何 坤，夏 勇，袁國(guó)丹

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心 400000)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

Xpert MTB/RIF技術(shù)在早期診斷耐藥結(jié)核中的應(yīng)用研究

何 坤，夏 勇△，袁國(guó)丹

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心 400000)

目的探討結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Xpert MTB/RIF)技術(shù)早期判斷耐藥結(jié)核的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法收集本中心462例確診為結(jié)核病患者的痰樣本，分別進(jìn)行Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)、結(jié)核羅氏培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥率為22.6%(95/420)，快速藥敏檢測(cè)利福平耐藥率為19.8%(83/420)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩種方法檢測(cè)對(duì)利福平均耐藥者為78株，平均敏感者為320株，兩種方法結(jié)果一致率為94.8%(398/420)。Xpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥的結(jié)果敏感度93.97%，特異度94.96%。對(duì)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa=0.843，一致性較好，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值82.11%，陰性預(yù)測(cè)值98.46%。結(jié)論Xpert MTB/RIF檢查可快速、準(zhǔn)確判斷對(duì)利福平耐藥的結(jié)核。

Xpert MTB/RIF；利福平；肺結(jié)核；結(jié)核羅氏培養(yǎng)；藥敏試驗(yàn)

結(jié)核病是一種危害人類健康的傳染性疾病，我國(guó)為結(jié)核高發(fā)國(guó)家之一。據(jù)WHO監(jiān)測(cè)統(tǒng)計(jì)，新的結(jié)核病患者中，有10.2%的患者會(huì)出現(xiàn)對(duì)至少一種抗結(jié)核藥物耐藥。我國(guó)每年新增耐多藥結(jié)核(MDR-TB)患者約12萬(wàn)人，其傳染性更強(qiáng)、治愈率更低，病死率可達(dá)1/4，因此如何更好地發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者，尤其是MDR-TB患者，是控制耐藥結(jié)核傳播的關(guān)鍵[1]。在抗結(jié)核治療時(shí)了解患者否對(duì)利福平耐藥至關(guān)重要，其可作為MDR-TB判斷標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道了Xpert MTB/RIF技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的準(zhǔn)確性[4-5]。本研究收集本中心462例確診為結(jié)核病患者的痰標(biāo)本進(jìn)行Xpert MTB/RIF技術(shù)與結(jié)核培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1-12月于本中心就診的初次確診為結(jié)核病且既往從未服用過(guò)任何抗結(jié)核藥物的患者462例，其中男277例，女185例，年齡15～75歲?；颊呔押炗喼橥鈺?。

1.2方法

1.2.1試劑 Xpert MTB/RIF反應(yīng)盒及樣品試劑(SR)均購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司；結(jié)核羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2.2檢測(cè)方法 對(duì)所有確診結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)、結(jié)核羅氏培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)檢測(cè)。按照結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)流程進(jìn)行操作[6]。

1.2.2.1Xpert MTB/RIF核酸擴(kuò)增檢測(cè) 取1 mL痰標(biāo)本放至有螺旋蓋的前處理管中，然后加入2倍痰標(biāo)本體積的SR痰標(biāo)本處理液，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。打開(kāi)反應(yīng)盒，取2 mL處理后的樣品由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放置到檢測(cè)模塊，儀器開(kāi)始進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接觀察測(cè)試結(jié)果。

1.2.2.2結(jié)核羅氏培養(yǎng) 吸取2.0 mL痰標(biāo)本至帶螺旋蓋的前處理管中，視樣本性狀，加入1～2倍體積4%氫氧化鈉前處理液，置渦旋振蕩器上振蕩30～60 s，至標(biāo)本充分混勻，室溫放置15 min。前處理完成后，以無(wú)菌吸管吸取前處理液0.1 mL，均勻接種在2支中性羅氏培養(yǎng)基斜面上，保持斜面水平向上37 ℃培養(yǎng)24 h 后，直立放置37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)。接種后第3、7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察1 次，并在分離培養(yǎng)結(jié)果記錄本上記錄生長(zhǎng)結(jié)果

1.2.2.3結(jié)核快速藥敏試驗(yàn) 用接種環(huán)取1 環(huán)培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?duì)制成1 mg/mL 菌懸液，梯度稀釋為10-1mg/mL，接種0.01 mL到對(duì)硝基苯甲酸(PNB) 和噻吩-2-羧酸肼(TCH) 培養(yǎng)基，同時(shí)梯度稀釋10-2mg/mL 和10-4mg/mL，接種0．01 mL 到含利福平(40.0 μg/mL)和異煙肼(0.2 μg/mL)的羅氏固體培養(yǎng)基和空白對(duì)照管培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 周，觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)、校正χ2檢驗(yàn)和確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)和結(jié)核快速藥敏進(jìn)行一致性kappa檢驗(yàn)，≥0.75認(rèn)為一致性較好。

2 結(jié) 果

2.1基本情況 462例確診結(jié)核的患者痰標(biāo)本全部進(jìn)行Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)、結(jié)核羅氏培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)。Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性460例(99.6%)，陰性2例(0.4%)；結(jié)核羅氏培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性420例(90.9%)，因此本研究中以420例樣本進(jìn)行分析。

2.2藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 以結(jié)核快速藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥率22.6%(95/420)，快速藥敏檢測(cè)利福平耐藥率19.8%(83/420)，兩種方法檢測(cè)對(duì)利福平均耐藥者為78株，平均敏感者為320株，兩種方法結(jié)果一致率為94.8%(398/420)，耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Xpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥的結(jié)果敏感度93.97%，特異度94.96%。對(duì)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa=0.843，數(shù)值大于0.75表明一致性較好，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值82.11%，陰性預(yù)測(cè)值98.46%。

2.3異煙肼與利福平交叉耐藥對(duì)比 以結(jié)核快速藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，本研究中利福平耐藥共83株，其中同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥有73株，利福平、異煙肼同時(shí)耐藥比例為88%。

3 討 論

結(jié)核病和結(jié)核病耐藥性的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)對(duì)提高患者預(yù)后和降低結(jié)核病的傳播至關(guān)重要。傳統(tǒng)的抗酸染色涂片被廣泛應(yīng)用于結(jié)核快速診斷，但其靈敏度低，容易漏診，且無(wú)法區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。結(jié)核培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，固體培養(yǎng)需要4至6周，在結(jié)核培養(yǎng)基礎(chǔ)上進(jìn)行藥敏檢測(cè)，需要2至4周，總計(jì)大概需要3個(gè)月，無(wú)法滿足臨床診療需求。因此，需要一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法用于臨床診斷及指導(dǎo)治療。

目前，分子生物學(xué)發(fā)展迅猛，有多種方法檢測(cè)結(jié)核耐藥性。其中有3個(gè)試驗(yàn)方法檢測(cè)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌株是否耐藥，結(jié)果較為理想。Geno Type MTB DRplus(海恩基礎(chǔ)生物，德國(guó))主要檢測(cè)rpoB、KatG基因是否突變，從而判斷是否對(duì)利福平、異煙肼耐藥。INNO-LIPA Rif TB試劑盒(Fujirebio，比利時(shí))檢測(cè)靶向DNA基因rpoB突變情況。Xpert MTB/RIF(Cepheid 美國(guó))檢測(cè)技術(shù)，整合傳統(tǒng)PCR檢測(cè)的3個(gè)步驟，自動(dòng)化將標(biāo)本提供到試劑盒，進(jìn)行核酸的提取、擴(kuò)增、目標(biāo)序列檢測(cè)。采用半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，主要是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因rpoB的81 bp是否突變，明確是否耐藥[7-8]。其中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在所有分子生物檢測(cè)手段中是最具成本效益的[9-10]。WHO建議Xpert MTB/RIF技術(shù)作為結(jié)核病初期診斷測(cè)試，特別適用于懷疑合并感染HIV的患者[11-12]，避免延誤病情。

在本研究中，結(jié)核快速藥敏檢測(cè)方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥性與結(jié)核快速藥敏法具有較高一致性。Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥敏感度93.97%，特異度94.96%。對(duì)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa=0.843。同時(shí)，對(duì)利福平及異煙肼交叉耐藥情況進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比分析，研究結(jié)果顯示兩種藥物同時(shí)耐藥率達(dá)89.00%。本研究中結(jié)果與國(guó)內(nèi)外報(bào)道結(jié)果基本一致[13-14]。

因此，Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的結(jié)果具有較好可靠性，可以早期準(zhǔn)確判斷出是否為耐多藥結(jié)核菌株。此外，在本研究中，有23例Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與結(jié)核快速藥敏不一致。原因考慮：(1)結(jié)核分枝桿菌基因表型與體外表型結(jié)果不一致，已有文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。(2)利福平rpob基因511、533位點(diǎn)突變，影響檢測(cè)結(jié)果。(3)混合有非結(jié)核分枝桿菌感染[15]。在今后臨床工作中，可隨訪患者治療方案及預(yù)后，整理實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與臨床治療效果對(duì)比分析。

綜上所述，Xpert MTB/RIF技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快捷方便，可提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，尤其適用于對(duì)可疑耐藥結(jié)核、合并HIV感染的患者。同時(shí)，可以讓MDR-TB治療快速啟動(dòng)，以待常規(guī)結(jié)核培養(yǎng)和藥敏結(jié)果。

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1671-8348(2017)26-3707-02

2017-02-26

2017-06-14)

何坤(1984-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事結(jié)核方面研究?！?/p>

，E-mail:xiayong_7777@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.039