5414，RM 307，RM480，RM 164，RM 190，RM 3，RM 18，RM 248，RM 337，RM 72，RM 201，OSR 28，RM 311，RM 216，RM 21，RM 202，RM 247和RM 309。

采用簡(jiǎn)單的DNA提取方法，優(yōu)化的PCR體系與程序，4%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析[10]。利用24對(duì)首選核心引物對(duì)所有水稻品種進(jìn)行指紋分析。對(duì)24對(duì)首選核心引物位點(diǎn)處指紋表現(xiàn)一致的水稻品種進(jìn)一步增加24對(duì)候補(bǔ)核心引物進(jìn)行分析。

1.3 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù) 48 對(duì)核心引物在5個(gè)常規(guī)香稻品種中的擴(kuò)增結(jié)果，以擴(kuò)增的帶型數(shù)記錄品種標(biāo)識(shí)，其中1表示擴(kuò)增的帶型數(shù)為1，2表示帶型數(shù)為2，3表示帶型數(shù)為3，構(gòu)建各品種的分子身份證(由48 位數(shù)字組成)。以各品種在每對(duì)引物位點(diǎn)處擴(kuò)增的圖譜作為該品種的指紋圖譜，并排定每對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量梯度，以48對(duì)引物位點(diǎn)為橫坐標(biāo)，擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量梯度為縱坐標(biāo)，將指紋圖譜轉(zhuǎn)化為坐標(biāo)圖形式的數(shù)字指紋。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以品種相似率(Similarity rate SR)描述2個(gè)品種間的遺傳相似程度，該參數(shù)表示2個(gè)品種在48 對(duì)SSR引物位點(diǎn)處擴(kuò)增帶型差異的程度。計(jì)算公式為 ：

SR（%）=LT-LD/LT×100

式中，LT為2個(gè)品種擴(kuò)增的位點(diǎn)總數(shù)，LD為2個(gè)品種擴(kuò)增帶型表現(xiàn)差異的位點(diǎn)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)常規(guī)香稻品種的分子身份證及指紋圖譜

利用48對(duì)水稻核心引物完成了5個(gè)常規(guī)香稻品種的DNA 指紋圖譜，得到的分子身份證及指紋圖譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和圖1。

表1 5個(gè)常規(guī)香稻品種的分子身份證

2.2 5個(gè)常規(guī)香稻品種的數(shù)字指紋

將5個(gè)常規(guī)香稻品種的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋發(fā)現(xiàn)，玉針香在染色體2上的RM208，染色體9上的RM278與其他品種有明顯變異；玉柱香在染色體2上的RM208，染色體3上的RM232、RM7，染色體4上的RM5414，染色體6上的RM253、RM3，染色體10上的RM216等7個(gè)位點(diǎn)處與其他品種有明顯變異；農(nóng)香18在染色體6上的RM3，染色體8上的RM264，染色體9上的RM201、OSR28，染色體10上的RM330A，染色體11上的RM21等6個(gè)位點(diǎn)處與其它品種有明顯變異；創(chuàng)香5號(hào)在染色體3上的RM85、RM251，染色體4上的RM307，染色體5上的RM274，染色體7上的RM336、RM214，染色體8上的RM310，染色體9上的RM278等8個(gè)位點(diǎn)處與其它品種有明顯變異；板倉(cāng)香糯在染色體2上的RM110、RM341、染色體3上的RM232、RM7、RM251，染色體4上的RM273、RM317，染色體6上的RM253，染色體7上的RM336、RM18、RM248，染色體8上的RM310、RM264，染色體9上的RM219，染色體10上的RM304，染色體12上的RM17、RM19等17個(gè)位點(diǎn)處與其他品種有明顯變異（圖2）。

2.3 5個(gè)常規(guī)香稻品種的遺傳相似性分析

對(duì)5個(gè)常規(guī)香稻品種在48對(duì)SSR引物位點(diǎn)處進(jìn)行兩兩比對(duì)，發(fā)現(xiàn)品種間相似率變幅為41.7%～85.4%，其中玉針香與玉柱香的品種相似率最大，為85.4%；農(nóng)香18與玉針香、玉柱香的品種相似率次之，分別為77.1%、75.0%；創(chuàng)香5號(hào)與玉針香、玉柱香、農(nóng)香18的品種相似率再次之，分別為64.6%、58.3%、64.6%；板倉(cāng)香糯與玉針香、玉柱香在5個(gè)品種間的品種相似率最小，均為41.7%（表2）。

圖1 5個(gè)常規(guī)香稻品種的指紋圖譜

圖2 5個(gè)常規(guī)香稻品種的數(shù)字指紋

上述結(jié)果表明，玉針香與玉柱香的遺傳差異最小，農(nóng)香18與玉針香、玉柱香的遺傳差異次之，創(chuàng)香5號(hào)與玉針香、玉柱香、農(nóng)香18的遺傳差異第三，而板倉(cāng)香糯與玉針香、玉柱香的遺傳差異最大。將每個(gè)品種的系譜與其指紋圖譜及品種間相似率聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)系譜上越接近的品種，其品種間的相似率越大，遺傳差異越小。如玉針香與玉柱香，因具有相同的親本湘晚秈10號(hào)，兩者的遺傳差異最小；而板倉(cāng)香糯為糯稻品種，因而與其他品種的遺傳差異均較大。

表2 5個(gè)常規(guī)香稻品種間的品種相似率

3 小結(jié)與討論

品種間形態(tài)差異和特征特性的不同，本質(zhì)上是由基因的差異所致。SSR標(biāo)記由于具有操作簡(jiǎn)便快捷、多態(tài)性高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確揭示不同品種間同一位點(diǎn)的多態(tài)性，已被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、比較基因組研究、遺傳多樣性分析、系統(tǒng)學(xué)研究以及品種純度與真實(shí)性的鑒定中。研究選用的48對(duì)SSR標(biāo)記，對(duì)5個(gè)來(lái)源于同一優(yōu)質(zhì)香型材料80-66的常規(guī)香稻品種進(jìn)行品種相似性和特異性分析，結(jié)果能很好地反映不同品種間的親緣關(guān)系，說(shuō)明選用的48對(duì)核心標(biāo)記具較好的區(qū)分能力，利用這48對(duì)標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜也是科學(xué)、可靠的。

以坐標(biāo)圖形式表示的數(shù)字指紋，因其既能清晰地反映各品種在每對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)處擴(kuò)增的條帶數(shù)目，也能清晰地反映各品種在每對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)處擴(kuò)增的條帶位置，因而比品種的數(shù)字身份證包含的信息更加豐富，比品種的指紋圖譜顯示的信息更加直觀。在對(duì)兩個(gè)或多個(gè)品種進(jìn)行比對(duì)時(shí)，坐標(biāo)圖形式的數(shù)字指紋的優(yōu)勢(shì)更加突出。因此，在構(gòu)建品種的指紋圖譜時(shí)，將數(shù)字身份證、指紋圖譜和坐標(biāo)圖形式的數(shù)字指紋三者有機(jī)結(jié)合，作為品種的指紋信息，可以更全面的反映該品種的特異性。

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（責(zé)任編輯：賀 藝）

Construction of DNA Fingerprints and Analysis of Genetic Similarity for 5 Inbrid Aromatic rice Varieties

LIU Zhi-xi，ZHU Ke-yong，ZHAO Yang，CHEN Yan-cheng
（Hunan Rice Research Institute, Changsha 410125, PRC）

Five aromatic rice varieties derived from the same high-quality flavor material 80-66, and registered in Hunan Province, China were assayed with a set of 48 microsatelite markers. The result from varietal similarity and distinctness analysis showed that genetic difference between Yuzhenxiang and Yuzhuxiang was the smallest, genetic differences between Nongxiang 18 and Yuzhenxiang, Yuzhuxiang were the second, and genetic differences between Chuangxiang 5 and Yuzhenxiang, Yuzhuxiang, nongxiang 18 were larger, in turn. Because of being a fragrant glutinous rice variety, Bancangxiangnuo got the largest genetic differences to the others. The combination of molecular identification, fingerprint map and coordinate map can be used as varietal fingerprint information, which can reflect varietal similarity and distinctness perfectly.

inbrid aromatic rice variety; microsatelite marker; fingerprint map; varietal similarity; varietal distinctness

Q341

：A

：1006-060X（2017）02-0006-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.002.002

2016-11-25

湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014YB07)

劉之熙（1981-），女，山西長(zhǎng)治市人，助理研究員，主要從事水稻、玉米分子育種和種子質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)研究。