張效云，輦曉峰，王文棟

制備小鼠支氣管肺泡灌洗液方法的改進

張效云，輦曉峰，王文棟

支氣管肺泡灌洗液；細胞計數(shù)；注射器

支氣管肺泡灌洗術(shù)是一種通過對支氣管肺泡灌洗技術(shù)，獲取肺泡灌洗液進行免疫細胞、炎癥因子和可溶性物質(zhì)檢查的方法，為某些呼吸道疾病的病情觀察、診斷和預(yù)后判定提供新途徑。醫(yī)學科研工作者經(jīng)常需要從小鼠動物模型制備支氣管肺泡灌洗液，其制備方法非常重要，操作者需要有較好的技術(shù)，既要保證灌洗液一定的數(shù)量以完成較多細胞因子等測定，又要保證足夠的細胞進行計數(shù)和分類。傳統(tǒng)的方法［1］是在處死小鼠后，鈍性剝離氣管，用三通管連接注射器將磷酸鹽緩沖液緩緩注入氣管，輕輕按摩后取出液體，但有部分支氣管灌洗液會從小鼠的口鼻中溢出，體積波動較大，結(jié)果不理想。經(jīng)探索和實踐，本實驗使用結(jié)扎遠心端氣管并直接采用2 mL注射器制備支氣管肺泡灌洗液，取得了良好的效果，并節(jié)約了費用，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物20只 C57BL／6雄性小鼠為健康清潔級，8周齡，體重（18±2）g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號 SCXK-2012-0004。標記動物后，分籠顆粒飼料飼養(yǎng)，溫度18～24℃，光暗周期 12 h，自由飲水進食。本實驗符合河北北方學院實驗動物倫理委員所制定的倫理學標準。

1.2 主要材料普通光學顯微鏡，小鼠固定操作臺，2 mL注射器，直型靜脈滯留針，三通管，磷酸鹽緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 實驗小鼠隨機分為改進組和傳統(tǒng)組，每組各10只。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液的制備及細胞計數(shù) 處死小鼠后，鈍性剝離氣管，傳統(tǒng)組按傳統(tǒng)方法制備支氣管肺泡灌洗液，即將直型靜脈滯留針插入氣管，退出針芯，連接三通管和注射器裝置輕輕插入氣管，用2支2 mL注射器，其中1支取1 mL磷酸鹽緩沖液，交替輕揉灌洗肺組織2次，輕輕按摩肺部，收獲支氣管肺泡灌洗液；改進組先將小鼠氣管的遠心端結(jié)扎，再將直型靜脈滯留針插入氣管，退出針芯，直接連接裝有1 mL磷酸鹽緩沖液的 2 mL注射器，輕揉灌洗肺組織 2次，輕輕按摩，收獲支氣管肺泡灌洗液。將兩種方法獲得的支氣管肺泡灌洗液 1 400 r／s離心 10 min，分離上清液準確測定體積。用100μL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，充入計數(shù)池在高倍顯微鏡下計數(shù)除上皮細胞及紅細胞外所有細胞（巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞等）的總數(shù)，以每毫升回收液的細胞數(shù)和灌洗液回收細胞的總數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以±s表示，采用獨立樣本 t檢驗進行兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液體積比較改進組小鼠獲取的支氣管肺泡灌洗液平均體積約為傳統(tǒng)組的 1.62倍，體積明顯增加，差異有顯著性（P＜0.01，表1）。

表1 兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液體積比較

2.2 兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)的變化計數(shù)改進組和傳統(tǒng)組支氣管肺泡灌洗液中除上皮細胞及紅細胞外的所有細胞（巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞等）總數(shù)結(jié)果顯示，兩組每毫升細胞總數(shù)差異無顯著性（P＞0.05），但改進組灌洗液回收細胞總數(shù)明顯多于傳統(tǒng)組，差異有顯著性（P ＜0.01，表2，圖1、2）。

圖1 傳統(tǒng)方法制備支氣管肺泡灌洗液

圖2 改進方法制備支氣管肺泡灌洗液

表2 兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)比較

3 討論

支氣管肺泡灌洗檢測作為一種分析手段，其上清液、細胞計數(shù)及進一步的分類可為肺部病變性質(zhì)、炎癥過程及疾病活動性等提供重要的參考信息［2］，并為分析肺疾病的發(fā)病機制、診斷指征提供重要的依據(jù)，故獲取高質(zhì)量支氣管肺泡灌洗液非常重要。

本方法與傳統(tǒng)制備小鼠支氣管肺泡灌洗液有兩點不同：（1）將氣管遠心端結(jié)扎后實施灌洗，能回收＞89%的灌洗液，大大提高實驗成功率，避免傳統(tǒng)方法在灌洗液的抽取過程中，部分或大量液體隨氣管進入小鼠口鼻而流到體外，造成支氣管灌洗液的浪費，且傳統(tǒng)方法獲取灌洗液的體積有多、有少，多可達0.8 m L，少則0.1或0.2 mL，不能滿足所有樣本多個細胞因子等測定的需求。雖然兩種方法每毫升灌洗液的細胞總數(shù)差別不大，但總灌洗液細胞數(shù)目偏少，造成計數(shù)及分類不準，影響實驗結(jié)果的準確性。（2）直接采用 1 支2 m L注射器而非傳統(tǒng)制備方法使用的三通管及 2支 2 mL注射器插入氣管，簡化了步驟，節(jié)約了費用，尤其批量操作既節(jié)約時間，又降低成本。

操作過程中還應(yīng)注意一些問題：（1）結(jié)扎不要太過用力，以免切斷氣管，但又不可太松，以免少量灌洗液流入鼻腔，造成浪費；（2）用直型靜脈滯留針，要適當深入氣管，以免退出針芯后帶出套管。

總之，改進后的小鼠支氣管肺泡灌洗液制備方法有助于對小鼠肺疾病模型的更好分析，使每只小鼠支氣管肺泡灌洗液的制備量均能達最大體積，避免灌洗液的浪費，最大限度地滿足實驗需求，對灌洗液細胞計數(shù)和分類更加準確，提高實驗的成功率。

［1］ 張效云，李 琦，張穎騫.中和白細胞介素-17加重小鼠衣原體呼吸道感染［J］.北京大學學報（醫(yī)學版），2013，45（4）：613－618.

［2］ 徐 佳，黃 媛，吳 衛(wèi)，等.改良支氣管肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)制片及染色法［J］.臨床檢驗雜志，2014，32（2）：98－101.

R 332

：B

1001－7399（2017）01－0109－02

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.030

接受日期：2016－11－30

張家口市科技局自然科學基金資助（12110046D-1）

河北省張家口市河北北方學院醫(yī)學檢驗學院生化教研室075000

張效云，女，碩士，教授。Tel：（0313）4029270，E-mail：xyzonly928＠163.com