邢亞萍，宋曉霞，丁胭脂，孔令非

子宮頸癌是全球女性常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約528 000例，死亡約266 000人[1]。高危型人乳頭狀瘤病毒(high risk human papillomavirus, HR-HPV)持續(xù)感染是子宮頸癌的主要致病因素，其中HPV 16、18型是最常見的高危型，84.1%的浸潤(rùn)性子宮頸癌是由其引起的[2]。子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesions, SIL)是子宮頸癌的癌前病變，WHO(2014)子宮頸腫瘤分類將其分為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL)和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL)。SIL的發(fā)生、發(fā)展與HR-HPV感染密切相關(guān)，有學(xué)者認(rèn)為不同程度子宮頸病變感染的型別不同，HSIL與子宮頸癌的關(guān)系密切，感染的主要亞型為HPV 16、18型。目前關(guān)于LSIL患者與HR-HPV的關(guān)系，學(xué)者們的觀點(diǎn)不太統(tǒng)一[3-4]。因此，本文采用兩種方法對(duì)LSIL的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其感染情況、HR-HPV亞型及感染方式進(jìn)行分析和總結(jié)，重新探討LSIL與HR-HPV的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料收集2015年8月～2016年8月河南省人民醫(yī)院病理科經(jīng)病理組織學(xué)診斷為SIL的石蠟標(biāo)本328例，排除有子宮頸治療史及蠟塊保存不良影響的病例。所有標(biāo)本均重新進(jìn)行切片、HE染色，并由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片；兩人意見一致作為最終的病理診斷結(jié)果，意見不一時(shí)由主任醫(yī)師進(jìn)行閱片，最終診斷為168例LSIL和160例HSIL。患者年齡17～78歲，中位年齡38歲。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2HE染色收集患者的石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，HE染色，顯微鏡下觀察，記錄LSIL和HSIL的病變部位。

1.3cobas4800HPV檢測(cè)HPV DNA提?。簩⑾瀴K標(biāo)本切成5 μm厚薄片，取5片置于1.5 mL離心管中，脫蠟、裂解、熱水浴，最后過(guò)柱、離心。將DNA溶液作為擴(kuò)增模板，加入TCT保存液，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量(PCR)和核酸雜交技術(shù)擴(kuò)增，檢測(cè)高危型HPV DNA，包括HPV 16、18及其他12種高危HPV亞型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)。QIAGEN試劑盒購(gòu)自上海凱杰公司，cobas 4800分子診斷系統(tǒng)及HPV基因分型檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自羅氏公司；具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4原位雜交法HPV檢測(cè)采用原位雜交法進(jìn)行HPV 6、11、16、18、31、33、51的定型檢測(cè)，各型HPV DNA探針和檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海Leica公司，具體操作步驟如下：常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟處理，微波修復(fù)切片，加HPV探針，放入濕盒中37 ℃過(guò)夜，加入適量的一、二抗，滴加HRP多聚體、DAB顯色劑，鏡下觀察，顯色充分后PBS終止顯色，蘇木精復(fù)染、封固。以病變組織細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色沉積為陽(yáng)性，無(wú)陽(yáng)性著色為陰性。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)等方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LSIL和HSIL的HE染色LSIL經(jīng)HE染色鏡下表現(xiàn)為表面上皮細(xì)胞排列改變或形成挖空細(xì)胞，表層細(xì)胞核出現(xiàn)非典型性，病變均集中在上皮表層。HSIL表現(xiàn)為細(xì)胞極性消失，出現(xiàn)異常核分裂象，核非典型性廣泛分布，主要集中在上皮下2/3層。

2.2HR-HPV在LSIL和HSIL中的分布HR-HPV總陽(yáng)性率97.0%(318/328)，其中LSIL患者168例，HR-HPV陽(yáng)性率95.2%(160/168)；HSIL患者160例，HR-HPV陽(yáng)性率98.8%(158/160)；兩組患者HR-HPV陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.105)。LSIL、HSIL中HPV 16、18的陽(yáng)性率分別為26.2%、57.5%，除HPV 16、18外的HR-HPV其他型陽(yáng)性率分別為80.9%、55.0%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

表1 HPV感染亞型在LSIL和HSIL患者中的分布[n(%)]

LSIL：低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變；HSIL：高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變。*Fisher精確檢驗(yàn)

2.3LSIL、HSIL中HR-HPV的感染方式原位雜交法檢測(cè)HPV DNA，光鏡下觀察HPV陽(yáng)性病毒顆粒呈棕黃色，位于細(xì)胞核內(nèi)。LSIL中HR-HPV的陽(yáng)性率為70.2%(118/168)。118例HR-HPV陽(yáng)性患者中，89例患者的棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞局限在子宮頸鱗狀上皮表層，29例患者的陽(yáng)性細(xì)胞位于上皮中表層，基底層未見陽(yáng)性細(xì)胞(圖1)。HSIL檢測(cè)結(jié)果顯示子宮頸鱗狀上皮的基底層和副基底層可見HR-HPV陽(yáng)性細(xì)胞(圖2)。推測(cè)LSIL中HR-HPV首先感染上皮表層，逐漸移向基底層(圖3)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為HR-HPV首先從基底層感染，引起LSIL、HSIL及子宮頸癌等一系列病變(圖4)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。

①②

圖1低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的鱗狀上皮表層見大量棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞，原位雜交法圖2高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的子宮頸鱗狀上皮基底層見棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞，原位雜交法

圖3 HR-HPV從子宮頸鱗狀上皮表層感染引起>低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變模式圖

圖4 傳統(tǒng)觀點(diǎn)：HR-HPV從基底層感染引起一系列子宮頸病變模式圖

3 討論

3.1LSIL與HSIL的組織學(xué)表現(xiàn)SIL分為L(zhǎng)SIL和HSIL。Christopher等[5]對(duì)LSIL和HSIL進(jìn)行重新定義：LSIL包括輕度異型增生(CIN1)、扁平濕疣、輕度異性增生、外生性濕疣、不成熟性濕疣、移行細(xì)胞乳頭狀瘤和乳頭狀不成熟化生；HSIL包括中度異型增生(CIN2)、重度異型增生(CIN3/原位癌)、角化性SIL和原位乳頭狀癌。本實(shí)驗(yàn)對(duì)328例患者的切片行HE染色，在顯微鏡下觀察。LSIL患者的病變細(xì)胞均位于子宮頸鱗狀上皮表層，鏡下表現(xiàn)為鱗狀上皮厚度的改變，表層細(xì)胞染色過(guò)深或細(xì)胞核密度輕微增加，表面上皮細(xì)胞排列改變或空暈結(jié)構(gòu)形成，表層細(xì)胞核出現(xiàn)非典型性。HSIL患者的病變細(xì)胞分布較廣泛，有的遍布全層，但細(xì)胞核的非典型性主要集中在上皮下2/3層，組織學(xué)特點(diǎn)為細(xì)胞核非典型性廣泛分布，核分裂指數(shù)增加，細(xì)胞極性消失，出現(xiàn)異常核分裂象。LSIL和HSIL的病理學(xué)表現(xiàn)及病變部位均存在明顯不同，LSIL患者中HR-HPV首先感染鱗狀上皮表層，引起表層細(xì)胞病變，逐漸移向基底部；HSIL患者中HR-HPV從上皮糜爛處感染基底層細(xì)胞，首先引起基底層細(xì)胞病變，逐漸向表層移動(dòng)。

3.2不同HR-HPV亞型在LSIL、HSIL中的分布HPV的持續(xù)感染與子宮頸癌密切相關(guān)，尤其是HPV 16型[6]，宿主細(xì)胞感染后病毒DNA整合到宿主基因組中，導(dǎo)致E6、E7基因過(guò)度表達(dá)，E6、E7分別與抑癌基因p53、pRb結(jié)合，解除腫瘤的抑制功能，引起子宮頸鱗狀上皮的惡性增生，導(dǎo)致子宮頸SIL和子宮頸癌的發(fā)生[7]。目前已分離出200多種HPV，根據(jù)致癌危險(xiǎn)性可將其分為L(zhǎng)R-HPV和、HR-HPV兩類。HPV 6、11等12種亞型為低危型，主要引起LSIL等上皮細(xì)胞良性病變，HPV 16、18等14種亞型為高危型，主要引起HSIL和子宮頸癌等惡性病變[8-9]。有研究[10-11]表明，HSIL與子宮頸癌的關(guān)系密切，主要由HR-HPV感染引起的，尤其是HPV 16、18型，而對(duì)于LSIL患者HPV感染的主要亞型仍存在爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)患者的石蠟標(biāo)本進(jìn)行HPV分型檢測(cè)。結(jié)果顯示：LSIL患者中HR-HPV的陽(yáng)性率為95.2%，與本實(shí)驗(yàn)組前期報(bào)道[12]結(jié)果一致。LSIL、HSIL中HPV 16、18陽(yáng)性率分別為26.2%、57.5%， HR-HPV其他型陽(yáng)性率分別為80.9%、55.0%，與Guan等[3]的觀點(diǎn)一致。因此HR-HPV感染與LSIL的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是HR-HPV其他型，而HPV 16、18亞型與HSIL的關(guān)系更為密切。然而，LSIL患者的HR-HPV感染率高卻不易進(jìn)展為HSIL和子宮頸癌，可能與其感染方式和HR-HPV型別有關(guān)，其具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

3.3LSIL、HSIL在原位雜交法檢測(cè)中陽(yáng)性細(xì)胞的分布位置不同原位雜交法利用分子探針及堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)，一種探針只與同源的核酸序列雜交，排除了交叉反應(yīng)，根據(jù)顯示的陽(yáng)性病毒顆粒所在的位置，可判斷HPV的感染方式，特異性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用HPV原位雜交法對(duì)LSIL患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HR-HPV陽(yáng)性率為70.2%(118/168)；另外，發(fā)現(xiàn)HR-HPV陽(yáng)性的LSIL患者子宮頸組織鱗狀上皮表層均可見陽(yáng)性細(xì)胞，因此作者推斷LSIL的HR-HPV感染開始于子宮頸鱗狀上皮表層。之前的研究[5]表明，從正常子宮頸組織到原位癌是一種有序的延續(xù)，LSIL和HSIL屬于同一個(gè)譜系，HR-HPV感染宿主細(xì)胞后，首先侵入子宮頸鱗狀上皮的基底細(xì)胞層，病毒DNA整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，引起子宮頸病變，隨著基底細(xì)胞的分化成熟，病毒顆粒也逐漸向上皮表層移動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)LSIL患者的陽(yáng)性細(xì)胞局限于子宮頸鱗狀上皮的上1/2，基底層未見陽(yáng)性細(xì)胞；HSIL患者的基底層見HR-HPV陽(yáng)性細(xì)胞，提示LSIL中HR-HPV感染是從上皮表層開始，HSIL中HR-HPV感染是從基底層開始，LSIL患者并不易進(jìn)一步發(fā)展為HSIL或子宮頸癌，因此LSIL和HSIL是兩個(gè)不同的譜系。HE染色的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該觀點(diǎn)。原位雜交技術(shù)突出表現(xiàn)了組織學(xué)形態(tài)變化和HPV的感染位置，與cobas 4800 HPV檢測(cè)相比其靈敏度較低，基底部陰性不能代表病毒DNA絕對(duì)不存在，本組結(jié)果顯示LSIL的陽(yáng)性細(xì)胞均位于表層，而非基底層，陽(yáng)性細(xì)胞的分布差異有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)為探討HR-HPV與子宮頸SIL的關(guān)系提供了不同的方向，但研究不夠深入，結(jié)果存在一定的局限性。

綜上所述，HR-HPV感染不僅是HSIL、子宮頸癌的主要致病因素，也與LSIL密切相關(guān)，尤其是HR-HPV其他型。HR-HPV從子宮頸鱗狀上皮表層開始感染引起LSIL；從上皮基底層感染導(dǎo)致HSIL，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色和原位雜交兩種方法推斷HSIL不是由LSIL發(fā)展而來(lái)，其可以不經(jīng)過(guò)LSIL階段而自行發(fā)生。另外，HR-HPV感染引起的HSIL較LSIL更易進(jìn)展為子宮頸癌，除了受HR-HPV整合狀態(tài)的影響，還可能與HR-HPV的型別及感染方式相關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R,etal. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer, 2015,136(5):E359-E386.

[3] Guan P, Howell J R, Li N,etal. Human papillomavirus types in 115,789 HPV-positive women: a meta-analysis from cervical infection to cancer[J]. Int J Cancer, 2012,131(10):2349-2359.

[4] Bzhalava D, Guan P, Franceschi S,etal. A systematic review of the prevalence of mucosal and cutaneous human papillomavirus types[J]. Virology, 2013,445(1-2):224-231.

[5] Christopher P, Kenneth R. 婦產(chǎn)科診斷病理學(xué)[M]. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2007:294-298.

[6] 王 平，劉 珊，程 波，等. 子宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細(xì)胞癌組織cyclin D1表達(dá)特征及其與HPV16 E7表達(dá)的相關(guān)性分析[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2015,44(12):884-888.

[7] Gariglio P, Organista N J, Alvarez R E. Role of HR-HPVs E6 and E7 oncoproteins in cervical carcinogenesis[J]. J Mol Genetic Med, 2016,10(2):216-227.

[8] Hopenhayn C, Christian A, Christian W J,etal. Prevalence of human papillomavirus types in invasive cervical cancers from 7 US cancer registries before vaccine introduction[J]. J Low Genit Tract Dis, 2014,18(2):182-189.

[9] Wang X C, Sun L Q, Ma L,etal. Prevalence and genotype distribution of human papillomavirus among women from Henan, China[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(17):7333-7336.

[10] Serravalle K, Levi J E, Oliveira C,etal. Comparison of two techniques for HPV genotyping in women with high-grade squamous intraepithelial lesion[J]. Revista Brasileira De Ginecologia E Obstetrícia, 2015,37(2):94-99.

[11] Demir F, Kimiloglu E, Igdem A A,etal. High risk HPV in situ hybridization, p16 INK 4A, and survivin expressions in cervical carcinomas and intraepithelial neoplasms: evaluation of prognostic factors[J]. Eur J Gynaecol Oncol, 2014,35(6):708-717.

[12] 呂秀芳,宋曉霞,賀 慧,等. 常見HR-HPV各型在子宮頸組織中致癌能力的評(píng)估[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2016,32(3):272-277.