郝靜梅，盛冉，孫志高*，黃巧娟，于奉生，方明

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712) 2(廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州，510663)

檸檬烯抗菌性研究進(jìn)展

郝靜梅1，盛冉1，孫志高1*，黃巧娟2，于奉生1，方明1

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712) 2(廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州，510663)

檸檬烯(limonene)是廣泛存在于植物中的一種天然單萜烯，是自然界除蒎烯外分布最廣的萜烯，具有抗菌、消炎和抗腫瘤等多種生物功能。當(dāng)前食品衛(wèi)生和醫(yī)藥安全等問(wèn)題越來(lái)越引起公眾的重視，研究天然的抗菌保鮮劑已成為研究的熱點(diǎn)。此文綜述了近年來(lái)檸檬烯對(duì)微生物的抑制作用、作用機(jī)理、應(yīng)用及發(fā)展趨勢(shì)，以期為安全、高效的天然食品防腐保鮮劑的開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

檸檬烯；抗菌；作用機(jī)制；應(yīng)用

檸檬烯又稱苧烯，學(xué)名1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯，是一種重要的單環(huán)單萜烯，廣泛存在于柑橘、蔬菜等植物中，尤其在柑橘類水果的精油中含量較多，如在甜橙果皮精油中其含量高達(dá)90%～95%[1-3]。天然檸檬烯以3種異構(gòu)體的形式存在于植物精油中，即D-檸檬烯、L-檸檬烯和DL-檸檬烯，其中D-檸檬烯最為常見。由于檸檬烯具有抗菌、抗氧化、抗癌、止咳平喘和抗炎等生理功能，已被廣泛應(yīng)用于食品、香料、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域[4]。

隨著人們安全意識(shí)的日益增加，食品安全問(wèn)題是食品行業(yè)最關(guān)心的問(wèn)題，研究證實(shí)真菌和細(xì)菌是引起食品腐敗變質(zhì)的重要因素[5]?；瘜W(xué)類食品防腐劑如山梨酸、苯甲酸、丙酸及其鹽類等因抑菌性強(qiáng)、使用成本低等特點(diǎn)，在食品行業(yè)應(yīng)用廣泛，但由于這些防腐劑溶解性低、安全性差及致癌性等問(wèn)題，也越來(lái)越顯示出局限性[6]。近年的相關(guān)研究表明，植物類的天然抗菌性成分可替代化學(xué)防腐劑來(lái)防止食品的腐敗變質(zhì)，如中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB2760—2011 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn))規(guī)定D-檸檬烯即為允許使用的香料[7]，同時(shí)檸檬烯也因來(lái)源廣泛、安全性好和抗菌性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。

1 檸檬烯的抗菌特性

檸檬烯具有廣譜抗菌性，可顯著抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌及真菌的活性[8]。檸檬烯的抗菌強(qiáng)度與檸檬烯的濃度、菌株種類、作用形式、pH值、溫度、作用時(shí)間和試驗(yàn)方法等多因素有關(guān)，同時(shí)檸檬烯的易揮發(fā)性、疏水性及是否添加表面活性劑等均會(huì)導(dǎo)致抑菌結(jié)果的差異性[8]。

1.1 檸檬烯抑制細(xì)菌

食品在加工及貯藏過(guò)程中容易受到金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌和枯草芽孢桿菌等細(xì)菌的污染，近年來(lái)通過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)檸檬烯的抗菌性研究證實(shí)，檸檬烯對(duì)這些細(xì)菌均有較好的抑制作用，詳見表1。

1970年，DABBAH等[9]研究了橙、檸檬及葡萄柚的除萜精油、D-檸檬烯、香葉醇等在體外對(duì)山夫登堡沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和假單胞菌屬的抑制作用，結(jié)果表明D-檸檬烯對(duì)這4種菌的抑制率為86%～100%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)已放置4年的D-檸檬烯比新產(chǎn)檸檬烯對(duì)山夫登堡沙門氏菌的抑制性更強(qiáng)，抑制率高達(dá)100%，這是因?yàn)闄幟氏┭趸闪藱幟氏┭趸?，它?duì)山夫登堡沙門氏菌具有更強(qiáng)抑制作用。2008年，O′Bryan CA[12]等研究證實(shí)D-檸檬烯對(duì)試驗(yàn)用11種沙門氏菌均有抑制作用，其最小抑菌體積分?jǐn)?shù)為1%。LIS-BALCHIN等[15]研究了檸檬烯的2種對(duì)映體在體外對(duì)20種單細(xì)胞增生李斯特菌的抗菌性，結(jié)果表明(+)-檸檬烯具有更強(qiáng)的抑菌活性，這兩種檸檬烯對(duì)映體的抗菌性強(qiáng)弱差異是因所作用的菌種不同所致。

表1 檸檬烯對(duì)細(xì)菌的抑制作用

1.2 檸檬烯抑制真菌

近年來(lái)研究表明檸檬烯和含有檸檬烯的精油均具有抗菌性，且能抑制多種真菌(如表2所示)，但研究表明D-檸檬烯對(duì)真菌的抑制作用比精油更強(qiáng)。2011年，MAHDAVI等[11]采用瓊脂擴(kuò)散法和紙片擴(kuò)散法研究了檸檬烯和果皮提取物對(duì)黑曲霉菌、黃曲霉菌及青霉菌等的抑制作用，結(jié)果表明左旋檸檬烯比右旋檸檬烯的抑菌性強(qiáng)，檸檬烯對(duì)受試菌均有顯著的抑制作用，尤其對(duì)黑曲霉菌的抑制作用更為明顯，而柑橘香精油對(duì)受試菌沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑菌性。2012年李巧巧等[12]研究了D-檸檬烯及柑橘精油對(duì)酵母、毛霉和青霉等的抑菌性，將浸透精油或檸檬烯的濾紙片放置于已干燥的培養(yǎng)基表面，在合適的條件下培養(yǎng)，結(jié)果表明抑菌由強(qiáng)到弱依次為D-檸檬烯、檸檬油、柚油、橙油；將浸透精油或檸檬烯的濾紙片放在培養(yǎng)皿的皿蓋中心，并倒置培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，只有D-檸檬烯能對(duì)酵母、青霉形成抑菌圈。SINGH等[16]研究了柑橘香精油及其主要成分檸檬烯的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)檸檬烯對(duì)黃曲霉的抑制性比香精油更強(qiáng)，即使在很低濃度下仍然具有很好的抑制效果，詳見表2所示。

表2 檸檬烯及含檸檬烯的香精油對(duì)真菌的抑制作用

2 檸檬烯抗菌機(jī)理

近年來(lái)，大量文獻(xiàn)證實(shí)檸檬烯具有廣譜的抗菌性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黃曲霉等細(xì)菌和真菌均具有抑制作用[1-26]。然而到目前為止檸檬烯的抗菌機(jī)理尚未獲得明確結(jié)論，但研究者普遍認(rèn)可，通過(guò)破壞菌體細(xì)胞膜的完整性，從而抑制微生物生長(zhǎng)是檸檬烯的主要抗菌機(jī)制。綜合文獻(xiàn)報(bào)道檸檬烯的抗菌機(jī)理主要為以下幾方面。

2.1 破壞微生物的生物膜

檸檬烯作用于菌體的細(xì)胞壁或生物膜系統(tǒng)，進(jìn)而破壞其完整性，改變細(xì)胞膜的滲透性，使內(nèi)容物外泄，降低其生物活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)繁殖，甚至死亡。

1989年KNOBLOCH等研究證實(shí)精油中的生物活性成分可滲透細(xì)胞的細(xì)胞壁，溶解細(xì)胞膜磷脂的雙分子層發(fā)揮其抗菌性[26]。2006年 ROSANGELA等[27-28]研究了檸檬烯、肉桂醛、丁香酚和香芹酚等物質(zhì)在亞致死濃度條件下對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、熒光假單胞菌和嗜熱甲烷八聯(lián)球菌細(xì)胞膜的影響，經(jīng)過(guò)掃描電鏡觀察到，檸檬烯等物質(zhì)作用于受試菌后，能引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的明顯變化；通過(guò)氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，受試菌的細(xì)胞膜中其不飽和脂肪酸的含量明顯減少，其中C18∶2反式脂肪酸和C18∶3的順式脂肪酸大幅度減少，也直接導(dǎo)致細(xì)胞膜總脂肪酸含量的減少，進(jìn)而發(fā)揮出檸檬烯的抗菌作用。2014年TAO等研究了檸檬烯、檸檬醛等單萜類化合物對(duì)青霉和綠霉的抑制作用，通過(guò)電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，處理組的霉菌形狀發(fā)生了明顯的扭曲和體積變小，且細(xì)胞外電導(dǎo)率和pH值也發(fā)生了變化，這表明檸檬烯破壞了霉菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，降低了其生物活性、進(jìn)而阻礙了霉菌細(xì)胞的生長(zhǎng)[29]。胡菲菲[30]通過(guò)對(duì)釀酒酵母耐受D-檸檬烯脅迫的蛋白組分的分析，認(rèn)為D-檸檬烯破壞了釀酒酵母的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂筏受損，直接破壞了釀酒細(xì)胞膜的信號(hào)傳遞和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。ESPINA等[31-35]研究了D-檸檬烯對(duì)大腸桿菌、單細(xì)胞增生李斯特菌等的抑菌作用與機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在pH值為4.0時(shí)D-檸檬烯可破壞微生物的細(xì)胞膜，暴露出細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)膜增加了細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致因內(nèi)容物泄漏而破壞細(xì)胞正常的生理功能，從而現(xiàn)實(shí)抑菌。

2.2 影響微生物的能量代謝

生命活動(dòng)都是耗能反應(yīng)，能量代謝是維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，能量代謝異常或中斷可引起生命活動(dòng)的停止。檸檬烯可通過(guò)干擾菌體內(nèi)正常的酶促反應(yīng)和能量代謝，從而打破微生物的代謝平衡。KNOBLOCH等[26]研究了萜類物質(zhì)對(duì)微生物的初生能量代謝、NADH活性以及呼吸過(guò)程中電子傳遞過(guò)程等作用，結(jié)果表明檸檬烯濃度在5×10-3mol/L時(shí)就可起到抑制作用，干擾細(xì)胞內(nèi)能量代謝的酶促反應(yīng)，并通過(guò)溶解油脂影響生物膜的催化反應(yīng)，如呼吸代謝途徑等。胡菲菲[30]在研究釀酒酵母耐受D-檸檬烯脅迫的蛋白組學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在D-檸檬烯的脅迫下釀酒酵母對(duì)能量的需求增加，出現(xiàn)葡萄糖饑渴的假象。

2.3 破壞微生物DNA的結(jié)構(gòu)或改變其功能

DNA作為生物遺傳信息的載體，在細(xì)胞物質(zhì)合成和遺傳代謝過(guò)程中起到十分重要的作用。DNA的微小損傷都會(huì)影響微生物的正常代謝和繁殖。檸檬烯能破壞DNA結(jié)構(gòu)、抑制基因的正常表達(dá)，進(jìn)而影響微生物正常的生長(zhǎng)代謝。胡菲菲[30]研究發(fā)現(xiàn)，D-檸檬烯能脅迫下調(diào)釀酒酵母細(xì)胞中具有DNA修復(fù)功能的Rp4p和調(diào)控細(xì)胞增殖分裂功能的Cprlp，從而抑制細(xì)胞增殖。

2.4 抑制微生物體內(nèi)的酶或功能蛋白

MAREI等[36]研究了包括檸檬烯在內(nèi)的12種物質(zhì)抗真菌活性，以及檸檬烯對(duì)受試菌的果膠甲酯酶、纖維素酶和多酚氧化酶的抑制作用。其結(jié)果表明，檸檬烯對(duì)果膠甲酯酶和纖維素酶有強(qiáng)烈的抑制作用，而對(duì)多酚氧化酶沒(méi)有抑制作用，認(rèn)為檸檬烯等單萜類物質(zhì)抑制了纖維素酶和果膠甲酯酶的活性，延緩或終止了微生物的化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生抗菌作用。

3 檸檬烯抗菌性的應(yīng)用

檸檬烯具有資源豐富、來(lái)源廣泛、天然安全等優(yōu)勢(shì)，已在食品、果蔬的防腐保鮮等領(lǐng)域得到了很好應(yīng)用。李巧巧等[12]對(duì)D-檸檬烯的抗菌性在面包上的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果證實(shí)D-檸檬烯在氣體狀態(tài)下能有效抑制那些能導(dǎo)致面包腐敗的酵母和青霉菌，能對(duì)面包起到較好的防腐保鮮作用。高紅亮等[37]研究了檸檬烯乳化及其在橙汁中的保鮮效果，發(fā)現(xiàn)濃度不低于0.5 g/L的檸檬烯乳化液就能對(duì)橙汁起到顯著的保鮮效果，其細(xì)菌總數(shù)、pH值變化及感官品質(zhì)等指標(biāo)均明顯優(yōu)于對(duì)照組。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，從柑橘皮渣中提取的檸檬烯具有廣譜的抑菌性，能有效抑制微生物的生長(zhǎng)及預(yù)防食品腐敗變質(zhì)，可部分替代化學(xué)抗菌劑。但檸檬烯作為新型抑菌劑還有待進(jìn)一步研究。一方面，關(guān)于檸檬烯的抑菌性研究大多數(shù)都集中在離體試驗(yàn)，而活體試驗(yàn)很少，研究結(jié)果的科學(xué)性、廣譜性等也受此局限，不利于檸檬烯的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用；另一方面，目前檸檬烯的抑菌性研究還處于初步階段，對(duì)檸檬烯的抑菌機(jī)理研究尚不十分準(zhǔn)確。此外，檸檬烯的應(yīng)用技術(shù)研究及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)也很少。因此，作者認(rèn)為，今后應(yīng)系統(tǒng)、深入研究檸檬烯在活體中的抑菌效果、進(jìn)一步明確檸檬烯的抑菌機(jī)理，同時(shí)加大開發(fā)適應(yīng)市場(chǎng)發(fā)展方向和需求的檸檬烯相關(guān)新產(chǎn)品。

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Research progress in antimicrobial activity of limonene

HAO Jing-mei1, SHENG Ran1, SUN Zhi-gao1*, HUANG Qiao-juan2,YU Feng-sheng1, FANG Ming1

1(Southwest University,Citrus Research Institute, Chongqing 400712,China)2(Guangdong Food and Drug Vocational-technical School,Guangzhou 510663,China)

Limonene is one of the most widely distributed terpenes in nature except pinene, and it has many bioactivities such as antibacterial activity, anti-inflammatory activity, and anti-tumor activity. Currently,food hygiene and medical safety have attracted more and more public attention. Studies on natural biopreservatives have become the focus of multidisciplinary research. The antifungal activity of limonene, its action mechanism, its application and development trend were reviewed in this paper to provide a theoretical reference for the development and application of natural food preservatives.

limonene; antibacterial; mechanism of action; application

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702046

碩士研究生(孫志高副研究員為通訊作者，E-mail: cpro@cric.cn)。

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2014NZ0062)

2016-08-18，改回日期：2016-10-31