傅靖+張寶+劉紅燕+李明杰+古力+李娟+王豐青+張重義

[摘要] 該文闡述了植物化感作用的概念、特征及其與其連作障礙危害形成間的關(guān)系，并結(jié)合課題組前期的研究成果，指出精準(zhǔn)鑒別化感物質(zhì)并驗(yàn)證其生態(tài)功能是破解植物連作障礙問(wèn)題的關(guān)鍵。同時(shí)，針對(duì)化感物質(zhì)分離鑒定中的難題，借鑒中藥藥效物質(zhì)的研究方法，運(yùn)用目標(biāo)成分“敲出/敲入”的中藥藥效物質(zhì)辨識(shí)與質(zhì)量控制模式，提出了分離鑒定植物化感物質(zhì)（群）的新思路和新方法。旨在為深化植物化感作用研究和消減中藥材生產(chǎn)中連作障礙問(wèn)題提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

[關(guān)鍵詞] 中藥材； 連作障礙； 化感物質(zhì)篩選； 藥效辨識(shí)模式

[Abstract] This paper clarified in detail the definition， characteristics of allelopathy and its association with consecutive monoculture problem.Most of studies have indicated that it is critical to parse the formation mechanisms of consecutive monoculture problem that identification of allelochemicals and verification of its function. Here， we proposed a new approach to separate and identify the allelochemical group precisely and effectively， in which the "knock-out/in" methods of targeting ingredients in the model of medicinal effect identification and quality control were applied. This method will contribute to deep understanding plant allelopathy， and provide theoretical basis and technical support for alleviating consecutive monoculture problems simultaneously.

[Key words] Chinese medicinal material； consecutive monoculture problem； screening of allelochemicals； identification model of target components

化感作用（allelopathy）源于希臘語(yǔ)“Allelon（相互）和“elona（忍受痛苦）”。1984年Rice[1]在《Allelopathy》第2版中對(duì)其概念進(jìn)行了補(bǔ)充和完善，化感作用即植物或微生物的代謝分泌物對(duì)環(huán)境中其他植物或微生物的有利或不利的作用，而對(duì)應(yīng)的代謝分泌物我們稱之為化感物質(zhì)，化感作用正是通過(guò)化感物質(zhì)的化學(xué)生態(tài)學(xué)行為而呈現(xiàn)出來(lái)的。眾所周知，探討環(huán)境與生物之間的相互作用是生態(tài)學(xué)研究的核心，更是化學(xué)生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，旨在揭示化學(xué)物質(zhì)在有機(jī)體種內(nèi)或種間以及與環(huán)境之間的媒介作用及其作用規(guī)律。因此，對(duì)化感物質(zhì)的認(rèn)識(shí)及研究有助于闡明生物體與周圍復(fù)雜環(huán)境（尤其是生物環(huán)境）之間的深層關(guān)系。但是由于化感物質(zhì)的交互作用、劑量效應(yīng)等，使得化感物質(zhì)的分離和鑒定成為研究化感作用無(wú)法回避的科學(xué)問(wèn)題[2]。本文提出了基于目標(biāo)成分“敲出”的藥效辨識(shí)模式的方法用以篩選植物化感物質(zhì)，為探明化感物質(zhì)在植物有機(jī)體種內(nèi)或種間的媒介作用奠定基礎(chǔ)并提供科學(xué)依據(jù)。

1 化感物質(zhì)篩選是破解中藥材生產(chǎn)中連作障礙難題的關(guān)鍵

1.1 中藥材生產(chǎn)中連作障礙的現(xiàn)狀 連作障礙（consecutive monoculture problem）或稱重茬問(wèn)題（replant problem & replant disease），是指在正常的管理措施下，同一塊地連續(xù)多年種植相同作物造成作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣、生育狀況變差、病蟲害頻發(fā)的現(xiàn)象[3]。這一問(wèn)題廣泛存在于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，而中藥材生產(chǎn)中表現(xiàn)尤為突出。據(jù)統(tǒng)計(jì)約占70%以上的根部（或根）入藥的藥用植物都存在不同程度的連作障礙，如連作地黃表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)不良，塊根不能正常膨大，產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，甚至絕收，而且每茬收獲后須隔8～10年后方可再種[3]，人參、西洋參、三七和當(dāng)歸等連作障礙問(wèn)題同樣突出[4-6]。 因此，連作障礙問(wèn)題研究業(yè)已成為當(dāng)今中藥農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性課題，也是當(dāng)前藥用植物資源生態(tài)學(xué)亟待解決的重要內(nèi)容，成為國(guó)內(nèi)外同行研究的熱點(diǎn)[7，11-13]。

1.2 化感物質(zhì)的介導(dǎo)是藥用植物連作障礙形成的主要原因 前期研究表明，中藥材生產(chǎn)中的連作障礙問(wèn)題其成因極其復(fù)雜，它涉及土壤理化性質(zhì)改變、植物體養(yǎng)分吸收受阻、根際微生物群落結(jié)構(gòu)失衡以及植物化感毒害作用等多個(gè)方面[7-10]?？傊B作條件下各因素間協(xié)同互作造成的根際微生態(tài)環(huán)境惡化是植物連作障礙形成的重要原因。而越來(lái)越多的研究提示化感物質(zhì)可能是造成植物毒害及土壤微生態(tài)環(huán)境惡化的“元兇”[14-22]。

化感物質(zhì)（allelochemicals）是指植物所產(chǎn)生的影響其他生物生長(zhǎng)、行為和種群生物學(xué)的化學(xué)物質(zhì)，不僅包括植物間的化學(xué)作用物，也包括植物和動(dòng)物間的化學(xué)作用物[23]。它主要通過(guò)植物地上部分的淋洗和揮發(fā)、根的分泌以及植物殘?bào)w的分解等途徑向生態(tài)系統(tǒng)中釋放，從而影響周圍或后茬植物的生長(zhǎng)發(fā)育[24]。目前，已在地黃、丹參、人參等藥用植物的組織和根系分泌物中分離出苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸等10多種化感自毒物質(zhì)，這些物質(zhì)通過(guò)影響離子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白質(zhì)和DNA合成以及基因的表達(dá)與調(diào)控等多種途徑來(lái)影響植物生長(zhǎng)[6-7，15]。

化感物質(zhì)不僅對(duì)其他植物甚至自身產(chǎn)生毒害作用，還很容易擴(kuò)散到環(huán)境中，改變根際土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響土壤環(huán)境的微生態(tài)結(jié)構(gòu)。以往對(duì)人參、西洋參、地黃、當(dāng)歸、三七等忌連作藥用植物的研究表明，植物殘茬或根系分泌物均具有不同程度的化感自毒作用，這些化感物質(zhì)或直接對(duì)后茬植物產(chǎn)生影響，或通過(guò)破壞土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)引起植物根際微生態(tài)環(huán)境惡化[16-18]。本課題組前期研究證實(shí)，太子參連作障礙的發(fā)生與化感物質(zhì)介導(dǎo)下根際微生態(tài)環(huán)境惡化相關(guān)[19]。事實(shí)上，形成藥用植物連作障礙的因素間還存在協(xié)同作用，且土壤微生物與化感作用物質(zhì)間存在著拮抗和促進(jìn)作用均已被證實(shí)，有些微生物能通過(guò)改變化感作用物質(zhì)的數(shù)量和種類來(lái)影響化感作用，反之，化感物質(zhì)也同樣能改變土壤微生物區(qū)系[15，20-23]。本課題組前期研究結(jié)果也顯示太子參連作后土壤酸化、pH降低，速效氮、鉀、磷含量降低，微量元素缺失，根際土壤真菌、放線菌、厭氣性纖維素分解菌等致病菌數(shù)量增加，細(xì)菌和好氣性自生固氮菌顯著下降[19]，最終導(dǎo)致土壤微生態(tài)環(huán)境惡化，引起太子參抗性降低、病變、畸形等癥狀。因此，精確鑒別植物化感物質(zhì)，深入研究化感作用，詳細(xì)解讀化感物質(zhì)介導(dǎo)根際微環(huán)境惡化的深層機(jī)制，對(duì)于揭示連作模式下植物-土壤-微生物系統(tǒng)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，消減中藥材和其他作物的連作障礙問(wèn)題具有重要指導(dǎo)意義。

1.3 植物化感物質(zhì)的分離鑒定成為揭示其連作障礙成因的技術(shù)難點(diǎn) 對(duì)化感物質(zhì)進(jìn)行提取分離及鑒定是正確、全面認(rèn)識(shí)化感現(xiàn)象的前提，亦是解讀連作障礙成因，消減連作障礙問(wèn)題的關(guān)鍵所在。基于化感物質(zhì)作用的多種途徑，常采用夾層、常溫吸附、浸提或腐解和疏水性根滲出液連續(xù)收集等方法進(jìn)行提取，后用萃取、樹脂和色譜等方法對(duì)其進(jìn)一步分離純化[25]。現(xiàn)代化學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步為化感物質(zhì)的分離鑒定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，利用氣相色譜（GC）技術(shù)、高效液相色譜（HPLC）技術(shù)和氣相-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、液相-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)研究化感物質(zhì)取得了很大的進(jìn)展，尤其是液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用兩種技術(shù)已成鑒定化感物質(zhì)的主要方法。游佩進(jìn)[26]采用HPLC-MS從連作三七土壤醇提液乙酸乙酯萃取層中鑒定出三七皂苷-G，同時(shí)他還利用 HPLC指紋圖譜比對(duì)法從三七根區(qū)土壤和根中鑒定出一個(gè)共有化合物人參皂苷-Rh1。但由于液質(zhì)聯(lián)用沒(méi)有專業(yè)的圖譜庫(kù)，分析比較困難，氣質(zhì)聯(lián)用是目前公認(rèn)的鑒定能力較強(qiáng)的方法之一[27]。張新慧等[8]采用GC-MS技術(shù)從當(dāng)歸根際土壤中獲得了包括有機(jī)酸、酮、醛、酯和烴類等在內(nèi)的17種化感物質(zhì)。宋宇加[28]采用GC-MS對(duì)種植人參后土壤3種不同極性有機(jī)溶劑提取液進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辛酸是人參產(chǎn)生的重要化感成分之一；2-甲基戊醛、2-甲基-己烯醛、7-十六烯醛、8-十五酮和十三碳酸甲酯有可能是人參所特有的化感物質(zhì)，但尚未進(jìn)一步被辨識(shí)和篩選。然而，GC-MS技術(shù)只能分析熱穩(wěn)定且能氣化的20%左右的有機(jī)物，使得其在化感物質(zhì)分離分析中的應(yīng)用大大受限[29]。

目前，化感物質(zhì)的研究多為從植物中分離到的單體或幾種成分的組合在較高濃度下對(duì)受試植物的生物測(cè)試。這種評(píng)價(jià)方法不能反應(yīng)出自然界的真實(shí)情況，難以客觀體現(xiàn)植物化感作用是多種化感物質(zhì)多途徑、協(xié)同作用的特點(diǎn)。由此，我們認(rèn)識(shí)到探討一條既快又準(zhǔn)鎖定發(fā)揮化感作用的主要物質(zhì)，又能辨識(shí)化感物質(zhì)互作關(guān)系的新途徑，進(jìn)而篩選出目標(biāo)關(guān)鍵物，已成為解讀連作障礙成因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和突破點(diǎn)。

2 目標(biāo)成分“敲出/敲入”的藥效辨識(shí)模式研究的啟示

2.1 目標(biāo)成分“敲出/敲入”的藥效辨識(shí)模式的提出 基于目標(biāo)成分“敲出/敲入”的中藥藥效物質(zhì)辨識(shí)與質(zhì)量控制模式，借鑒“基因診斷治療”策略，強(qiáng)調(diào)中藥的整體性，以中藥“譜-效”關(guān)系為切入點(diǎn)，提出和論證基于目標(biāo)成分敲出/敲入的中藥“譜-效”關(guān)系與“量效”關(guān)系研究模式，以目標(biāo)成分“敲出”研究辨析中藥關(guān)鍵藥效組分及其相互作用關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)質(zhì)控指標(biāo)“找得準(zhǔn)，測(cè)得準(zhǔn)”，是藥效物質(zhì)識(shí)別與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制研究的新突破[30]。目前，已形成的較為成熟的敲出方法有薄層色譜法、液相色譜法、凝膠色譜法及超臨界萃取法等[31-36]。Kong等[37]利用薄層色譜技術(shù)從牛黃中敲出了6種單一或混合組分，進(jìn)一步抗菌實(shí)驗(yàn)研究表明6種組分間存在強(qiáng)烈拮抗作用，拮抗率達(dá)81.13%。李興豐[32]、何靜[36]對(duì)中藥姜黃抗氧化藥效物質(zhì)識(shí)別與質(zhì)量控制研究亦進(jìn)一步證實(shí)“敲出”提取法是研究篩選中藥藥效成分的理想方法，驗(yàn)證了基于目標(biāo)成分“敲出”策略進(jìn)行中藥關(guān)鍵藥效物質(zhì)辨識(shí)具有可行性?；凶饔檬嵌喾N化感物質(zhì)共同作用于生物體的復(fù)雜體系，與復(fù)雜方藥作用于人體的多靶點(diǎn)、多途徑、多效應(yīng)整合調(diào)控模式相吻合。因此，借鑒中藥藥效物質(zhì)的研究方法，對(duì)植物化感物質(zhì)（群）進(jìn)行研究切實(shí)可行。

2.2 中藥藥效辨識(shí)模式研究與化感作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有相似性 迄今，對(duì)化感物質(zhì)的研究或是從植物中得到混合物，但具體起作用的化學(xué)成分，尤其特有的化感物質(zhì)尚不明確；或是以單個(gè)化感物質(zhì)為研究對(duì)象，均忽視了化感物質(zhì)間的相互作用?！敖M分中藥”的提出，在一定程度上將中藥多成分的復(fù)雜性問(wèn)題簡(jiǎn)易化，為闡明植物化感自毒作用物質(zhì)基礎(chǔ)帶來(lái)了契機(jī)[38]。在自然狀態(tài)下，多種來(lái)源的化感物質(zhì)間形成了復(fù)雜有序的互作關(guān)系，這與中藥組分的理念相吻合。這里的“組分”是由一類理化性質(zhì)和藥理活性相似的成分按照一定比例，有機(jī)組合而成的具有完整結(jié)構(gòu)和藥理活性的單位，通過(guò)系統(tǒng)化的篩選方法，得到的可以表達(dá)中藥整體的“中藥組分”[39-40]。當(dāng)然，中藥組分理論的發(fā)展也有其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)和范式，首先它應(yīng)該基于中藥整體性之上，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定可識(shí)別性。其次，中藥組分在組分間存在著復(fù)雜的配伍配比關(guān)系。最后中藥組分應(yīng)是具有完整結(jié)構(gòu)和藥理活性的單元。而基于目標(biāo)成分的“敲出/敲入”策略恰恰吻合了方藥作用的整體性，其目標(biāo)成分的“譜-效”關(guān)系研究始終圍繞方藥整體性開展，“敲出”的目標(biāo)成分是具有完整結(jié)構(gòu)和藥理活性的單元，體現(xiàn)了中醫(yī)藥整體觀、系統(tǒng)觀的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。植物化感物質(zhì)“組分”應(yīng)是具有一定結(jié)構(gòu)的內(nèi)在有序整體，其研究思路主要是通過(guò)結(jié)合自毒試驗(yàn)，篩選出合理的內(nèi)部組分比，進(jìn)而確定其組分結(jié)構(gòu)。因此，基于目標(biāo)成分的“敲出”策略能恰到好處地闡明中藥“組分”的物質(zhì)基礎(chǔ)，而將其用于藥用植物化感自毒作用物質(zhì)的識(shí)別與篩選是切實(shí)可行的。

2.3 目標(biāo)成分“敲出/敲入”的藥效辨識(shí)模式的研究應(yīng)用于化感物質(zhì)篩選切實(shí)可行 當(dāng)前，在中藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等研究領(lǐng)域內(nèi)基于成分敲出/敲入的中藥藥效物質(zhì)辨識(shí)與質(zhì)量控制模式已被廣泛應(yīng)用。例如，孔維軍等[31]通過(guò)敲出策略，初步實(shí)現(xiàn)人工牛黃抗真菌關(guān)鍵藥效物質(zhì)的快速辨識(shí)；張?zhí)鹛餥41]基于組分敲出/敲入的中藥組分辨識(shí)模式，結(jié)合金銀花臨床主要功效選用生物熱力學(xué)抗菌模型和抗腸道病毒EV71的細(xì)胞病變模型為篩選模型對(duì)金銀花關(guān)鍵藥效物質(zhì)進(jìn)行辨識(shí)，又快又準(zhǔn)地確定金銀花抗菌抗病毒關(guān)鍵藥效組分——異綠原酸。

至今，連作障礙問(wèn)題嚴(yán)重影響中藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，作物連作障礙的形成及加重的原因復(fù)雜多樣，各因素之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響，是植物和土壤系統(tǒng)內(nèi)多種因素相互綜合作用的結(jié)果。目前的研究普遍認(rèn)為土壤理化性質(zhì)的改變、微生物種群的變化和植物化感自毒作用是導(dǎo)致藥用植物連作效應(yīng)的主要因素，其中對(duì)于化感物質(zhì)的篩選是解除植物連作障礙的關(guān)鍵[42]。通過(guò)基于目標(biāo)成分“敲出/敲入”的中藥藥效辨識(shí)模式研究方法，對(duì)植物化感物質(zhì)進(jìn)行篩選是借鑒基于成分敲出/敲入的中藥藥效物質(zhì)辨識(shí)與質(zhì)量控制模式而形成的一種新興技術(shù)，能夠?yàn)橛挚煊譁?zhǔn)地鎖定化感物質(zhì)組分、尋找主成份提供具有前瞻性、創(chuàng)新性和實(shí)用性的研究思路和方法體系。

3 展望

借助于其他學(xué)科的新理論新技術(shù)，使研究不斷深入并得以突破?；诖?，明確植物化感自毒物質(zhì)種類及互作關(guān)系是進(jìn)一步揭示植物化感自毒物質(zhì)的生物合成與釋放途徑、探討環(huán)境因子對(duì)植物化感自毒作用影響的基礎(chǔ)，同時(shí)也是探明植物連作障礙成因，解讀其化感自毒作用機(jī)制的關(guān)鍵所在。而探明植物化感物質(zhì)種類首先要搞清植物忌連作如此突出是否與其含有特殊的化感物質(zhì)有關(guān)系。此外，這些化感物質(zhì)中哪些起主要作用，哪些起輔助作用，以及他們的協(xié)同關(guān)系等均不清楚，因此明確其組成、互作方式、量效關(guān)系及化學(xué)生態(tài)學(xué)行為等，對(duì)于進(jìn)一步研究連作介導(dǎo)的根際土壤環(huán)境災(zāi)變機(jī)制與控制新策略具有重要作用，對(duì)于進(jìn)一步揭示生態(tài)環(huán)境中生物體種間及種內(nèi)的復(fù)雜相互關(guān)系具有重大指導(dǎo)意義。

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