王 瑤，潘 超，郭尚旭，那 金，趙 丹,2,*

(1.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500)

?

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HDYM-03亞麻脫膠粗酶液性質(zhì)研究

王 瑤1，潘 超1，郭尚旭1，那 金1，趙 丹1,2,*

(1.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500)

以果膠為單一碳源，對(duì)分離自溫水漚麻液中的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HDYM-03進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn)，探究脫膠酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)。研究表明：該粗酶液中的果膠酶和β-甘露聚糖酶的最適pH值分別為6.0和4.0，最適溫度均為40 ℃，二者在pH值為4.0～6.0和30～40 ℃條件下保存0～60 h時(shí)，果膠酶能保持較高活力。

地衣芽孢桿菌；亞麻；脫膠酶；性質(zhì)

亞麻纖維織物是近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越喜愛(ài)的紡織品之一[1]，作為亞麻纖維生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫膠直接影響生產(chǎn)周期及纖維質(zhì)量[2]。目前國(guó)內(nèi)外亞麻纖維的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過(guò)雨露浸漬和溫水浸漬，此類方法簡(jiǎn)單易行，但漚麻周期長(zhǎng)，嚴(yán)重影響脫膠效率和麻纖維質(zhì)量。為了提高亞麻脫膠的效率、節(jié)約能耗[3]，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者將工作重心轉(zhuǎn)移到酶法脫膠。

酶法脫膠是通過(guò)微生物分泌的胞外酶降解韌皮部中的果膠(Pectin)和半纖維素(Hemicellulose)物質(zhì)[4]，從而獲得純凈纖維。亞麻原莖中的果膠類物質(zhì)主要是原果膠，由半乳糖醛酸等其他糖醛酸聚合物構(gòu)成[5]。果膠酶(Pectinase)是一類能夠不同程度降解果膠類物質(zhì)的多酶復(fù)合物[6]。原果膠在果膠酶的作用下分解為溶于水的果膠酸、丁酸等有機(jī)物，縮短漚麻周期[7]。目前關(guān)于亞麻脫膠的研究多關(guān)注果膠的降解，而忽略了膠質(zhì)中第二大組分半纖維素的去除。甘露聚糖是構(gòu)成亞麻膠質(zhì)的主要半纖維素類物質(zhì)[8]，在脫膠進(jìn)程中β-甘露聚糖酶同樣影響著纖維質(zhì)量。β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC, 3.2.1.78)是能夠降解甘露聚糖為甘露低聚糖及甘露糖的內(nèi)切水解酶在脫膠進(jìn)程中該酶可以輔助果膠酶去除一部分半纖維素的雜質(zhì)，提高纖維質(zhì)量和出麻率[10]。

本實(shí)驗(yàn)室自天然溫水漚麻液中分離得到一株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HDYM-03，該菌可同時(shí)產(chǎn)果膠酶和甘露聚糖酶，將B.licheniformisHDYM-03所產(chǎn)粗酶液應(yīng)用亞麻脫膠中，能夠同時(shí)降解果膠和半纖維素，從而提高脫膠效率[11]。根據(jù)前期工作基礎(chǔ)，本文以果膠為唯一碳源進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn)，探索產(chǎn)脫膠酶粗酶液的溫度及pH值等酶學(xué)性質(zhì)，為B.licheniformisHDYM-03及其粗酶液在亞麻生物脫膠中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

B.licheniformisHDYM-03分離自天然溫水漚麻液[11]，保藏于黑龍江大學(xué)微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試培養(yǎng)基

BP培養(yǎng)基g/L：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5；蒸餾水1 L，pH值7.0，121 ℃滅菌15 min，用于供試菌株活化。

果膠發(fā)酵培養(yǎng)基(PEC)g/L：果膠10，蛋白胨10，NaCl 5；蒸餾水1 L，pH值7.0，121 ℃滅菌15 min，用于發(fā)酵產(chǎn)脫膠酶。

1.3 生化藥品及試劑

果膠(P9135-500G)購(gòu)自Sigma Aldrich公司；魔芋粉購(gòu)自四川成都新星魔芋粉廠；葡萄糖、D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

根據(jù)高廣恒等[12]的方法配置3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)試劑，用于果膠酶和β-甘露聚糖酶活力測(cè)定，作用底物分別為0.25%果膠和0.5%魔芋粉。

1.4 菌株活化

將B.licheniformisHDYM-03單菌落接種于100 mL/250 mL BP培養(yǎng)基中，37 ℃，140 r/min，培養(yǎng)18 h。

1.5 脫膠粗酶液制備

將活化好的B.licheniformisHDYM-03的細(xì)胞濃度調(diào)至1×107CFU/mL，以2%的接種量接種于300 mL/500 mL PEC培養(yǎng)基中，37 ℃，140 r/min搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)產(chǎn)酶。取48 h發(fā)酵液4 000 g離心10 min，所得上清液即為脫膠粗酶液[13]。

1. 6 脫膠粗酶液性質(zhì)分析

1.6.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

分別在20、30、35、40、45和50 ℃條件下，對(duì)B.licheniformisHDYM-03脫膠粗酶液進(jìn)行最適反應(yīng)溫度試驗(yàn)；將粗酶液分別置于30、35和40 ℃的條件下保溫0～60 h，每12 h取樣測(cè)果膠酶和β-甘露聚糖酶活力，觀察粗酶液在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.6.2 最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性

分別在pH為4.0、5.0、6.0和7.0條件下，進(jìn)行B.licheniformisHDYM-03粗酶液最適反應(yīng)pH值試驗(yàn)；將粗酶液分別置于pH 4.0、5.0和6.0的條件下保溫0～60 h，每12 h取樣測(cè)果膠酶和β-甘露聚糖酶活力，觀察粗酶液在不同pH值條件下的穩(wěn)定性。

1.7 果膠酶活力測(cè)定

將0.5 mL粗酶液和0.5 mL 0.25%果膠底物溶液加入到25 mL比色管中，50 ℃水浴30 min，加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，定容至20 mL，測(cè)OD540nm值。對(duì)照是以先加入粗酶液，沸水浴5 min，再加底物溶液，同樣水浴30 min調(diào)零。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖的含量，根據(jù)葡萄糖轉(zhuǎn)化成半乳糖醛酸的量，計(jì)算酶活力。即在50 ℃條件下，每小時(shí)內(nèi)每毫升果膠酶催化果膠生成1 μg還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位U[14]。

半乳糖醛酸的量：

μg/mL=X×1 000×194/180

式中X為葡萄糖的量；果膠酶活力=X×1 000×194×2/180。

1.8 β-甘露聚糖酶活力測(cè)定

將0.1 mL粗酶液和0.9 mL 0.5%除去還原糖的魔芋粉溶液加入到25 mL比色管中，55 ℃水浴30 min。加入3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，定容至25 mL，測(cè)OD540nm值[15]。對(duì)照是以先加入粗酶液，沸水浴5 min，再加底物溶液，同樣水浴30 min調(diào)零。以D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甘露糖量[16]。按照下式計(jì)算β-甘露聚糖酶活力。即在55 ℃條件下，每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol甘露糖的酶量計(jì)為一個(gè)酶活力單位U。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖及D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 pH值及溫度對(duì)B.licheniformis HDYM-03粗酶液果膠酶活性的影響Fig.1 Effect of pH value and temperature on pectinase in crude enzyme of B.licheniformis HDYM-03

參考王俊麗[17]和劉忠義等[18]的方法分別繪制葡萄糖及D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.75x-0.057，R2=0.999；甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.509 2x-0.052 4，R2=0.997，分別用于果膠酶和β-甘露聚糖酶活力計(jì)算。

2.2B.licheniformisHDYM-03粗酶液果膠酶性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)溫度和pH值

如圖1所示，B.licheniformisHDYM-03果膠酶隨著pH值升高酶活力逐漸上升，當(dāng)pH值為6.0時(shí)酶活力最高，達(dá)到157.93±0.13 U/mL，為該酶最適反應(yīng)pH值。之后，隨著pH值的增加，相對(duì)酶活逐漸下降，最終穩(wěn)定在41%左右。B.licheniformisHDYM-03果膠酶活力隨溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在40 ℃時(shí)果膠酶相對(duì)酶活最高，達(dá)到136.59±3.12 U/mL，為該酶最適反應(yīng)溫度。

2.2.2 溫度和pH值穩(wěn)定性

果膠酶在不同pH值的緩沖液中保存0～60 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)酶活逐漸下降，但在pH=6.0條件下保存60 h后酶活仍能保留90%以上，達(dá)到132.48±1.78 U/mL，穩(wěn)定性最好(圖2)。而在pH=5.0緩沖液保存60 h時(shí)酶活為88.32±2.62 U/mL，為初始活力的87%，穩(wěn)定性較好。

圖2 B.licheniformis HDYM-03粗酶液果膠酶pH值穩(wěn)定性Fig.2 Stability of pH value of pectinase in crude enzyme of B.licheniformis HDYM-03

圖3 B.licheniformis HDYM-03粗酶液果膠酶溫度穩(wěn)定性Fig.3 Stability of temperature of pectinase in crude enzyme of B.licheniformis HDYM003

B.licheniformisHDYM-03果膠酶隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)酶活逐漸升高見(jiàn)圖3，將30 ℃的初始酶活視為100%，在35℃條件下相對(duì)酶活最高，36 h果膠酶活力最高可達(dá)76.54±7.14 U/mL。而目前的研究中，亞麻脫膠應(yīng)用純酶和粗酶中的果膠酶多呈堿性，Kashyap[19]等從土壤中分離得到一株產(chǎn)果膠裂解酶的Bacillus sp. DT7，通過(guò)優(yōu)化其培養(yǎng)條件并得到純化酶，該酶最適反應(yīng)溫度及最適反應(yīng)pH值分別為60 ℃、8.0。

2.3B.licheniformisHDYM-03粗酶液β-甘露聚糖酶性質(zhì)

2.3.1 最適反應(yīng)溫度及pH值

圖4 pH值及溫度對(duì)B.licheniformis HDYM-03粗酶液β-甘露聚糖酶的影響Fig.4 Effect of pH value and temperature on β-mannanese in crude enzyme of B.licheniformis HDYM-03

β-甘露聚糖酶隨pH值的升高酶活力逐漸下降(圖4)，當(dāng)pH值為4.0時(shí)酶活力最高，達(dá)到112.01±3.6 U/mL，為該酶最適反應(yīng)pH值。此外，該酶隨溫度的升高酶活力先升高后降低， 40 ℃時(shí)酶活力最高，達(dá)到67.71±1.74 U/mL，為該酶最適反應(yīng)溫度。

2.3.2 溫度和pH值穩(wěn)定性

β-甘露聚糖酶隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)酶活逐漸增大，以0 h的酶活為100%，在pH值為 5.0時(shí)相對(duì)酶活力較高，穩(wěn)定性最好，達(dá)到73.60±1.32 U/mL(圖5)。在該條件下保存0～60 h，β-甘露聚糖酶在pH=4.0～6.0條件下酶活力依然維持初始活力的70%以上。

由圖6可見(jiàn)，β-甘露聚糖酶的相對(duì)酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，以0 h的酶活為100%，其中35 ℃對(duì)該酶作用效果最明顯，在36 h相對(duì)酶活力最高，達(dá)到85.37±3.91 U/mL，是初始活力的1.78倍。Guo[20]等以一株Bacillus sp. Y1為作為出發(fā)菌株，以果膠為底物誘導(dǎo)該菌產(chǎn)脫膠酶，該粗酶液在pH=7～10條件下酶活力穩(wěn)定，且最適反應(yīng)pH值為9。

圖5 B.licheniformis HDYM-03粗酶液β-甘露聚糖酶pH值穩(wěn)定性Fig.5 Stability of pH value of β-mannanese in crude enzyme of B.licheniformis HDYM-03

圖6 B.licheniformis HDYM-03粗酶液β-甘露聚糖酶溫度穩(wěn)定性Fig.6 Stability of temperature of β-mannanese in crude enzyme of B.licheniformis HDYM-03

3 結(jié) 論

本文對(duì)B.licheniformisHDYM-03脫膠粗酶液性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該粗酶中的果膠酶和β-甘露聚糖酶在中性偏酸性的條件下酶活力較高且相對(duì)穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)比酶性質(zhì)上的差異，本粗酶液更具脫膠優(yōu)勢(shì)，原因在于漚麻過(guò)程pH值由大到小，pH值的變化趨勢(shì)能夠確保粗酶液中脫膠酶活力的穩(wěn)定，進(jìn)一步保證了酶法脫膠高效、快速的進(jìn)行。粗酶液中的β-甘露聚糖酶同樣在pH=4～5間酶活力最大，與果膠酶協(xié)同脫膠。本研究著重于B.licheniformisHDYM-03脫膠粗酶液的溫度及pH值等性質(zhì)，這些性質(zhì)對(duì)B.licheniformisHDYM-03應(yīng)用于亞麻脫膠有一定的參考價(jià)值，為更好地開發(fā)利用亞麻脫膠酶資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

[10] Liu P, Zhao D, Pan C, et al. The Components and activities of flax-degumming enzymes produced byBacilluslicheniformisHDYM-03 [J]. Advanced Materials Research, 2014,1004-1005: 566-571.

[11] 平文祥, 葛菁萍, 趙丹, 等. 漚麻系統(tǒng)中一株甘露聚糖酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 [J]. 黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 25(6): 784-789.

[12] 高廣恒, 周萬(wàn)里, 朱思榮, 等. 基于DNS原理的還原糖測(cè)定儀 [J]. 山東科學(xué), 2012, 25(3): 95-97.

[13] 康立新, 周玉玲, 馬立新. 酶法制備甘露低聚糖 [J]. 食品科技, 2012, 37(7): 237-239.

[14] 張健紅, 李寅, 劉和, 等. 一株堿性果膠酶高產(chǎn)細(xì)菌的分離、系統(tǒng)發(fā)育分析和產(chǎn)酶條件的初步優(yōu)化 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2005, 11(3): 354-358.

[15] Hayrunnisa N, Ahmet A, Gulsah A. Purification and characterisation of β-mannanase fromLactobacillusplantarum(M24) and its applications in some fruit juices [J]. International Journal of Food Science & Technology, 2015, 50(5): 1158-1165.

[16] 鄒業(yè)霞, 林金鐘, 卜雪梅, 等. 短小芽孢桿菌β-1,4-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在干酪乳桿菌中的表達(dá) [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2015, 55(12): 1576-1583.

[17] 王俊麗, 聶國(guó)興, 李素貞, 等. DNS 法測(cè)定還原糖含量時(shí)最適波長(zhǎng)的確定 [J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 4: 115-118.

[18] 劉忠義, 歐昌榮, 湯海青, 等. 3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定葡萄酒中總糖含量的條件優(yōu)化 [J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2013, 27(11): 1717-1723.

[19] Kashyap D R, Chandra S, Kaul A, et al. Production, purification and characterization of pectinase from aBacillussp. DT7 [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2000, 16(3): 277-282.

[20] Guo F, Zou M, Li X, et al. An effective degumming enzyme fromBacillussp. Y1 and synergistic action of hydrogen peroxide and protease on enzymatic degumming of ramie fibers [J]. BioMed research International, 2013, 2013: 212-215.

Research on properties of crude enzyme of flax degumming byBacilluslicheniformisHDYM-03

WANG Yao1, PAN Chao1, GUO Shang-Xu1, NA Jin1, ZHAO Dan1,2,*

(1.KeyLaboratoryofMicrobiology,LifeScienceCollege,HeilongjiangUniversity,Harbin150080,China;2.EngineeringResearchCenterofAgriculturalMicrobiologyTechnology,MinistryofEducation,HeilongjiangUniversity,Harbin150500,China)

BacilluslicheniformisHDYM-03 which was isolated from water retting liquid was used in enzymatic fermentation, and the sole carbon source was pectin which was used as the enzymatic properties of the degummed enzyme. The results showed that the optimal pH of the crude enzyme pectinase and β-mannanase were 6.0 and 4.0 respectively, the optimum temperature both were at 40 ℃, as well as the pectinase could maintain high activity under the conditions of pH 4.0～6.0 for 0～60 h, the degummase can be existed stablely during 30～40 ℃.

Bacilluslicheniformis; flax; degummase; property

10.13524/j.2095-008x.2017.01.009

2017-02-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270534)；哈爾濱市科技局青年后備人才項(xiàng)目(2014RFQXJ101)；黑龍江大學(xué)杰出青年基金項(xiàng)目(JCL201305)；黑龍江省政府博士后項(xiàng)目( LBH-Z15214)

王 瑤(1991-)，女，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，研究方向：微生物生態(tài)學(xué),E-mail：wangyao3205@163.com;*通訊作者：趙 丹(1980-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：微生物生態(tài)學(xué),E-mail：zhaodan4u@163.com。

TS102.221;Q814.9

A

2095-008X(2017)01-0054-06