紀(jì) 高， 王海松， 丁寅翼， 成向榮*，2， 樂國偉，2

微波輔助、磷酸催化合成半乳聚糖的結(jié)構(gòu)分析

紀(jì) 高1， 王海松1， 丁寅翼1， 成向榮*1，2， 樂國偉1，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

以磷酸催化、微波輔助合成半乳聚糖為研究對象，探討半乳聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及聚合反應(yīng)的區(qū)域選擇性和立體選擇性。綜合采用高效凝膠滲透色譜、紅外光譜、甲基化分析及一維、二維核磁共振波譜（1H NMR，13C NMR，1H-1H COSY，TOCSY，HSQC，HMBC），對半乳聚糖的相對分子質(zhì)量、糖苷鍵的立體構(gòu)型和連接位點進(jìn)行表征。結(jié)果表明，反應(yīng)合成的半乳聚糖為多分支結(jié)構(gòu)，重均相對分子質(zhì)量為2 657，重均聚合度為16，糖殘基以α-型半乳吡喃糖為主，主要為→4）-α-D-Galp（1→和→2，4）-α-D-Galp（1→片段。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果進(jìn)一步表明，微波輔助、磷酸催化半乳糖縮合過程中，不同位點的羥基具有不同的反應(yīng)活性，4位羥基的反應(yīng)活性最強。

微波；磷酸；半乳聚糖；結(jié)構(gòu)分析

半乳聚糖是一類廣泛存在于海洋藻類、陸生植 物或動物組織中，由半乳糖或以半乳糖為主、其它單糖為輔構(gòu)成的直鏈或支鏈聚合物[1]。半乳聚糖，尤其是來源于藻類的半乳聚糖硫酸酯，具有增強免疫、抗病毒、抗凝血及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能[2-5]。此外，半乳聚糖作為一類膳食纖維，還可以有效促進(jìn)腸道乳酸菌增殖，提高腸道短鏈脂肪酸的含量[6]。

目前，半乳聚糖的制備主要依賴于天然資源的提取、水解和衍生。天然資源的生長周期性和提取工藝的復(fù)雜性嚴(yán)重制約了半乳聚糖的深入開發(fā)和應(yīng)用。結(jié)合糖在酸催化、加熱條件下可脫水縮合的特點，以及微波輻射具有加熱均勻、快速的優(yōu)勢，作者研究了微波輔助快速合成低聚糖、多糖的技術(shù)，并分別以葡萄糖、甘露糖、半乳糖為原料，在雜多酸催化下，快速、高收率地合成了相應(yīng)低聚糖或多糖[7-9]。糖類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中普遍存在多個位點的異構(gòu)，包括區(qū)域異構(gòu)及立體異構(gòu)，即糖苷鍵不同連接位置、不同立體化學(xué)的異構(gòu)形式，是化學(xué)法合成低聚糖、多糖過程中面臨的主要挑戰(zhàn)[10-12]，也是微波輔助合成聚糖過程中亟待解決的科學(xué)問題。若能夠掌握微波輻照、酸催化單糖聚合過程中的區(qū)域選擇性和立體選擇性規(guī)律，那么，微波輔助定向合成低聚糖、多糖將有可能成為現(xiàn)實。

王海松等對微波輻照、雜多酸催化半乳糖聚合的反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，并對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了初步的化學(xué)表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的半乳聚糖平均聚合度為17，半乳糖殘基以β-構(gòu)型為主[9]，但糖苷鍵的連接位置尚未闡明。作者在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，以半乳糖為原料，采用食品中常用的酸化劑——磷酸為催化劑，微波輻照合成半乳聚糖，并對合成產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)致的結(jié)構(gòu)分析，總結(jié)半乳糖聚合過程中的區(qū)域選擇性和立體選擇性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-半乳糖（Gal）、氯化鈉、磷酸、三氟乙酸、無水乙醇（99%）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；重水（D2O）：上海晶純生化科技股份有限公司產(chǎn)品；Sephadex G-25葡聚糖凝膠：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-200A型電腦微波固液相合成/萃取工作站：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；BSZ-100型自動部分收集器：上海青浦滬西儀器廠產(chǎn)品；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：無錫申科公司產(chǎn)品；1260型高效液相色譜儀 （配Shodex RI-101示差檢測器）：美國Agilent公司產(chǎn)品；ICS-5000型離子色譜儀器：美國Dionex公司產(chǎn)品；600型高效凝膠滲透色譜儀 （配2410視差檢測器）：美國Waters公司產(chǎn)品；7890A-5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品；560傅里葉變換紅外光譜儀：美國Nicolet公司產(chǎn)品；DRX-500核磁共振儀：德國Bruker公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 半乳聚糖的合成和純化 半乳聚糖的合成和純化參考王海松等的方法[9]。25 g D-半乳糖與1.1%磷酸、3.75 mL氯化鈉溶液（0.25 mol/L）充分?jǐn)嚢杌靹蚝笏腿胛⒉ǚ磻?yīng)器。設(shè)定微波功率800 W、反應(yīng)溫度130℃、反應(yīng)時間4.5 min，開啟攪拌器120 r/min，并開啟微波合成儀。反應(yīng)結(jié)束后，得淡黃色膠狀固體。反應(yīng)產(chǎn)物溶于去離子水中，經(jīng)5倍體積的無水乙醇沉淀后，棄上清液。多糖沉淀加去離子水復(fù)溶，采用Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜柱分離，以去離子水作洗脫劑，流量0.5 mL/min，用部分收集器收集洗脫液，每管收集量為3 mL，時間間隔6 min。收集液中的糖組分采用硫酸-苯酚法測定[13]，檢測波長為490 nm，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。收集各管洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，凍干得白色粉末狀樣品。

1.3.2 相對分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠滲透色譜法測定半乳聚糖的相對分子質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液：標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Dextran（相對分子質(zhì)量為828，2 700，9 750，36 800，13 5350，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品）；葡萄糖：Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；用流動相配成質(zhì)量濃度為5 g/L的溶液，然后于5 000 r/min速率下離心10 min，取上清；色譜柱：TSKgel G3000 PWXL凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，日本TOSOH公司）；流動相：0.1 mol/L NaNO2含0.5 g/L NaN3；流量：0.9 mL/min；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：20 μL。將系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖和葡萄糖相對分子質(zhì)量的對數(shù)Lg Mw對其相應(yīng)的保留時間tR進(jìn)行回歸處理，得出線性回歸方程。

1.3.3 半乳聚糖紅外光譜分析 稱取半乳聚糖樣品1.3 mg，加入200目的KBr粉末150 mg，于紅外燈照射下，在瑪瑙乳缽中研磨均勻，裝入壓片磨具，用油壓機以20 MPa的壓力壓制2 min，然后用鑷子小心取下壓片，裝入樣品架，用Nicolet 560傅里葉變換紅外光譜儀于500~4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描紅外光譜。

1.3.4 甲基化分析 半乳聚糖的甲基化分析參考Hakomori的方法[14]。20 mg干燥的半乳聚糖樣品溶解于6 mL DMSO中，室溫振蕩2 h。在氬氣保護(hù)下加入甲基亞磺酰負(fù)離子（30 mg的NaH固體溶解于3 mL無水DMSO中，溫度控制在50~55℃，攪拌至反應(yīng)液呈墨綠色，得甲基亞磺酰負(fù)離子），常溫下磁力攪拌至顏色退去，冰浴后緩慢加入4 mL碘甲烷，至溶液逐漸變?yōu)榈S色。反應(yīng)結(jié)束后加入少量蒸餾水終止反應(yīng)，然后將生成物透析，冷凍干燥得甲基化半乳聚糖。向上述甲基化半乳聚糖中加入1 mL甲酸，110℃水解6 h，加熱除去甲酸，再加入2 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸，置于安瓿瓶中，充惰性氣體密封后100℃反應(yīng)6 h，氬氣流中冷卻、干燥。在水解產(chǎn)物中加0.6 mL去離子水和50 mg NaBH4，室溫下過夜，加少量甲酸至無氣泡，加甲醇蒸干。然后加入1 mL的吡啶-乙酸酐（體積比為1∶1），100℃反應(yīng)2 h，旋蒸干燥后加氯仿溶解，進(jìn)行GC-MS分析，進(jìn)樣量為1~2 μL。GC-MS分析色譜柱：Agilent DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣流量（氦氣>99.99%）：1.0 mL/min，分流比1∶50；程序升溫：80℃，保留5 min，以15℃/min升至200℃保留l min，再以10℃/min升至260℃，保留10 min；接口溫度250℃；EI+源：70 eV，250℃，掃描頻率5次/秒，質(zhì)量范圍：33~600 amu。數(shù)據(jù)分析采用AMSD化學(xué)工作站軟件（version E.02.02.1431）和NIST11數(shù)據(jù)庫。

1.3.5 核磁共振波譜分析 半乳聚糖樣品前處理參考Hu等的方法[15]。25 mg半乳聚糖溶解于0.4 mL重水中，振蕩15 min，溶解后凍干，該步驟重復(fù)操作3次。最后將凍干的半乳聚糖樣品溶解在0.4 mL重水中，Bruker DRX-500核磁共振光譜儀檢測，記錄1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY，TOCSY，HMBC，HSQC譜。1H-NMR和13C-NMR光譜測定頻率分別為500.13和125.77 MHz，樣品測定溫度65℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 半乳聚糖的制備

中強酸可以促進(jìn)糖苷鍵原子的質(zhì)子化，加快多糖的水解和單糖的縮合。王海松等[9]采用微波輔助、雜多酸催化方法快速合成了半乳聚糖，并對合成工藝進(jìn)行了優(yōu)化。在本實驗中，根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)條件，采用食品工業(yè)中常用的磷酸代替雜多酸來催化半乳糖的聚合。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過除雜、柱色譜分離，得到半乳聚糖22.6 g，反應(yīng)得率為90.4%，與文獻(xiàn)[9]結(jié)果相近。實驗結(jié)果表明，磷酸能夠快速催化半乳糖聚合，與雜多酸相比，磷酸具有引入雜原子更少、反應(yīng)產(chǎn)物更易處理的優(yōu)勢。

2.2 相對分子質(zhì)量測定

根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖、葡萄糖溶液的保留時間，以保留時間tR對相對分子質(zhì)量的對數(shù)lg Mw作圖，結(jié)果見圖1。多糖相對分子質(zhì)量在180~135 350范圍內(nèi)，Lg Mw與tR呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Lg Mw=0.437 7tR+12.368，R2=0.998 8。

圖1 葡萄糖和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of glucose and dextrans

經(jīng)過乙醇沉淀和柱色譜分離純化后，半乳聚糖的高效凝膠滲透色譜行為如圖2所示，為單一、狹窄、對稱的色譜峰，表明制備得到的半乳聚糖純度較高。分析結(jié)果表明，半乳聚糖的重均相對分子質(zhì)量（Mw）為2 657，數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）為2 215，峰位相對分子質(zhì)量（Mp）為2 196，重均聚合度為16，分子質(zhì)量分布系數(shù)（HI=Mw/Mn）為1.19。HI值趨近于1，表明分離純化后的半乳聚糖分子質(zhì)量的多分散程度小，合成制備的半乳聚糖分子質(zhì)量分布較為均一。

2.3 紅外光譜分析

實驗合成的半乳聚糖和D-半乳糖的紅外光譜圖如圖3所示。與D-半乳糖相比，半乳聚糖位于3 000~3 700 cm-1處的O—H伸縮振動吸收峰較為寬鈍，提示半乳聚糖中存在豐富的、不同化學(xué)環(huán)境的羥基基團。王海松等認(rèn)為1 647 cm-1處是C＝O振動吸收峰[9]，但C＝O振動一般出現(xiàn)在1 725~1 730 cm-1處，這與紅外光譜信號并不一致，并且在1H和13C NMR圖譜（圖4）中未觀察到與羰基或羧基相對應(yīng)的化學(xué)位移信號。水的特征吸收峰出現(xiàn)在3 420 cm-1和1 630 cm-1附近，故而推測1 647 cm-1處是水的吸收峰，表明半乳聚糖中存在微量的水分。D-半乳糖和半乳聚糖在1 000~1 200 cm-1處存在3個強吸收峰，表明兩者均為吡喃型糖苷。877 cm-1和793 cm-1處的吸收峰表明半乳聚糖中存在α-和β-構(gòu)型的半乳糖殘基[9]。

圖2 半乳聚糖的高效凝膠滲透色譜分析Fig.2 High performance gel permeation chromatography of galactan

圖3 微波輔助合成半乳聚糖和D-半乳糖的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of synthesized galactan and galactose

2.4 甲基化分析

從半乳聚糖的甲基化結(jié)果（表1）可以看出，該多糖中半乳糖的主要連接方式為1，4和1，2，4連接，比例約為1.5∶1，而文獻(xiàn)報道紅藻來源的半乳聚糖的主鏈以1，3和1，4連接為主[16-17]。此外，微波輔助合成的半乳聚糖結(jié)構(gòu)中還存在部分的1，6連接型半乳糖殘基，以及少量的1，3和1，4，6連接的半乳糖結(jié)構(gòu)片段，而1，2和1，3，6連接的半乳糖殘基含量極低。這些結(jié)果表明，在反應(yīng)過程中，半乳糖上不同位置羥基的反應(yīng)活性不同，4-OH>6-OH>3-OH>2-OH。2，3，4，6-Me4-Gal為半乳糖末端，含量為4.2%，表明半乳聚糖具有較高的聚合度，與相對分子質(zhì)量的測定結(jié)果一致。

表1 半乳聚糖的甲基化分析Table 1 Methylation analysis of synthesized galactan

2.5 核磁共振波譜分析

核磁共振波譜是多糖結(jié)構(gòu)解析過程中的一個強有力的工具，能夠提供更多糖殘基的平面結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型信息。在半乳聚糖的1H-NMR譜（圖4（a））中，大多數(shù)的端基質(zhì)子化學(xué)位移出現(xiàn)在δ 5.02~5.30（J=0~2 Hz）處，而少數(shù)端基質(zhì)子信號位于δ 4.49（d，J=5.5 Hz）和δ 4.63（d，J=6.0 Hz），δ 3.5~4.4為半乳糖殘基H-2~H-6的質(zhì)子信號。一般地，在以重水為溶劑的核磁測試中，吡喃型糖殘基的α-構(gòu)型端基質(zhì)子出現(xiàn)在δ 5~6，偶合常數(shù)為2~4 Hz；而β-構(gòu)型端基質(zhì)子出現(xiàn)在δ 4~5，偶合常數(shù)為6~8 Hz[18]。因此，合成半乳聚糖主要以α-構(gòu)型為主，同時有少量的β-構(gòu)型半乳糖殘基。這與王海松等[9]的分析結(jié)果截然相反，可能是由于不同氘代試劑對質(zhì)子化學(xué)位移的影響，從而導(dǎo)致分析結(jié)果不一致。在王海松等合成的半乳聚糖的1H NMR圖譜[9]分析中，采用氘代二甲基亞砜為溶劑，致使端基質(zhì)子的核磁信號集體往高場移動約0.3×10-6，卻以重水為測試試劑時的構(gòu)型判別規(guī)律為參照，這是不恰當(dāng)?shù)?。?3CNMR譜中，半乳聚糖的端基碳化學(xué)位移主要集中在δ 99~110，而C-2~C-6的信號集中在δ63~85，未觀察到羰基或羧基的化學(xué)位移信號（圖4（b））。

圖4 聚半乳糖的1H（500 MHz）和13C（125 MHz）核磁共振譜圖Fig.41H and13C NMR spectra of synthesized galactan（500 MHz for1H NMR and 125 MHz for13C NMR in D2O）

圖5 半乳聚糖的1H-1H COSY和TOCSY核磁共振譜圖Fig.51H-1H COSY and TOCSY spectra of synthesized galactan

圖6 半乳聚糖的HSQC和HMBC核磁共振譜圖Fig.6 HSQC and HMBC spectra of synthesized galactan

根據(jù)半乳糖殘基H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H2-6質(zhì)子的相關(guān)性，分析反映鄰近質(zhì)子偶合相關(guān)性的1H-1H COSY譜和反映同一自旋體系中質(zhì)子標(biāo)量偶合相關(guān)性的TOCSY譜（圖5），對不同連接型半乳糖殘基的質(zhì)子信號進(jìn)行歸屬，結(jié)果如表2所示。以β-構(gòu)型半乳糖殘基端基質(zhì)子信號δ 4.49為例，在TOCSY譜中，δ 4.49與δ 3.60，3.70，3.98，4.02有較強的相關(guān)信號，表明這5個質(zhì)子存在于同一個半乳糖殘基中；結(jié)合1H-1H COSY譜中δ 4.49與3.60的相關(guān)信號，推斷H-2的化學(xué)位移為δ 3.60，進(jìn)而根據(jù)H-2/H-3的相關(guān)信號，推斷H-3的化學(xué)位移為δ 3.70；類似地，最終推導(dǎo)了整個半乳糖殘基的質(zhì)子信號。根據(jù)HSQC譜中氫、碳核磁信號的相關(guān)性（圖6（a）），歸屬了不同質(zhì)子信號對應(yīng)的碳化學(xué)位移（表2），并根據(jù)HMBC譜中（圖6（b）），氫、碳信號之間的長程偶合（3J）相關(guān)，對歸屬的質(zhì)子信號進(jìn)行驗證，并推斷半乳糖殘基中的取代位點。端基質(zhì)子δ 5.02與δ 73.5（C-6）有強HMBC相關(guān)信號，表明半乳聚糖中存在6位羥基取代的糖殘基，而往低場移動了約8×10-6的C-6铘化學(xué)位移，進(jìn)一步表明結(jié)構(gòu)中存在→6）Gal（1→結(jié)構(gòu)片段。

表2 半乳聚糖主要糖殘基的化學(xué)位移數(shù)據(jù)Table 2 Chemical shifts of major galactosyl residues in synthesized galactan

對一維 （1H，13C NMR）和二維 （1H-1H COSY，TOCSY，HSQC和HMBC）核磁圖譜的綜合分析，最終解析了→6）-β-D-Galp（1→，→4）-β-D-Galp（1→，→4）-α-D-Galp（1→和→2，4）-α-D-Galp（1→糖殘基信號（表2），對照半乳聚糖的相對分子質(zhì)量和甲基化分析結(jié)果（表1），表明微波輔助、磷酸催化合成的半乳聚糖結(jié)構(gòu)中存在較多的→4）-DGalp（1→和→2，4）-α-D-Galp（1→片段，推測該糖鏈為多分支的鏈狀結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)語

在微波輻照條件下，采用磷酸代替雜多酸能夠快速、高效地催化D-半乳糖的縮合，純化后半乳聚糖的得率為90.4%。反應(yīng)生成的半乳聚糖為分支鏈狀結(jié)構(gòu)，平均聚合度為16，立體構(gòu)型以α為主，新糖苷鍵的生成主要發(fā)生在4位、2位和6位的羥基上。通過對半乳聚糖的結(jié)構(gòu)分析表明，微波輔助、磷酸催化半乳糖縮合過程中，不同位置的羥基反應(yīng)活性不同，若能對目標(biāo)羥基進(jìn)行保護(hù)性修飾，則有可能進(jìn)一步提高反應(yīng)的選擇性。微波輔助合成半乳聚糖結(jié)構(gòu)的闡明，也為進(jìn)一步研究和理解其生物活性提供了基礎(chǔ)。

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會議消息

Preparation and Structural Characterization of Galactans Synthesized by Phosphoric Acid Catalyzation under Microwave Irradiation

JI Gao1， WANG Haisong1， DING Yinyi1， CHENG Xiangrong*1，2， LE Guowei1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Galactans synthesized by phosphoric acid catalysis and microwave irradiation were studied for their chemical structures and regio-and stereo-selectivities during the polymerization.A series of analyses including high-performance gel-permeation chromatography，infrared spectroscopy，methylation analysis and NMR spectroscopies（1H，13C，1H-1H COSY，TOCSY，HSQC，HMBC）were used.Results showed that the degree of galactosyl polymerization was 16 and the -galactopyranosyl residues were dominant mainly with→4）-α-D-Galp（1→and→2，4）-α-D-Galp（1→fragments.Structural analyses further indicated that the activities of hydroxyls in galactose were different and the 4-OH exhibited the highest potency.

microwave，phosphoric acid，galactan，structural analyses

TS 245.9

A

1673—1689（2017）01—0027—07

2015-03-24

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）。

*通信作者：成向榮（1985—），男，浙江永康人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要從事食品營養(yǎng)與功能因子研究。E-mail：cheng-xiangrong@hotmail.com

紀(jì) 高，王海松，丁寅翼，等.微波輔助、磷酸催化合成半乳聚糖的結(jié)構(gòu)分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（01）：27-33.