陳曦，高力，雷靜

(自貢市第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科1、檢驗(yàn)科2，四川 自貢 643000)

具有神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋功能的聚羥基脂肪酸酯膜片的制備及其對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)分化的研究

陳曦1，高力1，雷靜2

(自貢市第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科1、檢驗(yàn)科2，四川 自貢 643000)

目的 制備一種可緩慢釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的的高分子復(fù)合材料，用于神經(jīng)組織工程的研究。方法采用溶劑揮發(fā)的方式，將NGF與聚羥基脂肪酸酯(PHA)在有機(jī)溶劑中充分混合，再將其倒入圓形玻璃器皿中，形成一個(gè)表面和內(nèi)部都含有NGF的PHA膜，并將純的PHA膜和浸泡干燥的PHA膜(粘附NGF的PHA膜)作為對(duì)照。將上述三種膜分別進(jìn)行微觀形貌(掃描電子顯微鏡)、水接觸角和NGF體外釋放的檢測(cè)。最后，在連續(xù)培養(yǎng)6 d后，觀察三種膜對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)分化影響。結(jié)果相對(duì)于兩個(gè)對(duì)照組，負(fù)載NGF的PHA膜表面形貌更起伏粗糙，有明顯的蛋白粘附，也具有最佳的親水性。同時(shí)，負(fù)載NGF的PHA膜能連續(xù)6天釋放出穩(wěn)定的且有活性的NGF，濃度大于100 ng/mL。負(fù)載NGF的PHA膜上的PC12細(xì)胞分化明顯，在培養(yǎng)第3天時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞的分化表型，長(zhǎng)出了軸突，而第6天鄰近的幾個(gè)PC12細(xì)胞的軸突相互接觸并形成類(lèi)似神經(jīng)網(wǎng)結(jié)構(gòu)；其他對(duì)照組沒(méi)有明顯現(xiàn)象。結(jié)論成功利用生物材料PHA制備出一種具有NGF緩釋功能的生物高分子膜片，并可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞表型分化。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子；聚羥基脂肪酸酯；神經(jīng)組織工程；緩釋

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是一種昂貴的神經(jīng)分化生長(zhǎng)因子，且使用半衰期較短，通常只有幾個(gè)小時(shí)[1-2]。一次性局部給藥后NGF能發(fā)揮生物活性功能的時(shí)間十分有限，這在一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用[3-4]。因此，需要尋求一種可長(zhǎng)期釋放具有功能活性NGF的緩釋方法，以避免上述困難。近年來(lái)，越來(lái)越多的嘗試?yán)媒M織工程和緩釋載體的思維解決生長(zhǎng)因子的緩釋問(wèn)題。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一種從微生物中提取的生物聚酯材料，由300多種單體組合而成，是一種全新的生物材料[5]。由于具有良好的生物相容性和生物可降解性，PHA逐漸被大家用于組織工程和藥物載體領(lǐng)域的研究，并取得了較好的成果[6]。但目前還無(wú)人做將NGF包裹在PHA中的嘗試，特別是最新的PHA材料P(3HB-co-4HB)，形成可緩釋NGF的PHA膜，并用于PC12神經(jīng)分化的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 聚羥基脂肪酸酯[P(3HB-co-4HB)，相對(duì)分子質(zhì)量為20×104]購(gòu)于意中國(guó)可曼生物材料有限公司。日本電子日本電子株式會(huì)社(JEOL)生產(chǎn)的掃描電子顯微鏡；日本奧林巴斯倒置熒光顯微鏡；承德金和儀器制造有限公司生產(chǎn)的接觸角水滴角測(cè)量?jī)x；所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑、耗材和NGF均購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司(Thermo，Gibco)。

1.2 方法 (1)制備PHA膜：將1 g的PHA溶解于10 mL的體積比為1:1的二氯甲烷/丙酮混合有機(jī)溶液中，使用20℃、200 r/min的磁力攪拌器攪拌使其充分溶解；將溶液倒入直徑為7 cm的圓形玻璃器皿中，待二氯甲烷完全揮發(fā)，得到聚羥基脂肪酸酯膜片。(2)制備表面粘附NGF的PHA膜：將上述所制備的PHA膜浸泡在4℃的100 mg/mL NGF溶液中，取出冷凍干燥。(3)制備負(fù)載NGF的PHA膜：與PHA膜的制備相似，將1 g的PHA溶解于10 mL的體積比為1:1的二氯甲烷/丙酮混合有機(jī)溶液中，在20℃、200 r/min的磁力攪拌器使其充分溶解；再加入20 mg的NGF粉末，繼續(xù)溶解5 min；將溶液倒入直徑為7 cm的圓形玻璃器皿中，待二氯甲烷完全揮發(fā)得到負(fù)載NGF的聚羥基脂肪酸酯膜片。(4)觀察和分析三種PHA膜的理化性質(zhì)：分別將上述制備的PHA膜切下相等大小的一小片(約1 cm×0.5 cm)，用導(dǎo)電膠粘在金屬臺(tái)上，噴Pt金60 s，抽真空處理后，采用掃描電鏡(SEM)觀察膜的表面結(jié)構(gòu)；另取同樣大小的膜片粘附在載物臺(tái)上，滴加10 μL的超純水在膜表面，用于接觸角檢測(cè)。(5)NGF的緩釋能力：將粘附NGF的PHA膜和負(fù)載NGF的PHA膜裁剪成48孔板大小的圓形，分別浸泡在2 mL的37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH= 7.4)中靜態(tài)處理，每天換液并收集PBS；并采用ELISA試劑盒，對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品中的NGF含量進(jìn)行檢測(cè)。(6)膜片上的PC12的培養(yǎng)：先將膜片切割成48孔板大小，并進(jìn)行紫外殺菌處理；將購(gòu)買(mǎi)的PC12細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)在F12培養(yǎng)液(含5%胎牛血清、15%馬血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素)，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；傳代2次后以2×104個(gè)細(xì)胞接種于孔培養(yǎng)板上，接種在48孔板的膜片上，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。(7)膜片上的PC12神經(jīng)分化效果測(cè)試：連續(xù)培養(yǎng)10 d后，分解在培養(yǎng)的第3天和第6天進(jìn)行染色及熒光顯微鏡觀察，分別將三種膜片依次進(jìn)行PBS清洗、含1%DIO的培養(yǎng)基染色培養(yǎng)10 min、PBS再次清洗除去殘余的DIO、加入新鮮的培養(yǎng)基、熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 三種PHA膜的表面形貌 通過(guò)SEM觀察發(fā)現(xiàn)，單純的PHA膜表面較光滑；浸泡后表面粘附NGF的PHA膜表面有明顯的蛋白附作物；負(fù)載NGF的PHA膜表面形貌更起伏粗糙，且也發(fā)現(xiàn)明顯的蛋白附作物(圖1)。

2.2 三種PHA膜的親水性對(duì)比 采用純水的接觸角檢測(cè)法，發(fā)現(xiàn)三種膜片的親水性分別是負(fù)載NGF的PHA膜＞粘附NGF的PHA＞PHA膜(圖2A)。且負(fù)載NGF的PHA膜與PHA膜差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說(shuō)明親水性與NGF的混合比例和方式有關(guān)。

2.3 NGF的釋放能力檢測(cè) 通過(guò)ELISA試劑盒，檢測(cè)出負(fù)載NGF的PHA膜和粘附NGF的PHA所釋放出的NGF含量(圖2B)。結(jié)果表明，兩種PHA膜片都能釋放出不同濃度的NGF，第1天，粘附NGF的PHA膜釋放的NGF濃度為460.72 ng/mL，大于負(fù)載NGF的PHA膜的357.39 ng/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第2天，粘附NGF的PHA膜釋放的NGF濃度只檢測(cè)出18.94 ng/mL，而負(fù)載NGF的PHA膜依然保持著257.54 ng/mL的強(qiáng)勁NGF釋放能力，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。粘附NGF的PHA膜在第3天就無(wú)法檢測(cè)到NGF，而負(fù)載NGF的PHA膜從第3天到第6天均能檢測(cè)出，且濃度維持在100～130 ng/mL之間，說(shuō)明負(fù)載NGF的PHA膜具有良好的NGF緩釋功能，且釋放的NGF濃度基本滿足PC12神經(jīng)分化的需求。

2.4 膜片上的PC12神經(jīng)分化 通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不論是培養(yǎng)第3天還是第6天，PHA膜上的PC12沒(méi)有任何神經(jīng)分化的跡象；負(fù)載NGF的PHA膜上的PC12細(xì)胞分化明顯，在第3天時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞的分化表型，長(zhǎng)出了軸突，而第6天鄰近的幾個(gè)PC12細(xì)胞的軸突相互接觸并形成類(lèi)似神經(jīng)網(wǎng)結(jié)構(gòu)；而只是表面粘附少量NGF的PHA膜也表現(xiàn)出微弱的現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞分化現(xiàn)象，但遠(yuǎn)低于負(fù)載NGF的PHA膜，見(jiàn)圖3。這驗(yàn)證了負(fù)載NGF的PHA膜釋放的NGF具有生物活性，可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞表型分化。

圖1 三種PHA膜的微觀結(jié)構(gòu)對(duì)比

圖2 釋放濃度對(duì)比

圖3 三種PHA膜上培養(yǎng)PC12細(xì)胞的熒光顯微鏡圖

3 討 論

目前已知，NGF對(duì)神經(jīng)元或類(lèi)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及特殊的功能維持都有著重要作用。通常情況下NGF大于50 ng/mL時(shí)，即可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞模型進(jìn)行神經(jīng)分化[1]，具體表現(xiàn)為：(1)數(shù)量上，細(xì)胞的增埴能力逐步停止，細(xì)胞數(shù)量不再增加；(2)形態(tài)上，出現(xiàn)細(xì)胞平展、細(xì)胞質(zhì)附屬物的形成及細(xì)胞膜變皺褶等現(xiàn)象，并胞體逐步長(zhǎng)出突起；(3)分子生化功能上，出現(xiàn)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)加強(qiáng)、離子泵的改變及相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化等現(xiàn)象，且細(xì)胞表面逐步出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞所特有的細(xì)胞膜電位。由于這種特異地分化使其在形態(tài)外觀及生理功能方面都更接近于神經(jīng)元，PC12是最佳的神經(jīng)元分化的體外模型。PHA是一種從微生物中提取的生物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，已在組織工程和藥物載體領(lǐng)域的進(jìn)行大量的研究[6]，也是一種潛在的神經(jīng)組織工程材料。但目前為止，沒(méi)有關(guān)于NGF包裹在PHA中可緩釋NGF的任何報(bào)道。

本課題嘗試將NGF包裹在最新的一種PHA材料，即P(3HB-co-4HB)，構(gòu)建一種可緩釋NGF的PHA膜，并能刺激PC12進(jìn)行神經(jīng)分化。與NGF只是簡(jiǎn)單地粘附在PHA膜表面相比，將PHA與NGF充分混合后，采用溶劑揮發(fā)的方式將NGF均勻的分散在PHA膜的表面和內(nèi)部，更有利于實(shí)現(xiàn)NGF的緩慢釋放。結(jié)果表明，負(fù)載NGF的PHA微觀形貌和單純的浸泡粘附NGF的PHA膜更粗糙。通過(guò)體外緩釋檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在6 d(每天換液)的測(cè)試中，負(fù)載NGF的PHA膜均能持續(xù)釋放出濃度大于100 ng/mL的NGF，而粘附NGF的PHA膜只有在第一天能達(dá)到上述濃度。通過(guò)PC12細(xì)胞的種植和分化效果也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。通過(guò)6天的連續(xù)培養(yǎng)，只有負(fù)載NGF的PHA膜能成功實(shí)現(xiàn)多個(gè)PC12細(xì)胞的軸突相互接觸及類(lèi)似神經(jīng)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)照組無(wú)法實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，通過(guò)NGF與PHA混合制備的膜可有效地進(jìn)行NGF的緩釋?zhuān)夷艽龠M(jìn)PC12神經(jīng)分化，是一種全新的具有生長(zhǎng)因子緩釋功能的復(fù)合材料，具有較好的神經(jīng)組織工程科研及臨床意義，前景廣闊。

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Preparation of polyhydroxyalkanoate film with NGF-slow release and its effect on neural differentiation of PC12 cells.

CHEN Xi1,GAO Li1,LEI Jing2.Department of Neurosurgery1,Department of Clinical Laboratory2,Zigong Fourth People's Hospital,Zigong 643000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo study the preparation of polyhydroxyalkanoate(PHA)film with nerve growth factor (NGF)slow release and its effect on neural differentiation of PC12 cells.MethodsNGF and PHA were mixed thoroughly in the organic solvent through solvent evaporation method.Then the solvent was poured into a round glass container to form a PHA film containing NGF inside and outside.The pure PHA film and the soaked dry PHA film(PHA film attached NGF)were regarded as the control groups.The three kinds of films were characterized by microstructure (SEM),water contact angle measurement and NGF release assay respectively.After 6 consecutive days of culturing,the effects of three kinds of films on neuronal differentiation of PC12 cells were observed.ResultsCompared by the twocontrol groups,the surface of PHA films loaded with NGF appeared rougher,and had obvious protein adhesives and the best hydrophilia.Meanwhile,the PHA films loaded with NGF could release the active NGF whose concentrations exceeded 100 ng/ml for 6 consecutive days steadily.The PHA films loaded with NGF had the obvious differentiation.On the third day of culturing,the differentiation phenotype of neuron-like cells appeared and the axons grew;on the sixth day of culturing,the axons of neighboring PC12 cells contacted with each other and formed a structure of resembling neural network.While,the control groups had no obvious differentiation phenomena.ConclusionIn this study,a biopolymer biomembrane with a slow-release function of NGF was successfully prepared and the PC12 cells were induced to differentiate into neuronal cells.

Nerve growth factor(NGF);Polyhydroxyalkanoate(PHA);Nerve tissue engineering;Slow release

R741

A

1003-6350（2017）04-0530-04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.004

2016-08-15)

雷靜。E-mail：601769459@qq.com