任春宇+姜丹丹+車達(dá)

摘要：為建立快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測氣腫疽的膠體金免疫層析試紙條，以免疫層析法為指導(dǎo)，根據(jù)抗原-抗體的特性，建立了不需要再加入任何檢測試劑且快速簡便的檢測方法。結(jié)果表明，膠體金與該單抗的最佳結(jié)合量為 30 μg/mL，最佳 pH 值為8.4，最佳NC膜為Millipore HFB1350220型。將純化的氣腫疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG分別以1 ∶4和1 ∶8的稀釋倍數(shù)噴于硝酸纖維素膜的T線和C線。對膠體金診斷試紙條進(jìn)行驗證，敏感度高，可檢測到的最低抗原量為1×105 CFU/mL，特異性強、無假陽性與交叉反應(yīng)現(xiàn)象、有較好的穩(wěn)定性。本研究旨在建立快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測氣腫疽的膠體金免疫層析試紙條。

關(guān)鍵詞：氣腫疽梭菌；膠體金；免疫層析試紙條

中圖分類號： S855.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0283-03

氣腫疽又稱黑腿病或鳴疽，是由氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的反芻動物的急性、敗血性傳染病[1]。該菌屬細(xì)菌綱芽孢桿菌科梭菌屬，是土壤中的專性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于牛和綿羊的腸內(nèi)容物中[2]，特別在深部傷口的厭氧環(huán)境中[3-4]。該菌為革蘭氏陽性棒狀大桿菌，對進(jìn)行疫苗接種的豚鼠腹腔滲出液做涂片觀察，可發(fā)現(xiàn)該菌以單個形式存在，或幾個細(xì)菌形成短鏈，可與呈長鏈的腐敗梭菌做出鑒別，這是形態(tài)上的主要區(qū)別之一[5]。在進(jìn)行菌體培養(yǎng)時，需創(chuàng)造嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，尤其是在固體培養(yǎng)中，當(dāng)接種于葡萄糖血液瓊脂中時，形成半透明圓形菌落、β溶血環(huán)，中心略凸起[6]。

該菌繁菌體的抵抗力不強，但芽孢卻有很強的抵抗力，可在土壤中存活多年[7]，在腐敗尸體中仍可存活3個月。若想將組織內(nèi)的芽孢殺死，經(jīng)煮沸20 min或0.2%升汞處理 10 min 方可。一旦通過深部創(chuàng)傷或術(shù)后而感染[8]，或經(jīng)口感染，經(jīng)胃腸道腸系膜進(jìn)入血液最終到達(dá)各個器官和肌肉組織內(nèi)的芽孢將迅速繁殖[9]，并很快出現(xiàn)病癥，還可形成腸氣腫疽，易感動物在感染后12～36 h則出現(xiàn)死亡[10]。

本試驗選用氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株制備菌體單克隆抗體，旨在將該單抗與膠體金標(biāo)記結(jié)合，研制出能對氣腫疽梭菌做出快速診斷的膠體金免疫層析試紙條，該試紙條研制成功將為氣腫疽診斷、流行病學(xué)調(diào)查及衛(wèi)生檢疫等提供快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測手段，更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C54-1，購自于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氯金酸（HAuCl4·4H2O），購自科興生物科技有限公司；檸檬酸三鈉C6H5Na3O7·2H2O，購自北京華力德科技有限公司；二氯二甲基硅烷（Sigma公司產(chǎn)品）；PVC底板、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、MAX線標(biāo)簽貼紙、色皮標(biāo)簽等，購自杭州隆基生物技術(shù)有限公司；BSA，購自Promega公司；樣品墊及吸水墊，購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 單克隆抗體的制備、純化及檢測

注射經(jīng)離心洗滌的雜交瘤細(xì)胞于8周齡BALB/c小鼠，待有腹水形成后，取腹水并用間接ELISA法檢測腹水效價。采用Protein A 親和層析法對單克隆抗體進(jìn)行純化，用紫外光分光光度計測量純化的單抗?jié)舛?，將單抗溶液?0倍稀釋，分別于260 nm 和280 nm 波長下測吸光度，并于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 膠體金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，制備膠體金粒徑大小為20～25 nm。將100 mL去離子水和1 mL 1%氯金酸溶液加入硅化處理好的錐形瓶中，加熱至完全沸騰時，迅速加入1.5 mL 1%檸檬酸三鈉，煮沸5～10 min，發(fā)現(xiàn)溶液顏色漸變成酒紅色后，繼續(xù)煮沸10 min取下，置于常溫自然涼透，補足水分，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 金標(biāo)的制備

1.4.1 氣腫疽梭菌單抗與膠體金顆粒結(jié)合的最適pH值確定

將制備的膠體金加入若干2 mL離心管中，1.5 mL/管。將pH值分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按pH值從低到高分別加50 μL 1 mg/mL 的單抗IgG到離心管中，搖勻30 min后靜置約10 min；再將100 μL的10% NaCl溶液加至管中，搖勻20 min后靜置約1 h，觀察顏色變化情況，記錄能保持為紅色的最低pH值，即為最適pH值。

1.4.2 單克隆抗體最適用量的確定

分別取金標(biāo)用抗體5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg，加入1 mL膠體金溶液中充分混勻，完成后室溫靜置約1 h，觀察膠體金溶液的顏色變化。

1.4.3 膠體金探針的制備

取已制備好的膠體金溶液 20 mL 加入50 mL離心管中，將膠體金溶液的pH值調(diào)整為略高于最適pH值0.2～0.4，在磁力加熱攪拌器運行中，將純化后的單克隆抗體溶液按最佳結(jié)合濃度緩慢滴入膠體金溶液中，混勻后室溫靜置10 min，再置于磁力攪拌器上加入終濃度為2%的BSA，離心棄上清，用TBS將沉淀溶解，即為合成探針。

1.4.4 膠體金探針的純化

先除去其中未被完全標(biāo)記的膠體金和在標(biāo)記的過程中容易產(chǎn)生的多種聚合物[11]。應(yīng)用低溫高速離心純化方法，將標(biāo)記好的膠體金先以小轉(zhuǎn)數(shù)離心；再將收集的上清液以13 500 r/min離心1 h，此時將上清液緩慢倒出。將沉淀以原體積的膠體金重懸液溶解沉淀，低溫重復(fù)離心2～3次，沉淀溶于原體積的膠體金重懸液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 試紙條的制備

1.5.1 金標(biāo)墊的制備

在金標(biāo)墊處理液Ⅰ與Ⅱ中分別處理玻璃纖維素膜GF-08和Ahlstrom 8964，1 h后取出并于常溫中晾干，干燥保存。玻璃纖維素膜處理完畢后剪成50 mm寬的長條，把制備好的金標(biāo)探針按一定量均勻噴涂于玻璃纖維上，選出最佳玻璃纖維膜及處理液。

1.5.2 樣品墊的預(yù)處理

將樣品墊裁剪成適當(dāng)尺寸浸入預(yù)處理液中浸泡20 min取出，控干液體，置烘干箱，烘干后干燥保存。

1.5.3 NC膜的優(yōu)選

選擇不同流速的Millipore HFB1350220、whatman Immunopore RP、whatman Immunopore FP、Sartorius CN 140、whatman AE 99 （無背襯）硝酸纖維素膜于處理液中，浸泡30 min取出，用PBS沖洗，烘干。進(jìn)行流速試驗，注意其流速和反應(yīng)背景均勻度，選擇層析速度快（3～5 min）且背影小、顏色淡的硝酸纖維膜。

1.5.4 T線及C線條件的優(yōu)化

將純化處理好的兔抗氣腫疽梭菌血清及羊抗鼠IgG分別按以下比例稀釋：1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32。然后劃在NC膜的檢測線和質(zhì)控線上進(jìn)行優(yōu)化（做方陣試驗），選出效果最好的一組進(jìn)行包被。

1.5.5 封閉液的優(yōu)化

將噴涂有腫疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG的NC膜分別置于5%犢牛血清、3%脫脂乳和1%BSA中，在封閉液中浸泡30 min，取出用PBS沖洗，晾干，制成試紙條，用標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血清作試驗，篩選出最佳封閉液。

1.5.6 試紙條的組裝

將硝酸纖維素膜貼在PVC底板中央，貼后不要有空隙和氣泡；金標(biāo)結(jié)合墊平貼于NC膜T線下方壓住 NC 膜重疊5 mm、然后粘貼樣品板及吸水紙，小心抹平，最后貼上MAX線標(biāo)貼和色皮標(biāo)簽，即成檢測試紙條。

1.6 試紙條的檢測方法和結(jié)果判定

使試紙條保持豎直方向，將樣品墊端放入稀釋后的待檢樣液中（注意液面不可超過MAX 線），室溫下作用5～10 min，觀察結(jié)果。

1.7 敏感性試驗

將氣腫疽梭菌菌液做1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400倍比稀釋，分別將試紙條插入以上不同稀釋度的菌液中，觀察結(jié)果。

1.8 特異性試驗

用膠體金試紙條檢測選取與氣腫疽梭菌種系相近的腐敗梭菌、肉毒梭菌進(jìn)行特異性試驗，觀察檢測結(jié)果是否存在交叉反應(yīng)。

1.9 重復(fù)性試驗

隨機取40支試紙條進(jìn)行檢測試驗，10只進(jìn)行陰性樣品檢測，30支進(jìn)行陽性樣品檢測，測定試紙條的重復(fù)性。

1.10 穩(wěn)定性試驗

將膠體金試紙條置于室溫和4 ℃冰箱中保存，半年內(nèi)檢測1次/月保存的陽性菌液及陰性對照菌液，觀察檢測結(jié)果，比較符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體的制備、純化及檢測

全菌加強免疫后收集血清，經(jīng)辛酸-硫酸銨法進(jìn)行抗體的粗提，并透析除鹽處理后，以間接ELISA法檢測多抗效價，氣腫疽梭菌的抗體效價為1 ∶25 600。

經(jīng)辛酸-硫酸銨法粗提，再用Protein A 親和層析法純化，間接ELISA法測定的單克隆抗體效價為1 ∶102 400，抗體效價升高1倍。測得純化蛋白的濃度為28.14 mg/mL（紫外分光度計測定）。

2.2 單克隆抗體與膠體金結(jié)合的最佳pH值確定

將膠體金溶液的pH值分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按pH值從低到高分別加50 μL 1 mg/mL 單抗IgG和100 μL 10% NaCl溶液至膠體金管中，振搖20 min，室溫下靜置1 h。根據(jù)膠體金的顏色變化，確定了最低pH值為8，再做pH值為7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8幾個梯度，室溫下放置2 h，觀測膠體金顏色變化，記錄仍保持紅色的pH值，穩(wěn)定膠體金的最適pH值為8.4。

2.3 膠體金標(biāo)記單克隆抗體最適用量的確定

將膠體金顆粒與氣腫疽梭菌單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。觀察膠體金溶液的顏色變化，穩(wěn)定膠體金所需抗體的最低量為 25 μg，而實際標(biāo)記中使用免疫金抗體的量為最低量再加20%，即為30 μg，確定單克隆抗體與膠體金的的最佳結(jié)合濃度應(yīng)為30 μg/mL。

2.4 金標(biāo)墊的制備

將已經(jīng)純化好的金標(biāo)探針按一定量均勻噴涂于玻璃纖維上，于室溫干燥后觀察顏色和均勻度。比較結(jié)果為浸泡在金標(biāo)墊處理液Ⅱ中的Ahlstrom 8964玻璃纖維干燥后的顏色（酒紅色）與純化后的免疫膠體金顏色相同，且均勻度最好；檢測樣品時，玻璃纖維上的膠體金探針被溶解并帶動其向前移動，釋放效果最好。所以本試驗選用Ahlstrom8964玻璃纖維膜（經(jīng)金標(biāo)處理液Ⅱ處理的）為金標(biāo)墊。

2.5 不同型號NC膜的選擇結(jié)果

選擇5種不同型號的NC膜，用NC 膜處理液于37 ℃浸泡30 min。做流速試驗，Millipore HFB1350220型NC膜所用的時間最短，僅為4 min，且擴散均勻不拖帶。因此，選擇該型號的硝酸纖維素膜作為免疫層析載體膜。

2.6 T線及C線的優(yōu)化結(jié)果

氣腫疽梭菌多抗進(jìn)行1 ∶4倍稀釋時，效果較好（顏色清晰且無拖帶現(xiàn)象），以1 ∶4稀釋后噴于T線；羊抗鼠IgG做 1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8稀釋時，均能得到理想效果。將羊抗鼠IgG作1 ∶8稀釋后噴在C線上；按2.0 μL/cm的噴膜量進(jìn)行噴膜可達(dá)到較好結(jié)果，免疫層析顯色較快，顏色深且清晰可辨，顯色條帶無中空效果。

2.7 試紙條的組裝和判定

檢測樣品溶液，在5～10 min內(nèi)觀察檢測結(jié)果，根據(jù)出現(xiàn)紅色反應(yīng)線的情況確定待檢樣液的陰性、陽性，若出現(xiàn)2條紅色反應(yīng)線則為陽性反應(yīng)，只出現(xiàn)質(zhì)控線上1條紅線為陰性反應(yīng)，均不顯紅色線則試紙條無效（圖1）。

2.8 敏感性試驗

將氣腫疽梭菌菌液做1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400倍稀釋，結(jié)果顯示氣腫疽梭菌菌液稀釋至1 ∶100倍時，結(jié)果仍顯示為陽性，檢測到的菌液最低抗原量為1×105 CFU/mL。

2.9 特異性試驗

用膠體金試紙條檢測氣腫疽梭菌（C54-1）、腐敗梭菌、肉毒梭菌。檢測結(jié)果顯示，氣腫疽梭菌呈陽性，試紙條無假陽性與交叉反應(yīng)現(xiàn)象（圖2）。

2.10 重復(fù)性試驗

10條試紙條進(jìn)行陰性樣品檢測結(jié)果顯示，T線均不出條帶，9條試紙條C線顯現(xiàn)深紅色帶，1條的C線為淺紅色帶；檢測陽性樣品的30條試紙條，T線C線均出現(xiàn)紅色條帶，由此得出試紙條的重復(fù)性達(dá)到100%，重復(fù)性好。

2.11 穩(wěn)定性試驗

將試紙條密封后于室溫和4 ℃環(huán)境存放，5個月內(nèi)均能正常穩(wěn)定顯色，室溫環(huán)境中于5個月后略出現(xiàn)膠體金探針釋放不完全的現(xiàn)象，4 ℃條件下放置的試紙條在6個月后才出現(xiàn)上述現(xiàn)象，但特異性無變化。

3 討論

膠體金是氯金酸的水溶膠，可以結(jié)合多種生物大分子，現(xiàn)已成為在免疫標(biāo)記技術(shù)中1種常用的非放射性示蹤劑。在1971年，F(xiàn)aulk和Taylor首次將膠體金顆粒用抗體來標(biāo)記，在免疫化學(xué)領(lǐng)域中誕生了1項新技術(shù)[12]。與ELISA法相比，除了都具有較強的特異性和敏感性之外，在操作上也更加簡便快速，無需復(fù)雜儀器設(shè)備且極易判斷，保質(zhì)期長。隨著試劑盒品種和銷售量的不斷增長，現(xiàn)已發(fā)展為生產(chǎn)完全自動化和標(biāo)準(zhǔn)化水平。

膠體金顆粒質(zhì)量除了受水質(zhì)、試劑純度等多種因素的影響之外，還與檸檬酸鈉的加入以及攪拌的程度和加入速度有關(guān)。制備膠體金溶液玻璃器皿的清潔是成功制備膠體金的前提條件[13]。由膠體金的性質(zhì)可知，膠體金具有不穩(wěn)定性，有聚沉的可能，故制備好后盡量在20 d以內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記[14]，不可長時間放置。在膠體金診斷試紙條的研制過程中，需要對一系列反應(yīng)條件和材料進(jìn)行優(yōu)化和篩選。固相蛋白與NC膜的結(jié)合是重中之重，是否能獲得靈敏度高、重復(fù)性好的檢測結(jié)果取決于蛋白與膜的結(jié)合效果。蛋白與膜的結(jié)合力主要為疏水作用力、氫鍵和靜電吸引力，所以在優(yōu)化蛋白結(jié)合膜時應(yīng)當(dāng)考慮到這幾種力的作用，選擇不會使疏水作用力和靜電引力下降的緩沖液，使之不影響蛋白結(jié)合力。噴完抗體后對NC膜做適當(dāng)?shù)母稍?，使蛋白能夠長期而穩(wěn)定地與膜結(jié)合。本試驗應(yīng)用雙抗體夾心法，將氣腫疽梭菌多抗包被在檢測線處，羊抗鼠IgG包被在質(zhì)控線處，金標(biāo)單克隆抗體吸附在纖維素膜固相載體上來裝備試紙條，檢測樣品中的抗原。當(dāng)待檢樣液中有氣腫疽梭菌（C.chauvoei）時，形成“金標(biāo)單抗-C.chauvoei”復(fù)合物，由于毛細(xì)虹吸作用，該復(fù)合物以及未結(jié)合的金標(biāo)單抗往上走，在檢測線上形成“金標(biāo)單抗-C.chauvoei-多抗”復(fù)合物，因有金顆粒在此沉積，故出現(xiàn)肉眼可見紅色條帶，未結(jié)合的金標(biāo)單抗繼續(xù)上行，與控制線上的羊抗鼠IgG結(jié)合，又形成1條紅色條帶；若待檢樣液中不含C.chauvoei，則只出現(xiàn)1條紅色條帶，只在試紙條上端的C線上出現(xiàn)紅色沉淀線。試驗證明該試紙條的檢測不僅耗時短、操作簡單、靈敏度高，而且成本較低，適用于氣腫疽的現(xiàn)場檢測及鑒別診斷，可以在實踐中推廣使用。

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