王金成, 井明博, 段春燕, 王國(guó)鋒, 石國(guó)璽,4, 周天林

(1.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 慶陽(yáng) 745000; 2.隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,甘肅 慶陽(yáng) 745000; 3.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710062; 4.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所, 青海 西寧810008)

石油烴污染對(duì)隴東黃土高原土壤生物學(xué)及非生物學(xué)特性的影響

王金成1,2, 井明博1,2, 段春燕2, 王國(guó)鋒3, 石國(guó)璽1,2,4, 周天林1,2

(1.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 慶陽(yáng) 745000; 2.隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,甘肅 慶陽(yáng) 745000; 3.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710062; 4.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所, 青海 西寧810008)

[目的] 探索石油污染與土壤生物學(xué)及非生物學(xué)特性間相互關(guān)系,為隴東黃土高原地區(qū)石油污染土壤的綜合治理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和背景資料。[方法] 采用常規(guī)方法測(cè)定甘肅省慶陽(yáng)市5縣，1區(qū)，8個(gè)采油區(qū)油污土壤化性質(zhì)、酶活性和土壤微生物遺傳多樣性。[結(jié)果] 土壤總石油烴含量(TPHs)與堿解氮、速效磷、pH值和脲酶呈負(fù)相關(guān)(p<0.01),與土壤多酚氧化酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶呈正相關(guān)(p<0.01);樣地土壤TPHs含量低的土壤微生物Shannon-Wiener指數(shù)明顯高于TPHs含量高的樣地;NMDS排序結(jié)果顯示,石油污染對(duì)該地區(qū)土壤影響最大的因子為土壤堿解氮和速效磷,其次為TPHs,pH值、脲酶、Shannon-Wiener指數(shù)及過(guò)氧化氫酶。[結(jié)論] 隴東地區(qū)石油烴污染對(duì)土壤環(huán)境因子的影響主要表現(xiàn)在包括氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的有效循環(huán)、土壤脲酶活性和微生物群落多樣性,而對(duì)土壤微生物群落豐富度、均勻度和速效鉀的影響未達(dá)到顯著水平。

隴東黃土高原; 石油烴污染; 土壤理化因子; 微生物群落

文獻(xiàn)參數(shù)： 王金成, 井明博, 段春燕, 等.石油烴污染對(duì)隴東黃土高原土壤生物學(xué)及非生物學(xué)特性的影響[J].水土保持通報(bào)，2017,37(1)：009-016.DOI:10.13961/j.cnki.stbctb.2017.01.002; Wang Jincheng, Jing Mingbo, Duan Chunyan, et al. Impact of crude oil pollution on soil biological and abiological properties in Eastern Gansu Province[J]. Bulletin of Soil and Water Conservation, 2017,37(1)：009-016.DOI:10.13961/j.cnki.stbctb.2017.01.002

自20世紀(jì)70年代長(zhǎng)慶油田公司從隴東地區(qū)誕生并逐漸發(fā)展壯大，目前成為全國(guó)第一大油田，有“西部大慶”之稱。隴東油區(qū)是長(zhǎng)慶油田中心產(chǎn)油區(qū)，境內(nèi)分布14個(gè)油田，63個(gè)開(kāi)發(fā)區(qū)，2 000多口油井，正在建設(shè)成為國(guó)家級(jí)能源化工基地。然而在原油開(kāi)采過(guò)程中已造成隴東地區(qū)石油污染土壤面積達(dá)1.02×104hm2，其北部地區(qū)土壤總石油烴(TPHs)含量高達(dá)55 137±3 076.84 mg/kg[1]。

原油污染土壤生態(tài)修復(fù)已成為環(huán)保領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，而土壤理化環(huán)境因子所組成的非生物學(xué)特性和土壤微生物群落構(gòu)成的生物學(xué)特性是制約石油生物降解速率和修復(fù)效果的關(guān)鍵因素，因而石油污染土壤環(huán)境因子會(huì)直接或間接影響生物修復(fù)技術(shù)的選擇與修復(fù)效應(yīng)的準(zhǔn)確定位[2]。但目前隴東地區(qū)油污土壤相關(guān)研究多集中在修復(fù)效率、修復(fù)方式、降解效果和影響機(jī)制以及修復(fù)過(guò)程中的微生物群落變化等方面[3]，而在干旱少雨、晝夜及四季溫差極大的隴東黃土高原地區(qū)土壤環(huán)境因子對(duì)石油污染如何響應(yīng)則缺乏系統(tǒng)分析和研究，因而在該地區(qū)開(kāi)展生物修復(fù)前對(duì)其土壤理化性質(zhì)及微生物生態(tài)進(jìn)行前期分析顯得尤為重要。

為此，本研究擬以隴東黃土高原地區(qū)甘肅省慶陽(yáng)市5縣1區(qū)8個(gè)采油區(qū)油污土壤為研究對(duì)象，分析上述區(qū)域土壤TPHs，pH值、堿解氮、速效鉀、速效磷、土壤脲酶、脫氫酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶活性以及土壤微生物群落遺傳多樣性等13項(xiàng)環(huán)境因子，基于Bray-Curtis相異指數(shù)，將所測(cè)定的13項(xiàng)土壤環(huán)境因子擬合到8個(gè)石油污染樣地的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上，旨在揭示石油污染與土壤生物學(xué)及非生物學(xué)特性間相互關(guān)系，對(duì)石油污染土壤的綜合治理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和背景資料，亦為隴東黃土高原特定區(qū)域下開(kāi)展石油污染土壤生物修復(fù)打下基礎(chǔ)。

1 研究區(qū)概況

于2012年7—8月采樣，采樣點(diǎn)分布在隴東黃土高原慶陽(yáng)市5縣1區(qū)，由南至北，從西向東共計(jì)8個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的采油區(qū)。采樣點(diǎn)土壤類型為黃綿土、黑爐土和沙土，地理坐標(biāo)地處東經(jīng)107°47′—108°54′，北緯35°65′—36°63′，海拔1 098～1 581 m(表1)。

表1 研究區(qū)域土樣采集地點(diǎn)概況

上述區(qū)域?qū)冱S土高原溝壑地貌，是典型水土流失區(qū)之一，侵蝕面積25 050.5 km2，占全區(qū)總面積的92.4%，侵蝕模數(shù)6 383～9 000 t/hm2。屬暖溫帶半干旱季風(fēng)氣候區(qū)，光、熱等氣候資源豐富，作物種植制度為旱地一年一熟。由于季風(fēng)的強(qiáng)烈影響，冬季寒冷干燥，春季多風(fēng)且干旱少雨，夏季溫暖多雨，水熱同期，年降水量400～600 mm，雨量分布不均，且主要集中在7—9月，多年平均蒸發(fā)量1 000 mm以上，地面蒸發(fā)量為350～560 mm，地下水位深，土壤瘠薄，水土流失嚴(yán)重[3]。

2 研究方法

2.1 土壤樣品采集

為保證研究區(qū)域內(nèi)每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)采樣點(diǎn)代表性，每個(gè)樣地設(shè)3個(gè)采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)均位于各縣境內(nèi)隨機(jī)分布的采油機(jī)附近。利用取土鉆，按對(duì)角線五點(diǎn)取樣法，在每一樣地中采集5—25 cm深度的土壤，將5個(gè)點(diǎn)采集的土壤混勻成1個(gè)土樣，所采土樣放在冷藏箱中，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室根土分離，除利用鮮土提取土壤微生物細(xì)菌基因組總DNA外，其余土樣在室溫背陰處風(fēng)干，過(guò)2 mm篩備用[3]。

2.2 土壤酶活性、理化性質(zhì)及土壤微生物群落遺傳多樣性測(cè)定

過(guò)氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法，脲酶和多酚氧化酶采用7230G分光光度計(jì)比色法[4]；脫氫酶采用唐景春等的分析方法[5]。土壤堿解氮采用堿解擴(kuò)散法；土壤速效磷、速效鉀分別采用0.5 mol/LNaHCO3浸提—鉬銻抗比色法和火焰光度計(jì)法[6]；電位法(pHS-3酸度計(jì))測(cè)定土樣pH值；采用超聲—索氏萃取—重量法測(cè)定土壤中總石油烴含量[7]；采用變性凝膠梯度電泳(DGGE)技術(shù)分析微生物群落遺傳多樣性[3]。

2.3 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算

利用SPSS 16.0和R2.15.2(http:∥www.r-project.org/)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，用Origin 8.0和R 2.15.2作圖。

為了闡述石油污染樣地與土壤環(huán)境因子間關(guān)系，基于Bray-Curtis相異指數(shù)，使用R語(yǔ)言“vegan”程序包中“envfit”程序，將所測(cè)定的13項(xiàng)土壤環(huán)境因子擬合到8個(gè)石油污染樣地的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上，為防止樣點(diǎn)在各象限的分布發(fā)生移位，在擬合時(shí)對(duì)NMDS的排序軸進(jìn)行了旋轉(zhuǎn)，以確保NMDS第一軸能夠最大程度地代表群落相異性的變異。8個(gè)石油污染樣地矩陣及環(huán)境因子數(shù)據(jù)集分別用Bray-Curtis與Euclidean距離表示[8]。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同污染樣地土壤理化性質(zhì)變化情況

表2為不同污染樣地土壤理化性質(zhì)、土壤TPHs含量、速效鉀、堿解氮、速效磷、pH值和海拔在各樣地間差異均達(dá)極顯著水平(FTPHs=112.398>F0.01，F(xiàn)速效鉀=24.956>F0.01，F(xiàn)堿解氮=50.159>F0.01，F(xiàn)速效磷=49.493>F0.01，F(xiàn)pH=38.132>F0.01，F(xiàn)海拔=54.02>F0.01，p<0.01)。

不同樣地間土壤TPHs含量的高低所引起的理化環(huán)境因子的變化不盡相同(p<0.05)，進(jìn)一步對(duì)不同污染土樣的土壤TPHs含量與其他環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，土壤TPHs含量與土壤pH、堿解氮和速效磷含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)(表2)，而與速效鉀和樣地海拔間無(wú)顯著相關(guān)，說(shuō)明土壤TPHs的增加可能是制約隴東地區(qū)油污土壤氮、磷元素有效化的主要因素。

表2 研究區(qū)不同污染樣地土壤化學(xué)性質(zhì)的變化

注:TPHs為土壤總石油烴含量； 數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 每組同列的不同字母表示差異顯著性；小寫字母為5%顯著水平。下同。

3.2 不同污染樣地土壤酶活性變化情況

表3為不同污染樣地土壤酶活性變化情況。不同樣地間土壤脫氫酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶和脲酶差異極顯著(F脫氫酶=173.512>F0.01，F(xiàn)多酚氧化酶=89.104>F0.01，F(xiàn)過(guò)氧化氫酶=111.041>F0.01，F(xiàn)脲酶=50.023>F0.01，p<0.01)。與土壤TPHs含量相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，除與土壤脲酶呈負(fù)相關(guān)外，土壤TPHs與土壤多酚氧化酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶均呈正相關(guān)關(guān)系(表3)，說(shuō)明土壤TPHs可增加土壤中脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶的活性，參與TPHs降解。而參與土壤養(yǎng)分有效化的脲酶活性與土壤TPHs呈負(fù)相關(guān)說(shuō)明隴東地區(qū)石油污染土壤養(yǎng)分有效化水平低下，這一結(jié)果亦可解釋土壤理化性質(zhì)中堿解氮和速效磷含量低下的原因。

表3 研究區(qū)不同污染樣地土壤酶活性的變化

3.3 不同污染樣地土壤微生物群落遺傳多樣性變化情況

本文采用變性凝膠梯度電泳(DGGE)技術(shù)分析微生物群落遺傳多樣性，利用3種多樣性指標(biāo)進(jìn)行土壤微生物群落遺傳多樣性分析，即Patrick 豐富度指數(shù)(S)：S=物種數(shù)，即條帶數(shù)；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)：H=-ΣPilnPi，Pi代表土壤樣品中第i個(gè)條帶的吸光度占所有條帶吸光度總和的比例；Pielou 均勻度指數(shù)(J)：J=H/Hmax，Hmax代表最大多樣性值(Hmax=lnS)[3]。圖1為不同樣地油污土壤PCR-DGGE指紋圖譜及其圖譜聚類結(jié)果。圖譜上條帶信息反映了土壤微生物群落多樣性變化情況，其中電泳條帶的多少反映出土壤中細(xì)菌群落多樣性；條帶的粗細(xì)則反映了種群密度的差異。

圖2反映了不同樣地油污土壤樣品微生物群落遺傳多樣性指數(shù)變化情況。F檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3種多樣性指數(shù)在各樣地間差異均達(dá)極顯著水平(FH=25.018>F0.01，F(xiàn)J=16.121>F0.01，F(xiàn)S=16.121>F0.01，p<0.01)，上述結(jié)果體現(xiàn)了TPHs對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。多重比較(Duncan，α=0.05)結(jié)果顯示，不同樣地間土壤TPHs含量的高低所引起的土壤微生物群落遺傳多樣性的變化不盡相同(p<0.05)。

由圖2可見(jiàn)，土壤TPHs含量介于7 995.61～8 992.74 mg/kg樣地Shannon-Wiener指數(shù)(HYCZ=2.79±0.01，HCHX=2.77±0.02，HGCX=2.88±0.01，HTZZ=2.75±0.03)高于土壤TPHs含量介于17 139.95至22 348.03 mg/kg的樣地(HFJCX=2.62±0.01，HDZZ=2.59±0.02，HTCX=2.52±0.02，HQZZ=2.55±0.01)(p<0.05)。Patrick指數(shù)方面，除樣地DZZ以外，其余樣地均表現(xiàn)出與Shannon-Wiener指數(shù)相似的變化趨勢(shì)，即Shannon-Wiener指數(shù)越高，物種條帶數(shù)越多。此外，各樣地間Pielou 均勻度指數(shù)偏低，說(shuō)明TPHs污染造成土壤微生物群落分布不均。

圖1 研究區(qū)不同樣地油污土壤PCR-DGGE 指紋圖譜及其圖譜聚類

3.4 不同污染樣地與其環(huán)境因子的非度量多維尺度(NMDS)排序

為了闡述石油污染樣地與土壤環(huán)境因子間關(guān)系，以及環(huán)境因子在驅(qū)動(dòng)不同樣地分異過(guò)程中的相對(duì)重要性，基于Bray-Curtis相異指數(shù)，將所測(cè)定的13項(xiàng)土壤環(huán)境因子擬合到8個(gè)石油污染樣地的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上，脅強(qiáng)系數(shù)Stress=0.134 3，說(shuō)明該二維NMDS分析具有一定的擬合效果，可解釋樣地環(huán)境因子信息量的86.57%。

圖2 研究區(qū)不同樣地油污土壤樣品微生物群落遺傳多樣性指數(shù)變化

由圖3及表4可見(jiàn)，基于Bray-Curtis相異性指數(shù)，本研究所調(diào)查的8個(gè)樣地在NMDS排序圖上較為分散，說(shuō)明8個(gè)樣地相似性較低，即樣地間存在顯著差異，表現(xiàn)為8個(gè)樣地在NMDS排序圖分異為8個(gè)點(diǎn)集，相對(duì)而言樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ之間相似性較高，位于慶陽(yáng)市中部的樣地DZZ和TCX與其他樣地差異較大，而位于北部環(huán)縣境內(nèi)的樣地FJCX和QZZ呈現(xiàn)較高的相似性(圖3，表4)。13個(gè)環(huán)境因子變量擬合至NMDS排序圖的結(jié)果顯示，其中有9個(gè)環(huán)境變量與樣地NMDS排序結(jié)果顯著相關(guān)。

注：排序圖上顯示了與各樣地分異有關(guān)的土壤環(huán)境因子，橢圓代表平行樣品間的標(biāo)準(zhǔn)差。圖3 研究區(qū)不同污染樣地的非度量多維尺度(NMDS)排序

環(huán)境因子r2p值TPHs0.54480.002**速效鉀0.24740.058堿解氮0.65150.001***速效磷0.60230.001***pH值0.52210.002**脫氫酶0.31480.029*多酚氧化酶0.34070.026*過(guò)氧化氫酶0.40250.003**脲酶0.51130.005**海拔高度0.20950.085Shannon-Wiener多樣性指數(shù)0.41540.002**物種數(shù)0.20830.064Pielou均勻度指數(shù)0.19690.091

注:*代表與各樣地分異相關(guān)的土壤環(huán)境因子顯著水平：***表示p<0.001，**表示p<0.01，*表示p<0.05時(shí)相關(guān)性顯著。

由圖3可見(jiàn)樣地在NMDS排序圖上的分異主要與土壤理化因子中的堿解氮含量(r2=0.651 5,p=0.001)，速效磷(r2=0.602 3,p=0.001)，土壤TPHs含量(r2=0.544 8,p=0.002)及土壤pH(r2=0.522 1,p=0.002)顯著相關(guān)，其中堿解氮和速效磷含量是導(dǎo)致樣地分異的主要環(huán)境因子；土壤酶活性方面，與過(guò)氧化氫酶(r2=0.402 5,p=0.003)，脲酶(r2=5 113,p=0.005)，多酚氧化酶(r2=0.340 7,p=0.003)以及脫氫酶(r2=0.314 8,p=0.003)顯著相關(guān)，其中過(guò)氧化氫酶和脲酶在樣地分異過(guò)程中起主要作用；就土壤生物學(xué)特性而言，3個(gè)土壤微生物群落遺傳多樣性指數(shù)中只有Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)與樣地分異有關(guān)(r2=0.415 4,p=0.002)。上述結(jié)果說(shuō)明，隴東黃土高原地區(qū)受石油污染影響最大的環(huán)境因子為土壤堿解氮和速效磷，其次為土壤TPHs，pH值、脲酶、微生物群落多樣性和過(guò)氧化氫酶，而速效鉀、海拔、微生物群落豐富度(S)與均勻度(J)所受影響較小。

4 討論與結(jié)論

4.1 石油烴污染對(duì)隴東黃土高原土壤非生物學(xué)特性的影響

由土壤理化性質(zhì)及酶活性所構(gòu)成的非生物學(xué)環(huán)境因子是生物地球化學(xué)循環(huán)的主要參與者，可反映土壤環(huán)境狀況[2]，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量及其污染程度的重要指示。本文對(duì)隴東黃土高原地區(qū)慶陽(yáng)市境內(nèi)5縣1區(qū)石油污染土壤非生物學(xué)環(huán)境因子的分析結(jié)果顯示不同濃度TPHs所引起的土壤理化及酶活性變化不盡相同。相關(guān)性分析結(jié)果顯示土壤TPHs含量與土壤pH值、堿解氮和速效磷含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)(表3)，與土壤速效鉀及樣地海拔間無(wú)顯著性相關(guān)。前人研究指出石油污染土壤的氮素匱乏為微生物提供了選擇優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而引起石油污染土壤中堿解氮含量升高，而王傳遠(yuǎn)等[2]研究認(rèn)為石油污染可降低土壤pH值，但與堿解氮含量無(wú)顯著相關(guān)。劉五星等[9]對(duì)南京某煉油廠的油污土壤進(jìn)行理化性質(zhì)分析后指出石油污染對(duì)土壤的速效氮、磷、鉀含量無(wú)顯著影響。上述結(jié)果與本研究結(jié)果不盡相同，說(shuō)明土壤TPHs對(duì)隴東黃土高原地區(qū)土壤理化性質(zhì)的影響具有明顯的獨(dú)特性和地域性。究其原因可能是由于長(zhǎng)慶油田隴東產(chǎn)油區(qū)原油微量元素相對(duì)較低，而該地區(qū)土壤本身缺磷、少氮、多鉀，因而石油烴污染土壤后導(dǎo)致外源碳源增加[10]，打破了隴東黃土高原土壤原有營(yíng)養(yǎng)水平比例，進(jìn)而改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，引起土著石油降解菌的大量生長(zhǎng)，而這些土著石油降解菌在生長(zhǎng)的同時(shí)大量消耗了土壤中原有的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)而造成土壤氮、磷含量嚴(yán)重不足；其次，本研究結(jié)果顯示土壤TPHs與土壤脲酶活性與呈負(fù)相關(guān)(表3)，而脲酶可加速土壤養(yǎng)分有效化[11]，因此土壤脲酶活性低下可能是隴東黃土高原地區(qū)堿解氮和速效磷含量低下的又一原因，而該地區(qū)油污土壤速效鉀含量在不同樣地間高低不一的原因有待進(jìn)一步分析研究；第三，前人研究指出石油烴污染濃度也是影響土壤營(yíng)養(yǎng)水平有效化的又一因素，張曉陽(yáng)等[12]對(duì)陜北石油污染對(duì)土壤理化性質(zhì)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤TPHs超過(guò)5 000 mg/kg時(shí)，土壤營(yíng)養(yǎng)水平有效化顯著降低，而本研究8各樣地土壤TPHs含量介于7 795.61～22 348.03 mg/kg(表1)，加之該地區(qū)土壤本身營(yíng)養(yǎng)元素水平特征，說(shuō)明重度污染時(shí)土壤速效養(yǎng)分水平低下。

在土壤TPHs降解過(guò)程中氧化還原酶系占有重要地位，對(duì)土壤氧化還原酶的研究多集中在土壤脫氫酶、過(guò)氧化氫酶和多酚氧化酶。李慧等[13]通過(guò)對(duì)沈撫灌區(qū)含油污水灌溉對(duì)土壤酶活性的影響中發(fā)現(xiàn)，灌溉含石油烴的污水能增加上述3種酶活性，且隨著污染程度的增加而增加。朱凡等[14]在利用植物修復(fù)PAHs污染土壤過(guò)程發(fā)現(xiàn)，土壤過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶活性隨著修復(fù)時(shí)間增加呈先升后降的趨勢(shì)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除與土壤脲酶呈負(fù)相關(guān)外，土壤TPHs與土壤多酚氧化酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶均呈正相關(guān)關(guān)系(表4)，說(shuō)明土壤TPHs可提高上述3種酶活性進(jìn)而加速TPHs降解，這與眾多學(xué)者研究結(jié)果較為一致，土壤TPHs對(duì)隴東黃土高原地區(qū)土壤酶活性的影響沒(méi)有明顯的地域性。本研究中，相對(duì)于正在采油作業(yè)的樣地FJCX，DZZ，TCX和QZZ，樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ均已停止采油廢棄2～4 a，且樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ的TPHs含量明顯低于在采油作業(yè)的樣地，生態(tài)毒性相對(duì)較弱，使得TPHs的自然降解使得土壤微生物群落多樣性和數(shù)量趨于穩(wěn)定，而隴東黃土高原地區(qū)降雨量極低，加之TPHs在土壤遷移和擴(kuò)散程度相對(duì)緩慢[15]，造成石油降解菌富集的局域微環(huán)境中土壤TPHs含量明顯降低，因而樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ土壤脫氫酶活性相對(duì)偏低。過(guò)氧化氫酶活性可以反映土壤除去呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的能力，若過(guò)氧化氫持續(xù)積累且無(wú)法有效分解將會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生不利影響。由表4可見(jiàn)，土壤TPHs含量的增加有助于當(dāng)?shù)剡m生土著石油降解菌生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而引起其群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變，加速了土壤TPHs降解，而在生物降解過(guò)程中過(guò)氧化氫的積累使得微生物及土壤生境擴(kuò)大，解除了由于呼吸作用而產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，進(jìn)而使得過(guò)氧化氫酶活性得到提升[16]。因此，隴東黃土高原地區(qū)開(kāi)展石油烴污染生態(tài)修復(fù)首先應(yīng)外援添加相應(yīng)的N，P營(yíng)養(yǎng)元素加快對(duì)石油烴的分解，其次如何提高土壤脲酶活性，提升營(yíng)養(yǎng)元素有效化程度是決定該地區(qū)修復(fù)效果的關(guān)鍵因素。

4.2 石油烴污染對(duì)隴東黃土高原土壤生物學(xué)特性的影響

微生物種群結(jié)構(gòu)與多樣性都是表征生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，其對(duì)環(huán)境污染物的反應(yīng)表現(xiàn)為多種形式。TPHs進(jìn)入土壤后對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響首先表現(xiàn)為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成、數(shù)量及多樣性的改變。通常認(rèn)為石油污染導(dǎo)致土壤中微生物多樣性降低，而劉五星等[9]對(duì)南京某煉油廠石油污染土壤微生物群落遺傳多樣性分析后指出，土壤TPHs與微生物群落多樣性及均勻度指數(shù)多樣性呈正相關(guān)關(guān)系；姜睿玲等[15]研究了土壤PAHs對(duì)桑園土壤微生物群落遺傳多樣性的影響，結(jié)果顯示低濃度PAHs對(duì)土壤微生物多樣性及豐富度指數(shù)具有刺激作用，而高濃度污染時(shí)可明顯抑制土壤微生物多樣性及豐富度指數(shù)。Li等[17]研究指出水稻土中石油污染濃度與細(xì)菌多樣性正相關(guān)。本研究中土壤TPHs含量介于7 995.61～8 992.74 mg/kg樣地(YCZ，CHX，GCX和TZZ)土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)明顯高于土壤TPHs含量介于17 139.95～22 348.03 mg/kg的樣地(FJCX，DZZ，TCX和QZZ)。Patrick指數(shù)方面，除樣地DZZ以外，其余樣地均表現(xiàn)出與Shannon-Wiener指數(shù)相似的變化趨勢(shì)，即Shannon-Wiener指數(shù)越高，物種條帶數(shù)越多(圖1)。此外，各樣地間Pielou 均勻度指數(shù)偏低，說(shuō)明TPHs污染造成了土壤微生物群落分布不均。上述試驗(yàn)結(jié)果與本研究結(jié)果不盡相同，究其原因除土壤質(zhì)地和污染程度不同外，亦可能是土壤TPHs污染對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，且樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ均已廢棄，因而TPHs在長(zhǎng)期自然降解過(guò)程中生態(tài)毒性相對(duì)減弱，土壤微生物逐漸適應(yīng)該種生態(tài)條件，驅(qū)使其群落多樣性和數(shù)量趨于穩(wěn)定，因而微生物群落種類和數(shù)量相對(duì)較高，表現(xiàn)為Patrick豐富度指數(shù)高于樣地FJCX，DZZ，TCX和QZZ。其次，新開(kāi)采油井中，土壤TPHs污染對(duì)土壤環(huán)境因子的改變強(qiáng)化了生態(tài)選擇，進(jìn)而改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，引起多數(shù)微生物種類及數(shù)量上的下降和分布不均，但這種變化可能會(huì)隨著石油烴自然降解過(guò)程的進(jìn)行而逐漸緩解[18]；第三，隴東黃土高原地區(qū)生態(tài)脆弱，南低北高，氣候干旱少雨，寒暑溫差顯著，土壤瘠薄造就了該地區(qū)土壤環(huán)境因子地域性變化，進(jìn)而也造成了TPHs在土壤遷移和擴(kuò)散程度不同，各樣地間Pielou 均勻度指數(shù)總體偏低。因此，隴東地區(qū)石油烴污染生物修復(fù)過(guò)程中應(yīng)外援投加“適生”的土著石油降解菌群，強(qiáng)化土著降解菌在該地區(qū)油污土壤生態(tài)位亦為影響修復(fù)效果的關(guān)鍵因素。

4.3 石油烴污染對(duì)隴東黃土高原土壤因子的影響

基于上述土壤環(huán)境因子測(cè)定結(jié)果，以Bray-Curtis相異性指數(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建隴東黃土高原地區(qū)石油污染樣地間相似性矩陣，即土壤環(huán)境因子相似程度高，其樣地排序距離就小，采用NMDS方法分析該地區(qū)石油污染后土壤環(huán)境因子驅(qū)動(dòng)樣地分異的影響機(jī)制。結(jié)果表明(圖3)，樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ之間相似性較高，位于慶陽(yáng)市中部的樣地DZZ和TCX與其他樣地差異較大，而位于北部環(huán)縣境內(nèi)的樣地FJCX和QZZ呈現(xiàn)較高的相似性。不難看出樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ均為易廢棄2～4 a油井，而這4各樣地相似性高可能是由于廢棄后土著降解菌自然降解后土壤環(huán)境因子趨同所致；而樣地DZZ和TCX均位于慶陽(yáng)市中部，且均為正在采油作業(yè)油井；環(huán)縣境內(nèi)的樣地FJCX和QZZ亦為采油作業(yè)1 a的新油井。根據(jù)NMDS排序結(jié)果看，雖然這4個(gè)樣地均為正在采油作業(yè)的新油井但卻劃分為2個(gè)板塊，說(shuō)明造成這一結(jié)果的原因必然與土壤環(huán)境因子有關(guān)。為了闡述石油污染樣地與土壤環(huán)境因子間關(guān)系，使用R語(yǔ)言“vegan”程序包中“envfit”程序，將所測(cè)定的13項(xiàng)土壤環(huán)境因子擬合到8個(gè)石油污染樣地的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上(圖3)，環(huán)境因子數(shù)據(jù)用Euclidean距離表示[8]。首先樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ之間相似性較高主要與土壤環(huán)境因子中的土壤堿解氮含量(r2=0.651 5,p=0.001)，速效磷(r2=0.602 3,p=0.001)，土壤脲酶活性(r2=0.511 3,p=0.005)，脫氫酶活性(r2=0.314 8,p=0.029)，土壤pH值(r2=0.522 1,p=0.002)及土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)(H)(r2=0.415 4,p=0.002)有關(guān)，其中堿解氮和速效磷含量是造成上述樣地相似性高的最主要環(huán)境因子。然而樣地YCZ，CHX，GCX和TZZ之間相較之下，樣地CHX和GCX間與樣地YCZ和TZZ之間排序距離更小，究其原因，由圖3可見(jiàn)，決定樣地CHX和GCX相似性更高的原因與土壤堿解氮，速效磷和土壤脲酶活性有關(guān)，說(shuō)明樣地CHX和GCX的土壤脲酶提高了土壤營(yíng)養(yǎng)元素的有效化水平，進(jìn)而以較高的土壤堿解氮和速效磷含量使得樣地CHX和GCX不同于其他樣地。而樣地YCZ和TZZ方面，決定這2個(gè)相似性更高的原因與土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)(H)，pH值和土壤脫氫酶活性有關(guān)，其中土壤pH值最為相關(guān)(r2=0.522 1,p=0.002)。微生物總數(shù)與土壤脫氫酶活性成正相關(guān)關(guān)系，其活性高低可以反映微生物量對(duì)有機(jī)物的降解效果[16]。本研究結(jié)果與此一致，決定樣地YCZ和TZZ不同于其他樣地的環(huán)境因子主要包括土壤脫氫酶活性和微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)(H)以及pH值，說(shuō)明在自然降解過(guò)程中這2個(gè)樣地的土壤微生物群落遺傳多樣性較為相似，且與土壤脫氫酶活性呈正相關(guān)關(guān)系；而影響土壤微生物群落遺傳多樣性的環(huán)境因子中土壤pH值與之相關(guān)，前人研究指出認(rèn)為石油污泥的pH值呈堿性，超過(guò)了微生物生長(zhǎng)的最適范圍，進(jìn)而對(duì)土壤微生物的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用。土壤pH值可能會(huì)通過(guò)影響降解過(guò)程中關(guān)鍵酶的酶活性來(lái)影響降解率，說(shuō)明土壤pH值的改變有助于自然降解過(guò)程中土著石油降解菌的生長(zhǎng)繁殖，樣地YCZ和TZZ土壤TPHs自然降解進(jìn)程優(yōu)于其他樣地。

就正在采油作業(yè)油井樣地FJCX和QZZ與DZZ和TCX而言，決定慶陽(yáng)市中部的樣地DZZ和TCX相似性更高的原因與土壤過(guò)氧化氫酶(r2=0.402 5,p=0.003)與多酚氧化酶活性(r2=0.340 7,p=0.026)有關(guān)，相較之下過(guò)氧化氫酶活性最為相關(guān)，而這兩種酶均參與石油烴及其代謝中間產(chǎn)物在土壤中的降解過(guò)程，特別是多酚氧化酶能把土壤中芳香族化合物和酚類氧化成分子量不等的有機(jī)質(zhì)和色素，完成土壤芳香族化合物的循環(huán)[19]。而該樣地開(kāi)采期均為2 a，石油烴污染后強(qiáng)化了對(duì)該樣地土壤微生物種群的選擇，有助于石油降解菌群的生長(zhǎng)繁殖，刺激石油降解菌產(chǎn)生多酚氧化酶。石油降解菌群的大量繁殖加強(qiáng)對(duì)該樣地石油烴TPHs的生物降解，而降解過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫產(chǎn)生使得土壤石油降解菌生境逐漸擴(kuò)大，因此慶陽(yáng)市中部的樣地DZZ和TCX不同于其北部環(huán)縣境內(nèi)的樣地FJCX和QZZ。圖3中與環(huán)縣境內(nèi)的樣地FJCX和QZZ相似性較高有關(guān)的土壤環(huán)境因子只有土壤TPHs(r2=0.544 8,p=0.002)，說(shuō)明土壤石油烴含量是決定該樣地不同于其他樣地的環(huán)境因子?？v觀上述結(jié)果，影響隴東黃土高原地區(qū)石油污染土壤的環(huán)境因子中，雖然土壤微生物群落豐富度(S)(r2=0.208 3，p=0.064)、均勻度(J)(r2=0.196 9，p=0.091)、速效鉀含量(r2=0.247 4，p=0.058)和海拔(r2=0.209 5，p=0.085)并未達(dá)到顯著水平，但慶陽(yáng)市南低北高的地理特點(diǎn)和降雨量不均及晝夜溫差大等因素在本次研究中并未涉及，而上述環(huán)境因子可能是解釋環(huán)縣境內(nèi)樣地FJCX和QZZ不同于慶陽(yáng)市中部的樣地DZZ和TCX的原因，而這些環(huán)境因素對(duì)隴東地區(qū)石油污染土壤的影響有待后續(xù)分析研究。

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Impact of Crude Oil Pollution on Soil Biological and Abiological Properties in Eastern Gansu Province

WANG Jincheng1,2, JING Mingbo1,2, DUAN Chunyan2, WANG Guofeng3, SHI Guoxi1,2,4, ZHOU Tianlin1,2

(1.ProvincialKeyUniversityLaboratoryforProtectionandUtilizationofLongdongBioresourcesinGansuProvince,Qingyang,Gansu, 745000,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,LongdongUniversity,Qingyang,Gansu, 745000,China; 3.CollegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China; 4.ChineseAcademyofSciences,NorthwestInstituteofPlateauBiology,Xining,Qinghai810008,China)

[Objective] The objective of this study is to explain relationship between soil biology and abiological characteristics on crude-oil contaminated soil and provide basic data and background information for its comprehensive remediation in eastern Gansu Province. [Methods] The changes of soil physical and chemical properties as well as enzyme activities in crude oil-contaminated soil in Qingyang City of Gansu Province were investigated using the conventional methods, and the genetic diversity of microbial community was analyzed based on PCR-DGGE. [Results] The contents of soil available N, available P, pH value and activity of soil urease decreased with the increase of soil TPHs concentration respectively(p<0.01), while the activities of soil polyphenoloxidase, dehydrogenase and catalase had a significant positive correlation with soil TPHs concentration respectively(p<0.01). As for the genetic diversity of soil microbial communities, Shannon-Wiener index in the studied sites with lower TPHs concentration was significantly higher than that of the sites with higher TPHs concentration(p<0.05). Moreover, nonmetric multidimensional scaling(NMDS) showed that petroleum-contaminated soil in Gansu Province were strongly affected by soil available N and available P, and following-affected by soil TPHs concentration, pH value, urease activity, Shannon-Wiener index of soil microbial communities and activity of soil catalase.[Conclusion] Impact of crude oil pollution on soil environmental factors in Eastern Gansu Province of Loess Plateau was mainly reflected by the nutrients effective circulation of nitrogen and phosphorus as well as soil microbial-communities diversity and soil urease activity, but there were no significant impact on available K, richness and evenness of soil microbial communities.

Eastern Gansu Province of Loess Plateau; crude oil pollution; soil environmental factors; microbial community

2016-06-21

2016-09-20

甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“隴東黃土高原地區(qū)石油污染土壤原位修復(fù)技術(shù)研究與示范”(1204FKCM173); 甘肅省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目“隴東黃土高原石油污染土壤微生物群落動(dòng)態(tài)分析及石油降解菌的篩選”(2014B-091); 國(guó)家自然科學(xué)資助項(xiàng)目(31500427); 甘肅省慶陽(yáng)市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(GC2011-16); 隴東學(xué)院青年科技創(chuàng)新項(xiàng)目(XYZK1603)

王金成(1985—),男(漢族),甘肅省兩當(dāng)縣人,碩士,講師,主要從事環(huán)境微生物學(xué)及分子微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究工作。E-mail:ldxywjc@163.com。

周天林(1961—),男(漢族),甘肅省寧縣人,大學(xué)本科,教授,主要從事土壤生態(tài)學(xué)研究工作。E-mail:wensent20002 002@163.com。

A

1000-288X(2017)01-0009-08

X53， X172