季學海， 譚玉靜， 薛詠梅， 駱迎華， 黃志斌， 陳 璐， 韓瑩瑩

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海 200040)

研究與技術

ATP發(fā)光法在紡織品抗菌防霉性能測試中的應用

季學海， 譚玉靜， 薛詠梅， 駱迎華， 黃志斌， 陳 璐， 韓瑩瑩

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海 200040)

近年來，紡織品抗菌測試手段得到了長足的發(fā)展，但是由于種種技術條件的限制，傳統(tǒng)的紡織品抗菌測試方法仍暴露出了諸多弊端，因此，新的檢測方法的探索勢在必行。ATP發(fā)光法作為非傳統(tǒng)的抗菌測試手段，相對于傳統(tǒng)測試方法具有方便快捷、準確度高、時效性強等諸多優(yōu)點，在其他工業(yè)領域已得到了廣泛應用。文章闡述了ATP發(fā)光法的試驗原理及其發(fā)展歷程，探討了此法應用于紡織品抗菌性能檢測的優(yōu)越性及發(fā)展方向，從而論證了ATP發(fā)光法用于紡織品抗菌性能測試的可行性，將ATP發(fā)光法應用于紡織品的抗菌防霉效果測試具有重要的研究價值和現(xiàn)實意義。

ATP發(fā)光法；紡織品；抗菌防霉；生物技術；性能測試

進入21世紀之后，隨著人們對生活質(zhì)量要求的不斷提高，抗菌紡織品產(chǎn)業(yè)得到了迅速發(fā)展?？咕徔椘肥袌鋈萘康牟粩鄶U大及市場競爭的日益激烈，對準確、快速的檢測手段提出了新的要求。目前，國內(nèi)、國際上普遍采用的紡織品抗菌防霉性能測試方法大體分為定性判定和定量測定兩大類，涵蓋了細菌、真菌、螨蟲等諸多微生物。但是在日常實際檢測中，也逐漸凸顯出了一些缺陷，尤其是在測試紡織品抗真菌性能時，實驗結果存在對照樣增長值過低[1-2]、不易計數(shù)、測試周期較長、檢測準確度不高等問題，從而嚴重影響抗菌測試結果的客觀評定，這對準確評價紡織品的抗菌防霉效果是極為不利的。因此，進一步完善傳統(tǒng)測試方法、建立健全新的測試體系，對于抗菌紡織品市場的良性發(fā)展尤為重要。

ATP生物發(fā)光法技術于20世紀70年代興起，在之后不足十年的時間里，ATP檢測儀檢測系統(tǒng)便被英國人首先研制成功，隨后該項技術便在歐洲、美國、日本等工業(yè)發(fā)達國家得到普遍關注。1998年日本率先將ATP生物發(fā)光法技術納入檢測法，即《關于食品制造過程管理高度化臨時措施法》，并于次年成立了ATP涂抹檢查研究會，以專門研究該技術的適用領域及使用效率。中國于20世紀末將ATP檢測技術引進國內(nèi)，并要求相關研究機構對此技術進行深入研究。進入21世紀前十年，ATP生物發(fā)光法作為一種非傳統(tǒng)的、快速的微生物檢測技術已基本成熟。目前，ATP生物發(fā)光技術應用領域主要包括食品工業(yè)中微生物的檢測[3]、醫(yī)療及衛(wèi)生行業(yè)[4]、環(huán)境及安全領域[5]的檢測，以及快速細胞計數(shù)、細胞增殖、細胞毒理和熒光素酶檢測[6]等其他生物學檢測。

與此同時，世界各國紡織科研工作者都對該項技術進行了積極研究，期望以此帶動紡織品抗菌檢驗技術的飛躍，并已取得了一定成果。這不僅證實了將ATP發(fā)光法用于紡織領域的可行性，大體掌握了ATP發(fā)光法用于紡織品抗菌檢測的一般流程，更是對該技術的優(yōu)點與不足有了更深層次的認識。大量的研究成果表明，將ATP發(fā)光法應用于紡織品的抗菌防霉效果測試具有重要的研究價值，同時對客觀評價紡織品的抗菌性，完善抗菌紡織品相關測試標準具有重要意義。

1 ATP發(fā)光法的試驗原理

ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)，是由一分子核糖、一分子腺嘌呤和三個相連的磷酸基團有機結合而成的一種不穩(wěn)定的高能化合物，其分子結構如圖1所示。

圖1 ATP分子結構式Fig.1 The molecular structural formula of ATP

ATP在細胞核、線粒體、染色體等細胞器中大量存在，是細胞內(nèi)部自由能量的有機載體。在適宜條件下，ATP、ADP和AMP可以相互轉(zhuǎn)化，并伴隨大量能量的釋放與吸收。三者之間的相互轉(zhuǎn)化如下式所示：

任何生物的生命活動都需要能量的供應，同時，處于一定生理時期的活體微生物，其體內(nèi)的ATP數(shù)量基本恒定，而當微生物生命活動消失后，其體內(nèi)細胞中的ATP會很快被相應的蛋白酶降解，不會對活體微生物的測定產(chǎn)生影響[7]。換言之，ATP作為生物體生命活動不可或缺的能量供應者，其密度能夠反映出生物體的數(shù)量[8]。正是ATP的這一特點，使得利用ATP生物發(fā)光法來測試活體微生物的數(shù)量指標成為可能，即通過測定樣品中的ATP濃度，便可推算出活菌數(shù)。

ATP的生物發(fā)光技術作為一項非傳統(tǒng)的生物技術，最早是由McElroy和Strehler于1949年提出[9]。但是，由于當時的客觀條件限制，直到20世紀70年代中期，該項技術才開始逐漸形成。1983年，英國生物學家Moyer等[10]最早提出細胞內(nèi)源性ATP的含量與活細胞的數(shù)量即活性之間存在客觀聯(lián)系。同年瑞典學者Gronroos等[11]也通過多次試驗論證，證實了ATP生物發(fā)光法是一種確定細胞活性度的可靠的、靈敏度高的檢測方法。緊隨其后，愛爾蘭科學家McElroy[12]最先引入熒光素酶-ATP檢測法。

簡單地說，ATP熒光反應具體的反應過程可用以下方程式表示：

該技術主要包括以下環(huán)節(jié)：取得樣品→萃取樣品ATP→加入熒光素和熒光素酶混合物→測定發(fā)光量→計算ATP濃度→計算得到活菌數(shù)。通常情況下，該項技術需要注意以下兩點：1)ATP在細胞內(nèi)部，因此提取ATP前需要處理微生物的細胞壁和細胞膜；2)只有ATP與熒光素及生物發(fā)光試劑作用后，才可以用熒光儀測定生物發(fā)光量[13]。

2 ATP發(fā)光法在紡織品抗菌檢測中的應用

2.1 傳統(tǒng)紡織品抗菌性能測試方法的缺陷

近十年來，國內(nèi)外研制生產(chǎn)了多種抗菌防霉紡織產(chǎn)品，涉及一次性使用衛(wèi)生用品、公共用紡織品及個人用紡織品等諸多領域。如何準確評價這些紡織產(chǎn)品的抗菌性能，對抗菌防霉紡織品工業(yè)的良性發(fā)展至關重要。目前，國內(nèi)外測試紡織品抗菌性能的標準有很多，如：中國紡織行業(yè)標準FZ/T 73023—2006《抗菌針織品》、FZ/T 62015—2009《抗菌毛巾》和國家標準GB/T 20944.1—2007《紡織品 抗菌性能的評價 第一部分：瓊脂擴散法》；日本標準有JIS L1902：2002《紡織制品抗菌活性及效果測試》；美國標準有AATCC 100—2004《紡織品材料上耐細菌整理：評定》等。整體來看，這些方法雖然原理相似，但要求的試驗條件卻各有不同，這就使紡織品抗菌測試處于操作不統(tǒng)一，結果無對比性的尷尬地步。同時，紡織品的抗菌性能主要包括兩方面內(nèi)容，即紡織品的抗細菌性能與防霉性能。一直以來，由于真菌相對細菌而言存在生長周期過長(在適宜情況下，細菌培養(yǎng)18～24 h即可觀察試驗結果，而霉菌則需培養(yǎng)2～4周才能進行評價)；不能進行準確的菌落計數(shù)，只能通過霉菌覆蓋試樣的面積進行定性判定；可操作性較差、技術難度大等特點，成為擺在廣大紡織科研工作者面前的一大難題。因此，為了更加客觀、準確地對紡織品抗菌性能進行評價，防霉檢測手段需要突破各種技術壁壘或者采用更為先進的技術手段。

2.2 ATP發(fā)光法在紡織品抗菌檢測中的應用

紡織品的抗菌性能檢測歸根結底還是對微生物進行檢測，因此，在其他工業(yè)領域大放異彩的ATP發(fā)光法也同樣進入紡檢工作者的視線。事實上，在前人研究的基礎上，無數(shù)試驗結果表明，將ATP發(fā)光法運用到紡織品的抗菌檢測潛力無限。

2003年前后，日本科學家把纖維制品的洗滌液加入到具有測定用緩沖液的試管內(nèi)，依次加入ATP提取劑和發(fā)光試劑，然后用測定發(fā)光量的方法來測定纖維制品的抗菌性，試驗結果表明，此法測得數(shù)據(jù)準確度較高，且方便快捷。同年，臺灣《染化雜志》發(fā)表了題為《纖維制品的抗菌性試驗方法與評估—ATP發(fā)光測定法》的專輯，較為詳盡地闡釋了ATP發(fā)光法應用于紡織品生物測試的可行性。

2007年，國際標準化組織ISO在博采眾長的基礎上，發(fā)布了ISO 20743—2003《紡織品-抗菌整理紡織品抗菌性能測定》，此標準中采用的細菌計數(shù)方法即為ATP生物發(fā)光法，并明確指出此法適用于經(jīng)過各種形式抗菌整理后的纖維、紗線、服裝、家庭裝飾品等紡織品。同時，針對AATCC 30—2004《紡織品材料抗菌性能評定-抗霉爛》中瓊脂平板法、濕度瓶法和土埋法三種測試方法測試周期長，不具有可比性，不適用于非溶出型抗菌產(chǎn)品的缺陷，ISO紡織品技術委員會(TC38)專案工作組抗微生物紡織品工作組(WG23)緊鑼密鼓地研究制定新的相關標準，并于2012年8月制定出采用ATP發(fā)光法進行抗菌檢測的國際標準ISO 13629—1:2012《紡織品的抗真菌活性測定 第1部分：熒光法》。

作為紡織工業(yè)大國，目前中國在紡織領域的所有國家和行業(yè)標準仍采用傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)計數(shù)法，在相當長的一段時間內(nèi)，ATP發(fā)光法在紡織品中的應用研究未見諸報道。2013年，中國上海質(zhì)檢院的譚玉靜、王志惠、林圣光等選用黑曲霉、產(chǎn)黃青霉和白色念珠菌為抗真菌測試菌種，針對振蕩法測試中白色念珠菌對照樣增長值過低的問題和平皿培養(yǎng)法測試中操作條件多變的問題，對兩個測試方法體系分別進行了優(yōu)化，建立了抗真菌檢測的ATP發(fā)光法，并以防霉整理的純棉織物為對象，比較了平皿培養(yǎng)法和ATP發(fā)光法兩種測試方法，得出了ATP法比平皿培養(yǎng)法不僅快速而且靈敏的結論[14]。

與此同時，國內(nèi)外研究表明，ATP發(fā)光法還可用于紡織品防螨性能的測試。Takao EBINA等[15]采用ATP發(fā)光法成功地將不同生活期的植物類產(chǎn)品中螨蟲活度進行了再現(xiàn)，從而擴展了ATP發(fā)光法的檢測范圍與檢測準確性，有望使該方法在抗螨紡織品的功效評價中得到廣泛應用。

3 ATP發(fā)光法應用于紡織品抗菌檢測的優(yōu)越性及發(fā)展方向

3.1 ATP發(fā)光法應用于紡織品抗菌檢測的優(yōu)越性

隨著功能性紡織品的快速發(fā)展，目前各國均制定了與之配套的國家標準。這些國家標準雖各有不同，但總的來說，均是從美國和日本最初的相關檢測方法或國家標準中發(fā)展而來。美國現(xiàn)行AATCC 30—2010標準即是在AATCC 30—2004標準的基礎上改進后，于2010年開始執(zhí)行。中國的紡織品防霉性能評價方法主要分為平皿培養(yǎng)法和懸掛法兩類，采用的菌種均為混合菌種，其原理就是在適宜的外界條件下，將待測樣品在不含碳源的無機鹽瓊脂培養(yǎng)基[16]上培養(yǎng)一定時間后，觀察菌落在培養(yǎng)基表面的生長情況，并據(jù)此對紡織品防霉性能進行等級評定。相對于這些傳統(tǒng)的檢測方法，將ATP發(fā)光法應用于紡織品的抗菌性能檢測，主要具有以下優(yōu)點：

1)時效性。目前不少傳統(tǒng)的檢測標準均能對紡織品抗霉菌性能進行測試，但均耗時較長。以GB/T 24346—2009《紡織品防霉性能的評價》為例，使用該方法進行測試時，試驗中霉菌的培養(yǎng)大概需要2～4周，然后通過觀察測量霉菌的生長面積來判定紡織品的抗菌性能。而使用ATP發(fā)光法進行測試時，菌種的培養(yǎng)時間只需(42±2)h，抗菌性能的判定通過ATP檢測儀進行，5 s內(nèi)便可得到結果。

2)定性測試與定量測試的差別。傳統(tǒng)的紡織品防霉性能檢測只能通過試樣上霉菌生長的面積來做基本的定性評價，無法給出準確數(shù)值；而用ATP發(fā)光法測試時，培養(yǎng)基上的霉菌濃度可以通過ATP檢測儀給出準確數(shù)字，經(jīng)過簡單計算便可得到抑菌率。

3)自動化程度和可操作性。傳統(tǒng)檢測方法操作復雜，步驟繁瑣，自動化程度低，而ATP發(fā)光法相對而言操作簡便、快速，可以自動化操作。

4)ATP發(fā)光法在重現(xiàn)性及測定范圍等方面也具有獨特優(yōu)勢。

3.2 ATP發(fā)光法應用于紡織品抗菌檢測的發(fā)展方向

將ATP發(fā)光法應用于紡織品抗菌性能檢測具有檢測速度快、測定范圍較廣、可進行自動化操作、簡便快捷等諸多優(yōu)勢，應用前景十分廣闊。但是，在現(xiàn)實使用過程中，紡檢工作者也逐漸發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行ATP發(fā)光法不完善的一面。首先，ATP發(fā)光法要求樣品中活菌濃度最少不低于1 000個/mL，但這種靈敏度是達不到某些衛(wèi)生要求的；其次，ATP檢測儀的靈敏度很高，這也造成此法易受游離ATP和體細胞的干擾，測試環(huán)境中的無關游離ATP會導致試驗測定值偏高；再者，ATP發(fā)光法是以局部能量高低來對活菌濃度進行表達，換言之，此法不能確定微生物的種類，且易受外界環(huán)境(如養(yǎng)分、pH值、鹽)影響，而且ATP提取實驗所需的試劑較為昂貴，試成本較大。因此，該方法還有待進一步改進[17]。

鑒于現(xiàn)行ATP生物發(fā)光法存在的現(xiàn)實問題，當前對ATP發(fā)光法的改進主要圍繞以下幾方面進行：

1)采用合適的技術手段，對細菌、真菌等微生物進行分級分離工作，以確定菌的種類。這是由于微生物細胞中ATP的含量與菌的種類、大小及細胞生長所處的周期有關。例如，不同的菌種都有其特定的DNA序列，可以嘗試將生物發(fā)光法與DNA分子識別技術結合起來，如此一來，不僅可以檢測出菌落總數(shù)，還可以鑒定菌的種屬。

2)進一步優(yōu)化發(fā)光體系中熒光素、熒光素酶、緩沖液、樣品提取液等“量”的分配?？梢試L試用SAS軟件進行試驗優(yōu)化設計，以期得到優(yōu)化后的試驗條件。

3)對影響ATP發(fā)光反應的各個因素進行深入研究，以期降低甚至消除副反應。

4)對發(fā)光反應中使用的熒光素、熒光素酶種類進行優(yōu)化，在保證不影響測試結果的前提下，降低測試成本。

5)進一步提高發(fā)光檢測儀的智能化，盡可能地避免因儀器誤判造成的試驗誤差，保證試驗的重復性[18]。

4 結 語

ATP發(fā)光法作為非傳統(tǒng)的抗菌測試手段，相對于傳統(tǒng)測試方法具有方便快捷、時效性等諸多優(yōu)點，因此受到人們的普遍關注，并已逐漸在紡織品抗菌性能檢測中得到廣泛使用。繼續(xù)深入研究ATP發(fā)光法面臨的難題，并運用高科技手段不斷改進優(yōu)化，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

[1]郭麗,王建坤.紡織品抗菌性能測試方法及比較[J].河北紡織,2010(3):9-16. GUO Li, WANG Jiankun. Comparing the methods for textile antibacterial activith evaluation[J]. Hebei Textiles,2010(3):9-16.

[2]趙婷,林云周.紡織品抗菌性能評價方法比較[J].紡織科技進展,2010(1):73-76. ZHAO Ting, LIN Yunzhou. Comparing the methods for textile antibacterial activity evaluation[J]. Progress in Textile Science & Technology,2010(1):73-76.

[3]侯玉柱,田雨,柯潤輝,等.ATP生物發(fā)光法在飲料微生物檢驗中的應用分析[J].飲料工業(yè),2013,16(11):41-47. HOU Yuzhu, TIAN Yu, KE Runhui, et al. Application of ATP bioluminescence in microbial detection of beverages[J]. Beverage Industry,2013,16(11):41-47.

[4]CREE I A, KURBACHER C M. ATP-based tumor chemo sensitivity testing: assisting new agent development[J]. Anti-cancer Drugs,1999,10(5):431-435.

[5]曹利蓉,張偉,晁蕊.ATP生物發(fā)光法在站車食品器具衛(wèi)生學檢驗中的應用[J].鐵道勞動安全衛(wèi)生與環(huán)保,2004,31(2):86-87. CAO Lirong, ZHANG Wei, CAO Rui. Application of ATP bioluminescence in inspection of train food[J]. Railway Occupational Safety Health & Environmental Protection,2004,31(2):86-87.

[6]張博,康懷興,米志強,等.基于裂解酶與ATP生物發(fā)光法特異定量檢測炭疽桿菌方法的研究[J].生物技術通訊,2014,25(1):9-12. ZHANG Bo, KANG Huaixing, MI Zhiqiang, et al. Quantitative specific detection of bacillus anthracis based on bacteriophage lysine and luminescence techniques[J]. Letters in Biotechnology,2014,25(1):9-12.

[7]李春艷,霍貴成,王德國,等.ATP生物發(fā)光法快速測定生乳中微生物總數(shù)的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2008,39(7):23-24. LI Chunyan, HUO Guicheng, WANG Deguo, et al. Research on rapid detecting microbial count in raw milk with ATP bioluminescence[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2008,39(7):23-24.

[8]陳穎,鄒秉杰,朱術會,等.利用ATP擴增反應與生物發(fā)光法結合檢測微量微生物[J].微生物學報,2009(6):16-19. CHEN Yin, ZOU Binjie, ZHU Shuhui, et al. Detection of low-level microorganism by concomitant use of ATP amplification and bioluminescence assay[J]. Acta Microbiologica Sinica,2009(6):16-19.

[9]李麗霞,常超,伍金娥.ATP生物發(fā)光法檢測拭子的研究進展[J].糧食科技與經(jīng)濟,2010,35(5):10-11. LI Lixia, CHANG Chao, WU Jin’e. The research progress of ATP bioluminescence in swab detection[J]. Grain Science and Technology and Economy,2010,35(5):10-11.

[10]JAMES D M, HENDRSON J F. Nucleoside triphosphate specificity of firefly luciferase[J]. Analytical Biochemistry,1983,131(1):187-189. [11]GRONROOS M, MAENPAA J, NIEMINEN A L, et al. 548 Correlation of steroid receptor contents with medroxyprogesterone and tamoxifen effects in endometrial cancer assayed by barin vitro ATP-bioluminescence method[J]. Journal of Steroid Biochemistry,1983,19(1):194.

[12]王凌.ATP再生系統(tǒng)結合生物發(fā)光法檢測微量微生物含量的研究[D].武漢:武漢輕工大學,2013:3-15. WANG Lin. Research on the Contents of Trace Microbial Using Regeneration System Combined with ATP Bioluminescent Method[D]. Wuhan: Wuhan Polytechnic University,2013:3-15.

[13]NYREN P. Apyrase immobilized on paramagnetic heads used to improve detection limits in bioluminometric ATP monitoring[J]. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence,1994,9:29-34.

[14]王志惠.紡織品抗真菌性能評價方法的研究與改進[D].上海:東華大學,2015:4-7. WANG Zhihui. Research and Improvement of Evaluation Methods on Anti-Fungal Activity of Textile[D]. Shanghai: Donghua University,2015:4-7.

[15]EBINA T, OHTO K. ATP assay for determining the viability of the two-spotted spider mite and the European red mite during diapauses[J]. Applied Entomology and Zoology,2007,42(2):291-296.

[16]FZ/T60030-2009家用紡織品防霉性能測試方法[S].2009. FZ/T 60030-2009 Home textiles mouldproof performance test methods[S].2009.

[17]尹子波,侯玉柱,尹建軍,等.ATP生物發(fā)光技術在微生物檢測中的應用[J].食品研究與開發(fā),2012,33(2):228-231. YING Zibo, HOU Yuzhu, YIN Jianjun, et al. Study and application of adenosine triphosphate(ATP)bioluminescence in microbes determination[J]. Food Research and Development,2012,33(2):228-231.

[18]唐倩倩,葉尊忠,王劍平,等.ATP生物發(fā)光法在微生物檢驗中的應用[J].食品科學,2008,29(6):460-465. TANG Qianqian, YE Zunzhong,WANG Jianpin, et al. Application of ATP bioluminescence in microbial detection[J]. Food Science,2008,29(6):460-465.

Discussion on application of ATP luminescence method in antibacterial and anti-mold property testing of textiles

JI Xuehai, TAN Yujing, XUE Yongmei, LUO Yinghua, HUANG Zhibin, CHEN Lu, HAN Yingying

(Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200040, China)

Antibacterial testing methods of textiles have developed greatly in recent years. However, due to the limitations of various technical conditions, the traditional antibacterial testing methods of textiles have also revealed many disadvantages. Thus, it is imperative to explore a new testing method. As a non-traditional antibacterial testing method, ATP method has many advantages, such as convenience, high accuracy and timeliness. It has been widely used in many industrial fields. This article expounds the principle of ATP luminescence and its development course, discusses the superiority and development direction when it is applied in textile antibacterial test. In addition, this article demonstrates the feasibility of ATP luminescence application in textile antibacterial test and gets the conclusion that it has an important research value and practical significance when ATP luminescence method is applied to test the antibacterial and anti-mold property.

ATP luminescence method; textiles; antibacterial and anti-mold; biotechnology; property testing

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.03.005

2016-07-31;

2016-12-30

TS101.4

A

1001-7003(2017)03-0028-05 引用頁碼: 031105