徐文慧，孟 軍，于維浩，趙海麗，王建文，孔麒森，李 海*

（1.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)局，新疆 昭蘇縣 835600；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

抗氧化劑在動(dòng)物精液冷凍保存中作用的研究進(jìn)展

徐文慧1，2，孟 軍2，于維浩1，趙海麗1，王建文2，孔麒森2，李 海1*

（1.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)局，新疆 昭蘇縣 835600；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

近年來，抗氧化劑在動(dòng)物精液冷凍保存技術(shù)中的研究應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，通過添加抗氧化劑降低精子在冷凍保存過程中所遭受的氧化損傷，提高了冷凍精液質(zhì)量和母畜的受胎率。本文從動(dòng)物精子的氧化損傷機(jī)制和常用的抗氧化劑進(jìn)行綜述，期望對(duì)精液冷凍技術(shù)的相關(guān)研究提供理論依據(jù)和參考。

抗氧化劑、冷凍精子、動(dòng)物

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.02.001

隨著動(dòng)物精液低溫保存與冷凍保存技術(shù)的進(jìn)一步提高，凍精人工輸精已在多種動(dòng)物繁育中應(yīng)用，如牛凍精已經(jīng)成為商業(yè)化產(chǎn)品，但也有一些動(dòng)物精液冷凍效果始終不能滿足生產(chǎn)需要，如豬、馬等動(dòng)物。究其原因可能與精液稀釋液、冷凍保護(hù)劑、平衡時(shí)間、冷凍-解凍程序有關(guān)。而前人也在這些方面做了大量的研究過工作，尤其是在抗氧化劑方面，大量研究表明向稀釋液中添加抗氧化劑能夠改善凍融后動(dòng)物精液活力及精子質(zhì)膜完整性。本文主要針對(duì)氨基酸類、維生素類以及其他抗氧化劑進(jìn)行綜述，期望對(duì)動(dòng)物精液冷凍技術(shù)的相關(guān)研究提供理論依據(jù)和參考。

1 精子在冷凍保存中氧化損傷的機(jī)制

在正常的生理?xiàng)l件下，動(dòng)物精子處于氧自由基（ROS）產(chǎn)生與清除相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)下，低濃度的ROS有利于精子獲能，高濃度的ROS則會(huì)引起精子細(xì)胞的氧化應(yīng)激，使精子質(zhì)膜發(fā)生過氧化損傷，降低精子的受精能力。而動(dòng)物精液在離心、平衡、冷凍、解凍等操作過程中不可避免的會(huì)造成精子損傷，產(chǎn)生ROS,使之發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低精子質(zhì)量，導(dǎo)致受胎率受到影響。諸多研究證實(shí)，大量脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生是由ROS引發(fā)精子膜上的PUFA發(fā)生過氧化反應(yīng)，造成精子的質(zhì)膜、頂體完整性出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷[1-3]。精子的頂體是—個(gè)膜性帽狀結(jié)構(gòu)，覆蓋著精子核的前端，含有許多水解酶類。通過頂體反應(yīng)，使精子能夠通過卵外的各層膜并進(jìn)入卵內(nèi)。有研究報(bào)道，造成精子頂體脫離、損傷、內(nèi)含物丟失的原因是冷凍-解凍過程中產(chǎn)生過量的氧自由基，從而使精子與卵子識(shí)別與融合發(fā)生障礙，降低了動(dòng)物受胎率[4]。因此頂體的完整性對(duì)動(dòng)物的受胎率起關(guān)鍵作用。 此外，過多的氧自由基會(huì)導(dǎo)致精子DAN雙鏈斷裂，且DNA堿基對(duì)氧化應(yīng)激敏感，這些結(jié)構(gòu)的過氧化能引起堿基修飾和染色質(zhì)交聯(lián)，造成精子DNA受損，加快生殖細(xì)胞的凋亡速度，從而影響精子的質(zhì)量，導(dǎo)致動(dòng)物受胎率降低[5][6]。

2 抗氧化劑在動(dòng)物精液冷凍保存中的應(yīng)用

正常細(xì)胞主要依靠周圍環(huán)境和胞內(nèi)的抗氧化酶和天然抗氧化劑清除多余活性氧。精子作為一類高度分化的特殊細(xì)胞，極具簡化的細(xì)胞質(zhì)使其喪失了攜帶大量抗氧化劑和自身修復(fù)氧化損傷的能力。因此精子抗氧化途徑主要依靠周圍環(huán)境中的抗氧化物。精子體外保存過程中稀釋液即為其所處的環(huán)境，在稀釋液中添加抗氧化劑對(duì)保護(hù)精子免受氧化損傷至關(guān)重要。

2.1 氨基酸類抗氧化劑

2.1.1 谷氨酰胺

谷氨酰胺是動(dòng)物機(jī)體組織中最豐富的一種游離氨基酸，具有改善機(jī)體代謝、氮平衡、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、增加淋巴細(xì)胞總數(shù)的功能。Mustafa等[7]通過精子活力、活率、SOD及精子脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量等指標(biāo)檢測凍融后羊精子質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)添加濃度為5 mmol/mL的谷氨酰胺，對(duì)羊精子的冷凍保護(hù)效果明顯。同時(shí)在他的另一篇關(guān)于抗氧化劑對(duì)安哥拉山羊精子的保護(hù)作用一文中也得出同樣的結(jié)果：谷氨酰胺在濃度為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L的時(shí)候，對(duì)羊精子的冷凍保護(hù)效果明顯[8]。Maissa等[9]在研究谷氨酰胺對(duì)馬冷凍精子作用機(jī)制中得到:谷氨酰胺在濃度為5 mmol/L升時(shí)，對(duì)馬精子有保護(hù)作用。因此，不同動(dòng)物的精子對(duì)同一種抗氧化劑的濃度要求具有很大的差異。

2.1.2 ?；撬?/p>

牛磺酸（Taurine）是一種廣泛存在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)含量最豐富的自由氨基酸，通過穩(wěn)定電子鏈、抑制活性氧的產(chǎn)生來改善線粒體功能，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)和抑制凋亡的作用。楊建成、劉梅[10]等在研究?；撬釋?duì)大鼠睪丸組織抗氧化影響中得到：通過在飲用水中添加牛磺酸，可明顯提高大鼠特別是老齡大鼠睪丸組織的SOD活性,清除氧自由基，降低對(duì)睪丸組織的損害程度。李方方[11]等在基礎(chǔ)日糧中添加不同量的?；撬?，發(fā)現(xiàn)添加6 g/kg牛磺酸可提高種公豬的性欲、采精量 、精子活力，降低種公豬精漿丙二醛（MDA）含量，而在飼糧中長期添加?；撬峥梢哉{(diào)控種公豬血清激素含量，增加精漿抗氧化能力，進(jìn)而增強(qiáng)種公豬性欲，提高種公豬精液品質(zhì)。Mustafa等[8]發(fā)現(xiàn)添加濃度為25 mmol/L的牛磺酸，可有效提高羊精子活力、活率、SOD含量，降低精子脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量。

2.1.3 半胱氨酸

半胱氨酸是一種具有還原性的含硫氨基酸，具有解毒、溶解角質(zhì)、抗衰老的作用，與甘氨酸、谷氨酸共同組成谷胱甘肽。此外，半胱氨酸是不穩(wěn)定的化合物，容易氧化還原，所以在精液冷凍過程中可以對(duì)精子質(zhì)膜起到保護(hù)作用。程彩虹等[12]研究認(rèn)為添加半胱氨酸對(duì)凍融后羊精子存活數(shù)量和頂體完整性具有保護(hù)和提高作用；而在范楚寧[13]關(guān)于半胱氨酸對(duì)獺兔冷凍精液影響中也得出同樣的結(jié)果。張旭成等[14]發(fā)現(xiàn)在稀釋液中添加半胱氨酸可以提高凍融后精子的活率和頂體完整性，通過膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)MDA濃度顯著降低。B.Khalili.M.[15]研究發(fā)現(xiàn)在羊冷凍精液中添加濃度為5 mmol/L和15 mmol/L的半胱氨酸，以濃度為15 mmol/L保護(hù)精子質(zhì)量最好。

2.2 維生素類抗氧化劑

2.2.1 維生素E

維生素E是有機(jī)體重要的抗氧化劑，又名生育酚。VE具有調(diào)節(jié)性激素分泌的功能，可促進(jìn)性激素分泌，使動(dòng)物精子活力和數(shù)量增加。且由于VE易被氧化，從而有效對(duì)抗自由基，抑制過氧化脂質(zhì)生成，避免精子膜受到氧化損傷[16]。韓鵬，王尚乾[17]等將水溶性VE添加到精液冷凍保護(hù)液中發(fā)現(xiàn)一定濃度的VE可以減少精子凍融過程中產(chǎn)生的過量ROS，降低對(duì)精子質(zhì)膜的氧化應(yīng)激性損傷，提高凍融后的精子質(zhì)量。羅海玲等[18]在綿羊冷凍精液中添加維生素E，凍融后,試驗(yàn)組活率極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），說明一定量的維生素E對(duì)精子的冷凍保護(hù)是有益的。權(quán)富生等[19]在探討在無角道塞特綿羊冷凍精液稀釋液中添加VB12、VE、VC對(duì)精子冷凍品質(zhì)的影響一文中也得出同樣結(jié)果：添加VE后能夠極顯著提高冷凍精子的頂體完整率。A.J.Michael[20]在研究犬冷凍精子時(shí)發(fā)現(xiàn)VE可以顯著提高精子凍后活力。

2.2.2 維生素C

維生素C又稱為抗壞血酸,參與機(jī)體內(nèi)重要物質(zhì)的合成與分解，具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)精子脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可以起到很好的對(duì)抗作用，可有效提高凍后精子品質(zhì)。除此之外，有研究認(rèn)為維生素C具有緩解熱應(yīng)激作用，可以有效防止精子解凍時(shí)和解凍后保存時(shí)因精液溫度變化迅速，而對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷[21]。任俊玲等[22]研究證實(shí)，添加維生素C可以有效提高豬精液凍融后的活力、活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率，而權(quán)富生等[19]研究發(fā)現(xiàn)在冷凍精液中添加4.4 g/L維生素C能夠顯著提高解凍后的羊精子活率（P＜0.05），但對(duì)冷凍后精子的頂體完整率無影響。

2.3 其他抗氧化劑

褪黑素，主要是由哺乳動(dòng)物的松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，可通過清除自由基，抗氧化和抑制脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、防止DNA損傷、降低機(jī)體過氧化物的含量。杜立銀等[23]研究發(fā)現(xiàn)添加1×10-5mol/LMLT可以抑制 ROS誘發(fā)的精子氧化損傷,降低丙二醛含量 ,可有效改善精子運(yùn)動(dòng)性、質(zhì)膜完整性 、頂體完整性和線粒體膜活性;李曉霞等[24]研究發(fā)現(xiàn)在稀釋液中添加10-3mol/LMLT可明顯改善牛精液品質(zhì)，提高牛精液的保存時(shí)間和保存質(zhì)量。李博玲等[25]人認(rèn)為在稀釋液中添加褪黑素可有效提高豬精液凍后質(zhì)量，而以添加0.25 mg/mL效果最好。

3 小結(jié)與展望

動(dòng)物精液冷凍保存可以有效解決因鮮精保存時(shí)間短，地域限制導(dǎo)致推廣困難以及優(yōu)質(zhì)種公畜購置飼養(yǎng)成本過高等問題，就目前來看，牛凍精已經(jīng)全面推廣，在其他動(dòng)物上還處于研究狀態(tài)，其原因在于精子在凍融過程中產(chǎn)生過多的活性氧，并與精子質(zhì)膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而使精子質(zhì)膜受到損傷，降低精子品質(zhì)，因此多年來人們一直嘗試在稀釋液中添加抗氧化劑來清除凍融過程中產(chǎn)生的活性氧，提高精子品質(zhì)，但是研究結(jié)果不盡一致，還需要進(jìn)一步深入研究和分析。此外，在諸多研究中單獨(dú)添加抗氧化劑的研究較多，而聯(lián)合添加較少，尤其是氨基酸類抗氧化劑可以在一定條件下相互轉(zhuǎn)換、分解、合成，這就需要研究者對(duì)這類抗氧化劑進(jìn)行深入了解，才能找到最佳適合冷凍精子的抗氧化劑。

[1]AqarwalA,MakkerK,SharmaR.Clinical relevance of oxi-dative stress in male factor infertility an update. Am J Reprod Immunol,2008,59(1):2-11.

[2]Sanocka D,Kurpisz M.Reactive oxygen species and sperm cells[J].Reprod Biol Endocrinol,2004,2（12）：1-7.

[3]ChiHJ,KimJH,RyuCS,et al.Protective effectofantioxi-dant supplementation in sperm-preparation medium against oxidative stress in human spermatozoa[J].Hum Reprod,2008,23(5):1023-1028.

[4]商學(xué)軍，黃宇烽，熊承良，等.正常精子體外與活性氧作用后超微結(jié)構(gòu)觀察[J].中華男科學(xué)雜志，2002，8（2）：106-108.

[5]Dass den JHG,Jong de G,Lansbergen LM,et a1．Capacitation a regulatory event that primes spermatozoa for the acrosome reaction andfertilization[J]．Molecular Human Reproduction,1997,（3）:175-194.

[6]Rodriguez-MartinezH，Eriksson B，Lundeheim．Freezing boar semen in flat plastic bags[J]．Membrane integrity and fertility[J]．Reproduction Fertility Development,1996,（31）:161-168.

[7]Mustafa,Numan，Bucaka.Comparison of the effects of glutamine and an amino acid solution on post-thawed ram sperm parameters,lipid peroxidation and anti-oxidant activities[J].small Ruminant Research,2009，（81）：13-17.

[8]Mustafa，Numan，Bucaka.Effect of antioxidants on microscopic semen parameters,lipidperoxidation and antioxidant activities in Angora goatsemen following cryopreservation[J].Small Ruminant Research.2009，（81）：90-95.

[9]Maissa，Khlifaoui，Effects of glutamine on post-thaw motility of stallion spermatozoa:an approach of the mechanism of action at spermatozoa level[J].Theriogenology.2007,67(5):1060–1067.

[10]楊建成，劉梅，馮穎，等.?；撬釋?duì)不同年齡大鼠睪丸組織抗氧化能力的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（1）203-205.

[11]李方方，蔣超群，朱宇旌，等.牛磺酸對(duì)種公豬精液品質(zhì)、血清激素含量及精漿抗氧化能力的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2016，28（4）：1122-1128.

[12]程彩虹，岳文斌，任有蛇，等.稀釋液中添加半胱氨酸對(duì)綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響[J].中國草食動(dòng)物，2012，32（1）：12-16.

[13]范楚寧.半胱氨酸對(duì)獺兔精液冷凍保存效果的影響[D].陜西.楊凌：西北農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2015.

[14]張旭成，魏世寶，袁慧敏，等．L-半胱氨酸對(duì)凍融后豬精子質(zhì)量參數(shù)和膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，37(1)：51—53．

[15]Khalili B,M.The Effects of Different Concentrations of Glycine and Cysteine on theFreezability of Moghani Ram Spermatozoa[J].Asian-Aust.2010,23（3）:318-325.

[16]OLLERO M，PEREZ-PER，MUINO－BLANCO T，etal．Improvement of ram sperm cryoprervation proto-cols assessed by sperm quality parameters and hetero-geneity analysis[J].Crybiology,1998,37(1):1-12.

[17]韓鵬，王尚乾，唐敏，等.維生素E對(duì)人精子凍融氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[J].中華男科學(xué)雜志，2014，20（2）：147－151.

[18]羅海玲，賈志海，朱士恩，等.稀釋液中添加維生素E對(duì)綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響[J].中國畜牧雜志，2004,40(11)：7-10.

[19]權(quán)富生，黃欣，馬會(huì)明.添加VBl2、VE、Vc對(duì)無角道塞特綿羊精液冷凍效果的影響[J]，西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19(11)：13-17.

[20]MichaelA J.Effect of antioxidant supplementation in semen extenders on semen quality and reactive oxygen species of chilled canine spermatozoa[J].Theriogenology，2009，112(1-2)：119-135.

[21]姚桂東，陶勇，章孝榮.維生素B12、E和C在家畜精液保存中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27（3）：36-9.

[22]任俊玲.冷凍稀釋液中添加抗氧化劑對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007.

[23]杜立銀，曹少先，郭煒，等.褪黑素在豬精液保存中的抗氧化作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25(2):315-319.

[24]李曉霞，曹平華，禹學(xué)禮，等.添加褪黑素對(duì)牛精液品質(zhì)的影響[J].中國畜牧獸醫(yī) ，2013，40（4）:177-179.

[25]李博玲，馬恒東，王貞．褪黑素、谷胱甘肽對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2011，（7）：26-28.

Research Progress of Anti-oxidants in Cryopreservation of Animal Semen

XU Wen-hui1,2，MENG Jun2，YU Wei-hao2，ZHAO Hai-li1，WANG Jian-wen2，KONG Qi-seng2，LI Hai1*
（1.Zhaosu Bureau of Animal Husbandry,Zhaosu Xinjiang 835602，China；2.College of Animal Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China）

In recent years,the research and application of antioxidants in cryopreservation of animal semen has been paid more and more attention.By adding antioxidants,the oxidative damage of spermatozoa during cryopreservation is reduced,and the quality of frozen semen and the conception rate of females are improved. In this paper,we reviewed the mechanism of oxidative damage in animal spermatozoa and the commonly used antioxidants.Wehopetoprovidethetheoreticalbasisand reference fortheresearch ofsemen cryopreservation.

Antioxidants,frozen sperm,animals

S814

A

1003－6377（2017）02－0001-05

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目“馬細(xì)管精液人工授精技術(shù)的應(yīng)用與推廣”(2014GB2G400154)

徐文慧（1985-），女，甘肅酒泉人，在讀碩士研究生，研究方向：馬繁殖。E-mail:1442582668@qq.com

李海（1980-），男，高級(jí)畜牧師，主要從事草原畜牧業(yè)管理與技術(shù)推廣。E-mail:1479615209@qq.com

2017-01-02，

2017-01-28